Zirkulierende Tumorzelllinien: ein innovatives Werkzeug für die Grundlagen- und Translationsforschung

Zusammenfassung

Die Kultivierung von CTCs ermöglicht eine tiefere funktionelle Charakterisierung von Krebs, unter anderem durch die Untersuchung der spezifischen Markerexpression und die Bewertung der Arzneimittelresistenz und der Fähigkeit, die Leber zu besiedeln. Insgesamt könnte die CTC-Kultur ein vielversprechendes klinisches Werkzeug für die personalisierte Medizin sein, um das Patientenergebnis zu verbessern.

Zusammenfassung

Metastasierung ist eine der Hauptursachen für Krebstod. Trotz Verbesserungen der Behandlungsstrategien hat metastasierender Krebs eine schlechte Prognose. Wir stehen daher vor der dringenden Notwendigkeit, die Mechanismen hinter der Metastasenentwicklung zu verstehen und somit effiziente Behandlungen für fortgeschrittenen Krebs vorzuschlagen. Metastasierende Krebsarten sind schwer zu behandeln, da Biopsien invasiv und unzugänglich sind. In jüngster Zeit besteht ein erhebliches Interesse an Flüssigbiopsien, die sowohl zellfreie zirkulierende Desoxyribonukleinsäure (DNA) als auch zirkulierende Tumorzellen aus peripherem Blut umfassen, und wir haben mehrere zirkulierende Tumorzelllinien von patienten mit metastasierendem Dickdarmkrebs etabliert, um an ihrer Charakterisierung teilzunehmen. Um diese seltenen und schlecht beschriebenen Zellen funktionell zu charakterisieren, besteht der entscheidende Schritt darin, sie zu erweitern. Einmal etabliert, können zirkulierende Tumorzelllinien (CTC) dann in Suspensions- oder Adhärenzbedingungen kultiviert werden. Auf molekularer Ebene können CTC-Linien weiter verwendet werden, um die Expression spezifischer Marker von Interesse (wie Differenzierungs-, Epithel- oder Krebsstammzellen) durch Immunfluoreszenz- oder Zytometrieanalyse zu bewerten. Darüber hinaus können CTC-Linien verwendet werden, um die Arzneimittelempfindlichkeit gegenüber Goldstandard-Chemotherapien sowie gegenüber zielgerichteten Therapien zu beurteilen. Die Fähigkeit von CTC-Linien, Tumore zu initiieren, kann auch durch subkutane Injektion von CTCs in immundefiziente Mäuse getestet werden.

Schließlich ist es möglich, die Rolle spezifischer Gene von Interesse zu testen, die an der Krebsverbreitung beteiligt sein könnten, indem CTC-Gene, kurzhaarige Ribonukleinsäure (shRNA) oder Crispr/Cas9 bearbeitet werden. Modifizierte CTCs können somit in immundefiziente Mausmilzen injiziert werden, um einen Teil des metastatischen Entwicklungsprozesses in vivoexperimentell nachzuahmen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CTC-Linien ein wertvolles Werkzeug für die zukünftige Forschung und für die personalisierte Medizin sind, wo sie eine Vorhersage der Behandlungseffizienz mit genau den Zellen ermöglichen, die ursprünglich für die Metastasierung verantwortlich sind.

Einleitung

Trotz jüngster Verbesserungen in der Krebsfrüherkennung und in der therapeutischen Strategie sind immer noch mehr als neunzig Prozent der Krebsmorbidität auf Metastasen zurückzuführen¹. Der metastatische Prozess ist eine mehrstufige Kaskade, die mit der lokalen Ablösung von Zellen aus dem Primärtumor und ihrem Eintritt in den Blutkreislauf beginnt, wo sie zu zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) werden, um schließlich entfernte Stellen wie Leber und Lunge zu besiedeln, im Falle von Darmkrebs (CRC)². In letzter Zeit wächst die Aufmerksamkeit für Flüssigbiopsien, die ein nicht-invasives Werkzeug sind, um INSbesondere CTCs aus ....

Protokoll

Alle In-vivo-Protokolle wurden von den Tierethikbehörden genehmigt.

1. CTC-Amplifikation unter 3D-Kulturbedingungen

1. Um CTCs in Suspension zu kultivieren, säen sie zuerst CTCs in Vertiefungen einer Ultra-Low Attachment (ULA) 24-Well-Platte bei der maximalen Konzentration von 5 Zellen / μL und in 1 ml M12-Medium (dh fortgeschrittenes DMEM-F12, ergänzt mit 2 mM l-Glutamin, 100 Einheit / ml Penicillin und Streptomycin, N2-Ergänzung, 20 ng / ml epidermalem Wachstumsfaktor und 10 ng / ml Fibroblastenwachstumsfaktor¹⁰).
2. Um die Kugelbildung und Zellexpansion zu ermöglichen, inkubieren Sie....

Ergebnisse

Sowohl EpCAM- als auch CD26-Expressionen, die von IF(Abbildung 1A rechtes Panel)bzw. FACS(Abbildung 1B)beobachtet wurden, deuten darauf hin, dass die CTC-Linie epithelial ist und eines der CSC-Kennzeichen¹⁰aufweist. Dieses epitheliale Merkmal kann durch Färbung mit Antikörpern, die gegen andere epitheliale und mesenchymale Marker gerichtet sind, weiter charakterisiert werden. Dadurch könnte es möglich sein, ungefähr zu wi.......

Diskussion

Das oben beschriebene Protokoll wurde ursprünglich für die funktionelle Charakterisierung der kolorektalen CTC verwendet, kann jedoch für andere Krebsarten wie Brustkrebs verwendet und für Mausmodelle angepasst werden.

Der wirklich limitierende Faktor ist die Anzahl der in der Blutprobe vorhandenen CTCs und die Effizienz der Technik, mit der sie isoliert und expandiert werden. Mehrere CTC-Isolationstechniken wurden auf der Grundlage spezifischer CTC-Eigenschaften beschrieben, wie z.B. parsorti.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Accumax-Lösung	Sigma-Aldrich	A7089
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634028
CellTiter-Glo Lumineszierender Zellviabilitätsassay	Promega	G7570
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basalmembran-Matrix	Corning	354230
Costar 24-Well, klarer flacher Boden, ultra-geringe Bindung Mehrere Well Plates,Corning		3473
Histiogel Probe Medium	LabStorage	HG-4000
Human EGF, Premium-Qualität	Miltenyi Biotec	130-097-751
Human FGF-2, Premium-Qualität	Miltenyi Biotec	130-093-564
L-Glutamin (200 mM)	Gibco	25030081
N-2 Ergänzung	Gibco
Penicillin-Streptomycin (5.000 U/ml)	Gibco	15070063