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Methodenartikel

Fortschrittliches Herzrhythmusmanagement durch Anwendung optogenetischer Multi-Site-Photostimulation bei murinen Herzen

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DOI:

10.3791/62335

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26. August 2021

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1Research Group Biomedical Physics, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 2Research Electronics Department, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, 4Institute for Nonlinear Dynamics, Georg-August-University Goettingen, 5Department of Cardiology and Pneumology, University Medical Center Goettingen, 6German Center for Cardiovascular Research, DZHK e.V., partner site Goettingen, 7Laboratory Animal Science Unit, German Primate Center Leibniz Institute for Primate Research, 8Department of Microsystems Engineering (IMTEK), University of Freiburg, 9Cluster of Excellence BrainLinks-BrainTools, University of Freiburg

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Arbeit berichtet über eine Methode zur Kontrolle des Herzrhythmus intakter muriner Herzen von transgenen Kanalrhodopsin-2 (ChR2) Mäusen unter Verwendung lokaler Photostimulation mit einem Mikro-LED-Array und gleichzeitiger optischer Kartierung des Epikardialmembranpotentials.

Zusammenfassung

Ventrikuläre Tachyarrhythmien sind weltweit eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität. Die elektrische Defibrillation mit hochenergetischen Elektroschocks ist derzeit die einzige Behandlung für lebensbedrohliches Kammerflimmern. Defibrillation kann jedoch Nebenwirkungen haben, einschließlich unerträglicher Schmerzen, Gewebeschäden und einer Verschlechterung der Prognose, was auf einen erheblichen medizinischen Bedarf für die Entwicklung sanfterer Herzrhythmusmanagementstrategien hinweist. Neben energiereduzierenden elektrischen Ansätzen wurde die kardiale Optogenetik als leistungsfähiges Werkzeug zur Beeinflussung der Herzaktivität durch lichtempfindliche Membranionenkanäle und Lichtpulse eingeführt. In der vorliegenden Studie wird eine robuste und valide Methode zur erfolgreichen Photostimulation von Langendorff-perfundierten intakten Mausherzen beschrieben, die auf Multi-Site-Pacing unter Verwendung eines 3 x 3-Arrays von Mikro-Leuchtdioden (Mikro-LED) basiert. Die simultane optische Kartierung von Epikardialmembranspannungswellen ermöglicht die Untersuchung der Effekte der regionsspezifischen Stimulation und wertet die neu induzierte Herzaktivität direkt vor Ort aus. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Wirksamkeit der Defibrillation stark von den Parametern abhängt, die für die Photostimulation während einer Herzrhythmusstörung ausgewählt wurden. Es wird gezeigt, dass der beleuchtete Bereich des Herzens eine entscheidende Rolle für den Abbrucherfolg spielt und wie die gezielte Steuerung der Herzaktivität während der Beleuchtung zur Modifikation von Arrhythmiemustern erreicht werden kann. Zusammenfassend bietet diese Technik die Möglichkeit, die Mechanismusmanipulation vor Ort auf dem Weg zur Echtzeit-Feedback-Kontrolle des Herzrhythmus zu optimieren und in Bezug auf die Regionsspezifität neue Ansätze zur Reduzierung der potenziellen Schädigung des Herzsystems im Vergleich zur Verwendung von unspezifischen elektrischen Schlaganwendungen zu entwickeln.

Einleitung

Frühe Untersuchungen der räumlich-zeitlichen Dynamik bei Arrhythmien zeigten, dass die komplexen elektrischen Muster beim Herzflimmern durch wirbelartig rotierende Erregungswellen angetrieben werden1. Dieser Befund lieferte neue Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen von Arrhythmien, die dann zur Entwicklung neuartiger elektrischer Terminationstherapien führten, die auf der Multi-Site-Anregung des Myokards 2,3,4 basieren. Behandlungen mit elektrischer Feldstimulation sind jedoch nicht lokal und können alle umliegenden erregbaren Zellen, einschließlich Muskelgewebe, innervieren, was zu Zell- und Gewebeschäden sowie zu unerträglichen Schmerzen führt. Im Gegensatz zu elektrischen Therapien bieten optogenetische Ansätze eine spezifische und gewebeschützende Technik, um Kardiomyozyten-Aktionspotentiale mit hoher räumlicher und zeitlicher Präzision zu evozieren. Daher hat die optogenetische Stimulation das Potenzial zur minimalinvasiven Kontrolle der chaotischen Aktivierungsmuster während des Herzflimmerns.

Die Einführung des lichtempfindlichen Ionenkanalkanals Rhodopsin-2 (ChR2) in erregbare Zellen durch genetische Manipulation 5,6,7 ermöglichte die Depolarisation des Membranpotentials erregbarer Zellen mittels Photostimulation. Mehrere medizinische Anwendungen, einschließlich der Aktivierung neuronaler Netzwerke, der Kontrolle der Herzaktivität, der Wiederherstellung von Seh- und Hörvermögen, der Behandlung von Rückenmarksverletzungen und anderen 8,9,10,11,12,13,14 wurden entwickelt. Die Anwendung von ChR2 in der Kardiologie hat aufgrund seiner Millisekunden-Reaktionszeit15 ein erhebliches Potenzial und eignet sich daher gut zur gezielten Steuerung der arrhythmischen Herzdynamik.

In dieser Studie wird die Multi-Site-Photostimulation intakter Herzen eines transgenen Mausmodells gezeigt. Zusammenfassend wurde im Rahmen des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Gemeinschaft FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) eine transgene alpha-MHC-ChR2-Mauslinie etabliert und freundlicherweise von Prof. S. E. Lehnart zur Verfügung gestellt. Im Allgemeinen wurden transgene erwachsene männliche C57/B6/J, die Cre-Rekombinase unter Kontrolle von alpha-MHC exprimieren, gepaart, um sich mit dem weiblichen B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J zu paaren. Da die kardiale STOP-Kassette in der zweiten Generation gelöscht wurde, zeigten die Nachkommen eine stabile MHC-ChR2-Expression und wurden zur Aufrechterhaltung kardialer lichtempfindlicher Kolonien verwendet. Alle Experimente wurden mit erwachsenen Mäusen beiderlei Geschlechts im Alter von 36 - 48 Wochen durchgeführt. Die Beleuchtung wird mit einem 3 x 3 Mikro-LED-Array erreicht, das wie in16,17 beschrieben hergestellt wird, mit der Ausnahme, dass das siliziumbasierte Gehäuse und die kurzen optischen Glasfasern nicht implementiert sind. Seine erste Verwendung in einer kardialen Anwendung findet sich in18. Ein lineares Mikro-LED-Array, das auf einer ähnlichen Fertigungstechnologie basiert, wurde als durchdringende Sonde für die Herzschrittweite19 eingesetzt. Die Mikro-LEDs sind in einem 3 x 3-Array mit einem Abstand von 550 μm angeordnet und bieten sowohl eine hohe räumliche Auflösung als auch eine hohe Strahlungsleistung auf einer sehr kleinen Fläche. Die Autoren demonstrieren in dieser Arbeit eine vielseitige lokale Multi-Site-Photostimulation, die den Weg für die Entwicklung neuartiger antiarrhythmischer Therapiemethoden ebnen kann.

Das folgende experimentelle Protokoll beinhaltet eine retrograde Langendorff-Perfusion ex vivo, bei der die kanülierte Aorta als Perfusionseinlass fungiert. Durch den angelegten Perfusionsdruck und die Herzkontraktion fließt das Perfusat durch die Koronararterien, die von der Aorta abzweigen. In der vorgestellten Arbeit wird das Herz mit einem konstanten Druckaufbau durchblutet, der durch Anheben der Perfusatreservoirs auf 1 m Höhe erreicht wird, was 73,2 mmHg entspricht, was zu einer Durchflussrate von 2,633 ± 0,583 ml / min führt. Zwei Arten von Tyrode-Lösung werden während des Experiments als Perfusat verwendet. Die reguläre Tyrode-Lösung unterstützt einen stabilen Sinusrhythmus, während die Lösung von Low-K + Tyrode mit Pinacidil gemischt wird, um die Induktion von Arrhythmien in murinen Herzen zu ermöglichen. Die Verwendung eines hexagonalen Wasserbades ermöglicht die Beobachtung des Herzens durch sechs verschiedene planare Fenster, was die Kopplung mehrerer optischer Komponenten mit weniger Verzerrung durch Brechung ermöglicht.

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Protokoll

Alle Versuche folgten strikt der Tierschutzverordnung, in Übereinstimmung mit der deutschen Gesetzgebung, lokalen Bestimmungen und in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Der Antrag auf Genehmigung von Tierversuchen wurde von der zuständigen Tierschutzbehörde genehmigt und alle Versuche wurden unseren Tierschutzbeauftragten gemeldet.

1. Versuchsvorbereitung und Materialien

  1. Optisches Mapping-Setup
    HINWEIS: Der optische Aufbau sowie der elektrische Aufbau sind in Abbildung 1 dargestellt. Alle Komponenten, die im optischen und elektrischen Aufbau verwendet werden, sind in der Materialtabelle detailliert aufgeführt.
    1. Verwenden Sie LED 1 und LED 2 für die Induktion von Arrhythmie und Backup-Defibrillation. Wählen Sie Hochleistungs-LEDs mit einer Wellenlänge λblau nahe 475 nm, was dem Höhepunkt der Anregungswellenlänge von ChR26 entspricht. Um das optische Spektrum weiter einzuschränken, verwenden Sie einen Bandpassfilter von 470 ± 20 nm.
      HINWEIS: In dieser Arbeit haben LED 1 und LED 2 einen typischen Strahlungsstrom von 3,9 bis 5,3 W, gemäß dem Datenblatt20.
    2. Beleuchten Sie das Epikard für die optische Kartierung mit einer roten Hochleistungs-LED (LED 3 in Abbildung 1), die Licht mit einer Mittenwellenlänge von λrot = 625 nm und einem Strahlungsfluss von 700 mW21 emittiert. Das Rotlicht wird mit einem 628 ± 20 nm Bandpassfilter gefiltert und von einem dichroitischen Langpassspiegel (DM) mit einer Grenzwellenlänge von λDM = 685 nm reflektiert.
    3. Verwenden Sie einen Emissionsfilter mit λFilter-Cam = 775 ± 70 nm vor dem Kameraobjektiv, um nur die Fluoreszenzemission der Herzaktivität aufzuzeichnen. Verwenden Sie ein schnelles Objektiv, das sich gut für Anwendungen bei schlechten Lichtverhältnissen eignet.
      HINWEIS: Die Häufigkeit von Flimmern eines Mausherzens liegt zwischen 20 und 35 Hz; Verwenden Sie daher eine Kamera, die schnell genug ist, um mit einer Frequenz von 1 bis 2 kHz oder sogar höher aufzunehmen.
  2. Micro-LED-Array
    HINWEIS: Die hier verwendeten Mikro-LED-Arrays werden unter Verwendung von Mikrosystemverarbeitung realisiert, wie an anderer Stelle16,17 näher ausgeführt.
    1. Schleudern Sie eine 5 μm dicke Polyimidschicht (PI) auf 4-Zoll-Siliziumsubstrate (einseitig poliert, 525 μm dick).
    2. Diese PI-Schicht wird bei einer maximalen Temperatur von 450 °C unter Stickstoffatmosphäre ausgehärtet. Halten Sie die maximale Temperatur für 10 min konstant.
    3. Abscheiden und Mustern eines Bildumkehr-Fotolacks (PR) mittels ultravioletter (UV) Lithographie und Sputtern eine 250 nm dünne Platinschicht (Pt).
    4. Verdicken Sie diese Pt-basierte Metallisierung, indem Sie eine 1 μm dicke Goldschicht (Au) galvanisieren, wobei die gemusterte PR als Maskierungsschicht dient.
    5. Vor dem Schleudern einer zweiten PI-Schicht wird der Wafer mit seiner ersten PI-Schicht und der Au-galvanischen Metallisierung einem Sauerstoffplasma ausgesetzt, das die Oberfläche der PI-Schicht chemisch aktiviert.
    6. Die zweite PI-Schicht wird erneut bei 450 °C ausgehärtet, mittels UV-Lithographie eine PR-Schicht gemustert und die Kontaktpads des Arrays für die Mikro-LED-Chips und die Schnittstellenleiterplatte (PCB) durch reaktives Ionenätzen (RIE) unter Verwendung der gemusterten PR als Maskierungsschicht geöffnet.
      HINWEIS: In diesen RIE-Prozessschritten wird empfohlen, 200 W bzw. 100 W für 10 bzw. 30 Minuten aufzubringen, um die Kontaktpadöffnungen sowie die äußere Form des zweidimensionalen (2D) Mikro-LED-Arrays zu definieren.
    7. Entfernen Sie die PR mit Lösungsmitteln und Plasmaätzen. Verdicken Sie die Kontaktpads weiter, indem Sie eine zusätzliche 6 μm dicke Goldschicht galvanisieren.
    8. Befestigen Sie die Micro-LED-Chips mit einem Flip-Chip-Bonder an den Kontaktpads.
    9. Aktivieren Sie die PI-Oberfläche in einem Sauerstoffplasma und unterfüllen Sie die Mikro-LED-Chips mit einem lösemittelfreien Klebstoff. Anschließend den Klebstoff für 12 h bei 120 °C aushärten.
    10. Um die Mikro-LED-Chips zu verkapseln, führen Sie eine weitere Plasmabehandlung mit Argon durch und tragen Sie manuell eine dünne Fluorpolymerschicht auf. Diese Schicht bei 80 °C für 1 h vorhärten.
    11. Tragen Sie Silikon manuell als letzte Verkapselungsschicht auf, nachdem Sie das Mikro-LED-Array einem Sauerstoffplasma ausgesetzt haben, um die Siliziumhaftung an der darunter liegenden Fluorpolymerschicht zu verbessern. Die Silikonschicht bei 80 °C und 180 °C jeweils 1 h aushärten. Diese letzten Aushärtungsschritte härten auch die Fluorpolymerschicht vollständig aus.
    12. Löten Sie die Kontaktpads des PI-Substrats auf eine Leiterplatte, die Streifenanschlüsse für die Verbindung des Arrays mit einer externen Instrumentierung trägt. Decken Sie die Lötpads auf der Leiterplatte mit einem Klebstoff ab.
  3. Elektrischer Aufbau
    1. Verwenden Sie Elektroden, die für die Aufzeichnung eines Elektrokardiogramms (EKG) geeignet sind, z. B. Silber/Silberchlorid-Elektroden oder Monophasic Action Potential (MAP)-Elektroden und einen EKG-Verstärker, um die elektrische Aktivität des Herzens kontinuierlich zu überwachen. Verwenden Sie außerdem ein geeignetes Erfassungsgerät (AD), um alle erhaltenen elektrischen Signale aufzuzeichnen.
    2. Wählen Sie einen geeigneten Treiber für die Hochleistungs-LEDs (LED 1, LED 2 und LED 3), der den maximalen Strom an jedes Gerät verwalten kann. Verwenden Sie einen Arbiträrfunktionsgenerator (AFG), um den Ausgang der LED-Treiber genau zu steuern.
    3. Verwenden Sie einen Mehrkanal-LED-Treiber, um den Strom zu steuern, der durch das Micro-LED-Array fließt. Auch ein AFG mit mehreren Ausgängen ist für diese Aufgabe geeignet.
      HINWEIS: Es ist ratsam, LED-Treiber zu wählen, die den Strom auf den maximalen Strom der Mikro-LED begrenzen, da sonst die Dioden beschädigt werden können. Ein Beispiel für einen Mehrkanal-Mikro-LED-Treiber wird in einer anderen Arbeit18 beschrieben. Bei Bedarf kann der AFG oder ein anderer LED-Treiber an einen Computer angeschlossen werden, um die Micro-LED-Einstellungen fernzusteuern. Wenn dies der Fall ist, verbinden Sie den LED-Treiber mit dem Kommunikationsprotokoll Ihrer Wahl, z. B. General Purpose Interface Bus (GPIB) oder einer seriellen Verbindung.

   

2. Versuchsverfahren

  1. Lösungsvorbereitung
    1. Tyrode-Lösung vorbereiten: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 24 mM NaHCO3, 1,8 mM CaCl 2, 1,2 mM KH2 PO4, 5,6 mM Glucose,0,1% BSA/Albumin.
    2. Low-K+ Tyrode-Lösung vorbereiten: Low-K+ Tyrode's wird auf die gleiche Weise wie normale Tyrode's Lösung hergestellt, außer dass nur die Hälfte der Menge an KCl hinzugefügt wird (2 mM statt 4 mM KCl).
      HINWEIS: Für ein Experiment, das 3 h dauert, sind normalerweise 2-3 L Low-K+ Tyrode (zusätzlich gemischt mit Blebbistatin (Schritt 2.1.5), wenn eine optische Kartierung durchgeführt wird) und 1-2 L normale Tyrode ausreichend.
    3. Fügen Sie Pinacidil zu der Low-K + Tyrode-Lösung hinzu, um den Prozess der Arrhythmie-Induktion zu erleichtern, wie in22 beschrieben, um eine Konzentration von 100 mM zu erhalten. Tragen Sie beim Umgang mit Pinacidil Laborschutzhandschuhe.
    4. Bereiten Sie 1 ml 50 μM DI-4-ANBDQPQ mit normaler Tyrode-Lösung vor. Schützen Sie den Farbstoff vor Licht, um ein Photobleichen zu verhindern.
    5. Machen Sie eine 10 mM Stammlösung von Blebbistatin. Für die optische Kartierung mischen Sie Blebbistatin mit der 100 mM Pinacidil-Tyrode-Lösung (Schritt 2.1.3), um eine 5 μM-Lösung zu erhalten. Tragen Sie beim Umgang mit Blebbistatin Laborschutzhandschuhe.
      HINWEIS: Halten Sie sowohl den Farbstoff als auch die Blebbistatin-Lösung beiseite, bis die optische Zuordnung beginnt.
  2. Langendorff Perfusion
    HINWEIS: Das Setup besteht aus zwei Reservoirs für die beiden Tyrode-Lösungen. Sie sind über Rohre mit Dreiwegehähnen mit einer Blasenfalle verbunden. Das Herz wird später mit einem Luer-Lock-Anschluss an der Blasenfalle befestigt und dann in einem sechseckigen Wasserbad aufgehängt. Das Wasserbad wird wiederum mit einem Abfallbehälter verbunden, um die gebrauchte Tyrode-Lösung zu sammeln.
    1. Reinigen Sie alle Röhrchen vor jedem Versuch mit vollständig demineralisiertem Wasser.
    2. Belüften Sie beide Tyrode-Lösungen mit Carbogen (5% CO2 und 95%O2) für 30 min bei Raumtemperatur vor Beginn des Experiments. Stellen Sie den pH-Wert der Tyrode-Lösungen mit NaOH auf 7,4 ein.
    3. Füllen Sie 500 ml jeder Tyrode-Lösung in das entsprechende Reservoir und entlüften Sie die Röhrchen sowie die Blasenfalle, indem Sie Tyrodes Lösung durch das Perfusionssystem laufen lassen, bis keine eingeschlossenen Luftblasen mehr in den Röhrchen oder in der Blasenfalle zu sehen sind.
    4. Belüften Sie die Tyrode-Lösungen während des gesamten Experiments in den Reservoirs mit Carbogen, um sicherzustellen, dass der pH-Wert des Perfusats später während der Perfusion stabil bleibt.
    5. Heizen Sie die Perfusionsanlage mit einer Wasserwärmepumpe auf 37 °C. Halten Sie die Perfusattemperatur im Wasserbad konstant, indem Sie ein zusätzliches Heizelement wie ein wasserdichtes Heizkabel verwenden.
      HINWEIS: Während des Experiments ist es wichtig, die Reservoirs der Tyrode wieder aufzufüllen, bevor sie leer sind. Andernfalls können Luftblasen in das Herz eindringen, die die Gefäße verstopfen und zu Ischämie führen können.
  3. Maus-Vorbereitung
    1. Injizieren Sie subkutan 0,1 ml 500 I.E. Heparin 30 min vor der Herzisolierung.
    2. Füllen Sie eine 6 cm Petrischale und eine 2 ml Spritze mit eiskalter Tyrode-Lösung. Unter das stereoskopische Mikroskop legen.
    3. Führen Sie eine Kurzzeitanästhesie von Mäusen in einer gesättigten Isofluran-Umgebung für 2 Minuten und eine sofortige zervikale Dislokation danach durch.
      HINWEIS: Um eine ausreichende Anästhesie zu überprüfen, ist eine Überprüfung auf den negativen Interzehenreflex unbedingt erforderlich.
    4. Öffnen Sie die Brust, entfernen Sie das Herz, wie an anderer Stelle23 beschrieben, und legen Sie es in die 6 cm große Petrischale mit eiskalter Tyrode-Lösung. Herzschläge werden aufgrund des Temperaturabfalls verringert.
    5. Führen Sie die Feinvorbereitung unter einem stereoskopischen Mikroskop durch, wie an anderer Stelle beschrieben23. Befestigen Sie die Aorta auf der stumpfen Nadel und fixieren Sie das Gefäß mit Nahtmaterial.
    6. Als Kontrolle injizieren Sie eiskalte Tyrode-Lösung durch die Nadel in das Herz und überprüfen Sie, ob das Herz fest montiert ist. Dieser Schritt spült auch das restliche Blut aus dem Herzen.
    7. Übertragen Sie das montierte Herz in das Perfusionssystem. Stellen Sie sicher, dass das Perfusat fließt, um zu verhindern, dass Luft in das Herz eindringt, während Sie die Nadel mit der Blasenfalle verbinden. Überprüfen Sie, ob das Herz mit Tyrodes Lösung im Wasserbad bedeckt ist. Die Schritte 2.3.4, 2.3.5 und 2.3.7 sind in Abbildung 2 dargestellt.
    8. Stellen Sie sicher, dass das Herz innerhalb weniger Minuten zu schlagen beginnt. Lassen Sie das Herz für 15 bis 20 Minuten an den Perfusionsaufbau anpassen und wechseln Sie dann zu einer Lösung mit niedrigem K+ Tyrode mit Pinacidil (Schritt 2.1.3) bzw. einer Lösung mit niedrigem K+ Tyrode mit Pinacidil und Blebbistatin (Schritt 2.1.5), wenn ein optisches Mapping durchgeführt werden soll.
  4. Arrhythmie-Induktion und optische Defibrillation
    1. Platzieren Sie eine der EKG-Elektroden so nah wie möglich an der Herzoberfläche, um eine gute Signalqualität zu gewährleisten. Suspendieren Sie die zweite EKG-Elektrode in der Tyrode-Lösung. Stellen Sie sicher, dass das erworbene EKG von der AD Ihrer Wahl aufgezeichnet wird.
    2. Platzieren Sie das Micro-LED-Array auf dem interessierenden Bereich der Studie, beispielsweise auf dem linken Ventrikel.
    3. Ändern Sie die Perfusion auf Low-K+ Tyrode's mit Pinacidil und perfundiert Sie das Herz für 15 bis 30 min.
    4. Um Arrhythmien zu induzieren, beleuchten Sie das Herz mit LED 1 und LED 2 mit einem Zug von 20 bis 50 Lichtimpulsen mit einerFrequenz von 25 bis 35 Hz, einer Pulsdauer Wind von 2 bis 15 ms und einer Lichtintensität LIopt_ind von 2,8 mW mm-2.
    5. Wiederholen Sie den Vorgang, bis eine Arrhythmie induziert wird.
      HINWEIS: Arrhythmien sind im EKG-Signal leicht zu identifizieren, da sich die Frequenz und Morphologie des Signals vom normalen Sinusrhythmus unterscheiden. Sollte die Arrhythmie innerhalb der nächsten 5 s enden, klassifizieren Sie sie als selbstbeendet und starten Sie einen neuen Induktionsversuch.
    6. Sobald eine anhaltende Arrhythmie visuell erkannt wird, wenden Sie einen Impulsstoß mit unterschiedlichen Breiten W def und Frequenzen fdef an, wobei drei, sechs oder neun Mikro-LEDs des Arrays bei einem pulsierendenStrom-I-Impuls von 15 mA verwendet werden, der einer Lichtintensität LIμLED = 33,31 ± 2,05 mW mm-2 entspricht.
    7. Sollte die Arrhythmie nach fünf Mikro-LED-Array-basierten Defibrillationsversuchen anhalten, klassifizieren Sie den Versuch als erfolglos und beginnen Sie mit der Backup-Defibrillation.
    8. Verwenden Sie für die Backup-Defibrillation LED 1 und LED 2 mit denselben Timing-Parametern wie für das Micro-LED-Array.
      HINWEIS: Da das Herz während des gesamten Versuchszeitraums ischämischem und metabolischem Stress ausgesetzt ist, ist es möglich, dass Abbruchversuche der Arrhythmie auch bei Backup-Defibrillation nicht erfolgreich sind. Wann immer dies geschieht, wechseln Sie die Perfusionslösung auf die normale Tyrode's und lassen Sie das Herz für 5 bis 10 Minuten erholen. Wenn das EKG zum Sinusrhythmus zurückkehrt, wiederholen Sie das Protokoll aus Schritt 2.4.3 erneut.
  5. Optisches Mapping
    1. Perfusion des Herzens mit der in Schritt 2.1.5 vorbereiteten Blebbistatinlösung und warten Sie, bis eine mechanische Entkopplung erfolgt. Dies wird erreicht, wenn das Herz aufhört zu schlagen, aber ein EKG-Signal immer noch messbar ist.
      HINWEIS: Das Mischen der Blebbistatin-Lösung auf die genannte Konzentration und das Durchbluten des Herzens mit dieser Lösung hält die kardiale mechanische Aktivität während des gesamten Experiments von der elektrischen Aktivität entkoppelt.
    2. Geben Sie den 1 mL Spannungsfarbstoff DI-4-ANBDQPQ (hergestellt in Schritt 2.1.4) als Bolus in die Blasenfalle der Langendorff-Perfusion. Warten Sie 5 bis 10 Minuten, damit der Farbstoff das Herz gleichmäßig durchbluten kann.
      HINWEIS: Vermeiden Sie das Photobleichen des Farbstoffs, indem Sie das rote Licht ausschalten, wenn keine Aufnahme gemacht wird. Wenn das Signal-Rausch-Verhältnis der Aufzeichnung zu klein wird (das erfasste Signal ist zu verrauscht), wiederholen Sie die Schritte 2.1.4 und 2.5.2.
    3. Fokussieren Sie die Kamera auf die Herzoberfläche, schalten Sie LED 3 ein und legen Sie 1,27 mW mm-2 optische Leistung an.
    4. Schalten Sie die Laborbeleuchtung aus und starten Sie die Aufnahme. Stellen Sie sicher, dass ein optisches Signal erfasst wird, indem Sie die Frequenz des erhaltenen Signals mit der Frequenz des aufgezeichneten EKGs vergleichen. Dadurch wird sichergestellt, dass das erhaltene optische Signal ausschließlich mit der elektrischen Aktivität des Herzens zusammenhängt.
      HINWEIS: Da das vom Farbstoff emittierte Fluoreszenzlicht sehr wöchentlich ist, wird die optische Kartierung in einem dunklen Raum durchgeführt. Dadurch werden Signalstörungen durch andere Lichtquellen vermieden.

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Ergebnisse

Das Protokoll ermöglicht die Induktion von ventrikulären Arrhythmien in intakten murinen Herzen unter Verwendung von Photostimulationsimpulsen, die von LED 1 und LED 2 erzeugt werden (Abbildung 1) mit einer Frequenz f ind zwischen 25 Hz und 35 Hz und einer Pulsdauer Wind zwischen 2 ms und 10 ms. Bitte beachten Sie, dass das Ziel solcher schnellen Lichtimpulse nicht darin besteht, den Herzrhythmus zu erfassen, sondern die Herzaktivität aus dem Gleichgewicht zu bringen, s...

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Diskussion

Eine erfolgreiche Behandlung von Herzrhythmusstörungen ist der Schlüssel zur kardialen Therapie. Die biophysikalischen Mechanismen, die der Initiierung, Aufrechterhaltung und Beendigung von Arrhythmien zugrunde liegen, sind jedoch nicht vollständig verstanden. Die Herzforschung zielt daher darauf ab, die Elektroschocktherapie in Richtung eines schonenderen Abbaus von Arrhythmien zu optimieren und dadurch die Lebensqualität der Patienten zu erhöhen 28,29,30,31.

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Die Autoren danken Marion Kunze und Tina Althaus für ihre hervorragende technische Unterstützung bei den Experimenten. Die Forschung, die zu den Ergebnissen geführt hat, wurde aus dem Siebten Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft RP7/2007-2013 unter der Finanzhilfevereinbarung HEALTH-F2-2009-241526 gefördert. Unterstützt wurde dies auch vom Deutschen Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung, dem DZHK e.V. (Projekt MD28), dem Partnerstandort Göttingen, dem SFB 1002 der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Teilprojekt C03) und der Max-Planck-Gesellschaft. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch BrainLinks-BrainTools, Exzellenzcluster der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Förderkennzeichen EXC 1086).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Chemische Bestandteile
BlebbistatinTargetMolT603810 mM Stammlösung
BSA/AlbuminSigma-AldrichA4919
CalciumchloridSigma-AldrichC1016CaCl2
CarbogenWestfalen50 l Flasche
DI-4-ANBDQPQAAT Bioquest21499Farbstoff für optisches Mapping
GlucoseSigma-AldrichD9434C6H12O6
HeparinLEO PharmaHeparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, verschreibungspflichtig
HydrochloridsäureMerck1.09057.1000HCl, 1 M Stammlösung
IsofluranCP Pharma1 ml/ml, verschreibungspflichtig
Magnesium ChloridMerck8.14733.0500MgCl2
MonokaliumphosphatSigma-Aldrich30407KH2PO4
Pinacidil MonohydratSigma-AldrichP154-500mg10 mM Stammlösung
KaliumchloridSigma-AldrichP5405KCl
NatriumbicarbonatSigma-AldrichS5761NaHCO3
Natrium ChloridSigma-AldrichS5886NaCl
NatriumhydroxidMerck1.09137.1000NaOH, 1 M Stammlösung
Elektrische Einrichtung
Biopac MP150Biopac SystemsMP150WSWDatenerfassungs- und Analysesystem
Maßgeschneidertes EKG, alternativ ECG100CBiopac SystemsECG100CElektrokardiogramm-Verstärker
Maßgeschneiderte Wasserbadheizung mit HeizkabelRMS HeizsystemHK-5,0-12Heizkabel 120W
Sechseckiges Wasserbad
LED-Treiber NetzteilThorlabsKPS10115 V, 2,4 A Netzteil mit 3,5 mm Klinkenstecker für einen K- oder T-Würfel.
LEDD1B LED-TreiberThorlabsLEDD1BT-Cube LED-Treiber, 1200 mA Max Drive
Current MAP, EKG-ElektrodeHugo Sachs ElektronikBS4  73-0200Mini-EKG-Elektrode für isoaltierte Herzen
Micro-LED-Treiber z.B. AFGAgilent InstrumentsA-2230Arbiträrfunktionsgenerator (AFG)
SignalgeneratorAgilent InstrumentsA-2230
AFG micro-LED Array Komponenten
Epoxidkleber EpoxidTechnologieEPO-TEK 353NDZweikomponenten-Epoxidharz
Fluorpolymer Asahi Glass Co. Ltd.Cytop 809MFluorpolymer mit hoher Transparenz
Bildumkehr-FotolackMerck KGaAAZ 5214EBildumkehrlack für hochauflösende
LED-Chips  Cree Inc.C460TR2227-S2100Blauer Mikro-LED-Fotolack
Merck KGaAAZ 9260Dicke Positiv-Fotolacke
PolyimidUBE Industries Ltd.U-Varnish SPolyimidlösung
SilikonNuSil Technology LLCMED-6215Niedrigviskoses Silikonelastomer
Lösemittelfreier KlebstoffJohn P. Kummer GmbHEpo-Tek 301-2Epoxidharz mit niedriger Viskosität
Optisches Mapping
Blauer FilterChroma Technology CorporationET470/40xAnregungsfilter
KameraPhotometrieCascade 128+Hochleistungs-EMCCD-Kamera
KameraobjektivNavitarDO-5095Navitar Hochgeschwindigkeits-Objektive mit Festbrennweite funktionieren mit CCD- und CMOS-Kameras
Dichroitischer SpiegelSemrockFF685-Di02-25x36685 nm Kante BrightLine® einschneidiger Standard Epifluoreszenz dichroitischer Strahlteiler
Emmision FilterSemrockFF01-775/140-25775/140 nm BrightLine® Singleband-Bandpassfilter
KühlkörperAdvanced Thermal SolutionsATSEU-077A-C3-R0Kühlkörper - LED STAR LED Kühlkörper, Ø 45mm, 68mm, Schwarz/Silber, ohne Gewinde Bodenplatte Hardware
LED 1 und LED 2LED Engin OsramLZ4-00B208High Power LEDs - Einfarbig Blau, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3ThorlabsM625L3625 nm, 700 mW (Min) Gefasste LED, 1000 mA
LinsenLED Engin OsramLLNF-2T06-HLED-Beleuchtung Linsen Baugruppen LZ4 OBJEKTIV SCHMALER FLUTSTRAHL
Fotodiode für LeistungsmesserThorlabsS120VCStandard Fotodiode Leistungssensor
LeistungsmesserThorlabsPM100DKompakter Leistungs- und Energiemesser
Roter FilterSemrockFF02-628/40-25BrightLine® Singleband-Bandpassfilter
Blauer

Referenzen

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