Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur nicht-invasiven Verfolgung von T-Zellen, die genetisch so verändert wurden, dass sie chimäre Antigenrezeptoren in vivo mit einer klinisch verfügbaren Plattform exprimieren.
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Methodenartikel
Dynamische Bildgebung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen mit [18F]Tetrafluoroborat-Positronen-Emissions-Tomographie/Computertomographie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
T-Zellen, die gentechnisch verändert wurden, um chimäre Antigenrezeptoren (CAR) zu exprimieren, haben in zulassungsrelevanten klinischen Studien für Patienten mit B-Zell-Malignomen oder multiplem Myelom (MM) beispiellose Ergebnisse gezeigt. Zahlreiche Hindernisse schränken jedoch die Wirksamkeit ein und verbieten den weit verbreiteten Einsatz von CAR-T-Zelltherapien aufgrund des schlechten Handels und der Infiltration in Tumorstellen sowie der mangelnden Persistenz in vivo. Darüber hinaus sind lebensbedrohliche Toxizitäten wie das Zytokinfreisetzungssyndrom oder die Neurotoxizität ein großes Problem. Effiziente und empfindliche Bildgebung und Verfolgung von CAR-T-Zellen ermöglicht die Bewertung des Transports, der Expansion und der In-vivo-Charakterisierung von T-Zellen und ermöglicht die Entwicklung von Strategien zur Überwindung der derzeitigen Einschränkungen der CAR-T-Zelltherapie. Dieses Papier beschreibt die Methodik für den Einbau des Natriumiodid-Symporters (NIS) in CAR-T-Zellen und für die CAR-T-Zellbildgebung mittels [18F]tetrafluoroborat-Positronen-Emissionstomographie ([18F]TFB-PET) in präklinischen Modellen. Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden können zusätzlich zu den für diese Studie verwendeten auf andere CAR-Konstrukte und Zielgene angewendet werden.
Einleitung
Die Chimeric Antigen Receptor T (CAR T) Zelltherapie ist ein sich schnell entwickelnder und potenziell heilender Ansatz bei hämatologischen Malignomen1,2,3,4,5,6. Außergewöhnliche klinische Ergebnisse wurden nach CD19-gerichteter CAR T (CART19) oder B-Zellreifungsantigen (BCMA) CAR T-Zelltherapie2 berichtet. Dies führte zur Zulassung von CART19-Zellen für aggressive B-Zell-Lymphome (Axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, Tisagen....
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Protokoll
Das Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Review Board der Imsengco Clinic, des Institutional Biosafety Committee und des Institutional Animal Care and Use Committee der Imsengco Clinic.
1. NIS+ BCMA-CAR T-Zell-Produktion
HINWEIS: Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Review Board (IRB 17-008762) und des Institutional Biosafety Committee (IBC Bios00000006.04) der Mayo Clinic.
- Produktion von BCMA-CAR, NIS und Luciferase-grün fluoreszierendem Protein (GFP)-kodierenden Lentiviren.
HINWEIS: Ein BCMA-CAR-Konstrukt der zweiten Generation wurde de novo synt....
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Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt die Schritte zum Generieren von NIS+BCMA-CAR-T-Zellen. Isolieren Sie am Tag 0 PBMCs und dann T-Zellen durch negative Selektion. Dann stimulieren Sie T-Zellen mit Anti-CD3 / CD28-Perlen. Transduzieren Sie an Tag 1 T-Zellen sowohl mit NIS- als auch mit BCMA-CAR-Lentiviren. Zählen Sie an den Tagen 3, 4 und 5 T-Zellen und füttern Sie sie mit Medien, um die Konzentration auf 1,0 × 106/ml einzustellen. Für NIS-transduzierte T-Zellen fügen Sie 1 μg/ml Puromyc.......
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Diskussion
Dieses Papier beschreibt eine Methodik für die Integration von NIS in CAR-T-Zellen und die Bildgebung von infundierten CAR-T-Zellen in vivo durch [18F]TFB-PET. Als Proof of Concept wurden NIS+BCMA-CAR T-Zellen mittels dualer Transduktion erzeugt. Wir haben kürzlich berichtet, dass die Integration von NIS in CAR-T-Zellen die Funktionen und die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen in vivo nicht beeinträchtigt und den Transport und die Expansion von CAR-T-Zellen ermöglicht30.......
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Offenlegungen
SSK ist ein Erfinder von Patenten in der CAR-Immuntherapie, die an Novartis (durch eine Vereinbarung zwischen der Mayo Clinic, der University of Pennsylvania und Novartis) und Mettaforge (über die Mayo Clinic) lizenziert sind. RS, MJC und SSK sind Erfinder von Patenten auf dem Gebiet der CAR-Immuntherapie, die an Humanigen lizenziert sind. SSK erhält Forschungsgelder von Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs und Lentigen. Die Figuren wurden mit BioRender.com erstellt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde teilweise durch die Mayo Clinic K2R-Pipeline (SSK), das Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) und die Predolin Foundation (RS) unterstützt. Die Abbildungen 1, 2 und 4 wurden mit BioRender.com erstellt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 22-Gauge-Nadel | Covidien | 8881250206 | |
| 28-Gauge-Insulinspritze | BD | 329461 | |
| 96-Well-Platte | Corning | 3595 | |
| Anti-Human (ETNL) NIS | Imanis | REA009 | ETNL-Antikörper bindet den zytosolischen C-Terminus von NIS |
| Anti-Human-BCMA, Klon 19F2, PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | Flow-Antikörper |
| Anti-Human-CD45, Klon HI30, BV421 | BioLegend | 304032-Flow-Antikörper | |
| Anti-Maus-CD45, Klon 30-F11, APC-Cy7 | BioLegend | 103116-Flow-Antikörper | |
| Anti-Kaninchen-IgG | R& D | F0110 | Sekundärantikörper für NIS-färbendes |
| BCMA-CAR-Konstrukt, IDT der zweiten Generation | , Coralville, IA | ||
| BD Cytofix/Cytoperm Fixierung/Permeabilisierung Solution Kit | BD | 554714 | |
| CD3 Monoklonaler Antikörper (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CTS (Zelltherapiesysteme) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B5-R3-V5 | Beckman Coulter | C04652 | Durchflusszytometer |
| Dimethylsulfoxid | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Einwegspritzen mit Luer-Lok-Spitzen | BD | 309646 | |
| D-Luciferin, Kaliumsalz | Gold Biotechnologie | LUCK-1G | |
| D-PBS (Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung) | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetpulverkonzentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | Magnetische Kügelchen mit negativer Selektion; 17951RF enthält Spitzen und Puffer |
| Fötales Rinderserum | Millipore Sigma | F8067 | |
| Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| Inveon Multiple Modality PET/CT Scanner | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
| Isofluran flüssig | Piramal Intensivpflege | 66794-017-10 | |
| IVIS Lumina S5 Bildgebungssystem | PerkinElmer | CLS148588 | |
| IVIS® Spektrum In-vivo-Bildgebungssystem | PerkinElmer | ||
| Lipofectamine 3000 Transfektionsreagenz | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixierbares Aqua Dead Cell Stain Kit, für 405 nm Anregung | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vakuumfilter, 0,22 μM, steril | Thermo Scientific | 450-0020 | |
| Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vakuumfilter, 0,45 μM, steril | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson laboratory | 05557 | |
| OPM-2 | DSMZ | CRL-3273 | multiple Myelom-Zelllinie |
| pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | lentiviraler Vektor, der für Luciferase-GFP kodiert |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamin (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| PMOD-Software | PMOD | PBAS und P3D | |
| Gepooltes humanes AB-Serumplasma abgeleitet | Innovative Forschung | IPLA-SERAB-H-100ML | |
| Puromycin-Dihydrochlorid | MP Biomedicals, Inc. | ||
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Vollautomatischer Zellseparator |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) | Gibco | 21870-076 | |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | Dichtegradienten-Trennröhrchen |
| Natriumazid, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| T175 Kolben | Corning | 353112 | |
| Terrell (Isofluran, USP) | Piramal Critical Care Inc | 66794-019-10 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| X-VIVO 15 Serumfreies hämatopoetisches Zellmedium | Lonza | 04-418Q |
Referenzen
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
- Raje, N., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
![Dynamische Bildgebung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen mit [18F]Tetrafluoroborat-Positronen-Emissions-Tomographie/Computertomographie](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg&w=3840&q=75)