Partielle Hepatektomie bei erwachsenen Zebrafischen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Entfernung des Bauchlappens der Leber bei erwachsenen Zebrafischen, um die Untersuchung der Leberregeneration zu ermöglichen.

Abstract

Leberversagen ist eine der weltweit führenden Todesursachen, und die Sterblichkeit durch chronische Lebererkrankungen steigt in den Vereinigten Staaten stark an. Gesunde Lebern sind in der Lage, sich von toxischen Schäden zu regenerieren, aber bei fortgeschrittenen Lebererkrankungen ist die natürliche Regenerationsfähigkeit der Leber beeinträchtigt. Zebrafische haben sich als leistungsfähiges experimentelles System zur Untersuchung der Regeneration herausgestellt. Sie sind ein ideales Modell für die Untersuchung der Leberregeneration aus der partiellen Hepatektomie, einem Verfahren mit direkter klinischer Relevanz, bei dem ein Teil der Leber operativ entfernt wird, wobei der Rest intakt bleibt. Es gibt kein Standardprotokoll für die partielle Hepatektomie; Frühere Studien, die dieses Modell verwendeten, verwendeten leicht unterschiedliche Protokolle und berichteten über unterschiedliche Ergebnisse. Hier wird ein effizientes, reproduzierbares Protokoll zur Durchführung einer partiellen Hepatektomie bei erwachsenen Zebrafischen beschrieben. Mit dieser Technik zeigen wir, dass Zebrafische in der Lage sind, den resezierten Lappen epimorph zu regenerieren. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Mechanismen, die für die Leberregeneration bei Zebrafischen erforderlich sind, weiter zu untersuchen.

Introduction

Unter den festen Organen beim Menschen ist die Leber das einzige Regenerationsorgan¹. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da die Leber ein essentielles Organ ist, das für wichtige Stoffwechselfunktionen, Energiespeicherung, Blutentgiftung, Sekretion von Plasmaproteinen und Gallenproduktion verantwortlich ist². Hepatozyten, die durch toxische oder entzündliche Schäden verloren gehen, werden in erster Linie durch Teilung der verbleibenden Hepatozyten ersetzt¹. Ein klassisches experimentelles Modell zur Untersuchung der Leberregeneration ist die partielle Hepatektomie, bei der einzelne Leberlappen entfernt werden, wobei die verbleibenden Lappen intakt^{bleiben 3}. Dieses Verfahren wurde ursprünglich bei Ratten entwickelt, bei denen etwa zwei Drittel der Lebermasse entfernt werden. Nach partieller Hepatektomie bei Säugetieren erfolgt eine kompensatorische Regeneration in den verbleibenden Lappen, bis die Leber ihre Ursprüngliche Masse wiedererlangt hat. Bemerkenswerterweise ersetzt die Säugetierleber nicht die fehlenden Lappen.

Zebrafische (Danio rerio) stellen ein handhabbares Modell zur Untersuchung der Erwachsenenorganregeneration^{dar 4}. Die Zebrafischleber unterscheidet sich zwar strukturell von der Säugetierleber, besteht jedoch aus den gleichen Zelltypen und erfüllt die gleiche Funktion wie bei Säugetieren². Es besteht aus drei Lappen mit zwei Rückenlappen und einem einzigen Bauchlappen, die entlang des Darms abgeflacht sind. Eine partielle Häpatektomie wurde zuvor bei Zebrafischen durchgeführt, mit widersprüchlichen Berichten über die genaue Art der Regeneration. Typischerweise wird eine ein Drittel partielle Häpatektomie durch Entfernung des gesamten Ventrallappens durchgeführt. Erste Berichte deuteten darauf hin, dass der Ventrallappen nach Entfernung innerhalb einer Woche vollständig regeneriert wurde^5,6,7, was darauf hindeutet, dass die Zebrafischleber im Gegensatz zur Säugetierleber zu einer epimorphen Regeneration fähig ist. Nachfolgende Studien zeigten, dass die Entfernung des Bauchlappens zu einer kompensatorischen Regeneration in den Rückenlappen führte, anstatt zur Regeneration des fehlenden Bauchlappens und schließlich zur Wiederherstellung der Lebermasse innerhalb einer Woche^8,9. Die transkriptomische Profilierung der Rückenlappen nach der Resektion des Bauchlappens ergab signifikante Veränderungen im Zusammenhang mit der kompensatorischen Regeneration¹⁰. Angesichts der Tatsache, dass die Art der Leberregeneration mit dem Ausmaß der Verletzung variieren kann⁸, spekulierten wir, dass die Diskrepanzen in den Ergebnissen auf technische Unterschiede im partiellen Hepatektomie-Protokoll zwischen forschungsgruppen zurückzuführen sein könnten.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Durchführung einer partiellen Hepatektomie bei erwachsenen Zebrafischen durch Entfernen des Bauchlappens. Diese Technik wird für die Beurteilung der Mechanismen der Leberregeneration wertvoll sein.

Protocol

Zebrafische wurden nach Standardverfahren gezüchtet und gezüchtet. Die Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Brigham and Women's Hospital genehmigt (2016N000405). Erwachsene Zebrafische wurden vor Beginn des Protokolls 24 Stunden lang gefastet. Systemwasser bezieht sich auf das Wasser in Zebrafisch-Haltungsbecken in der Wasseranlage.

1. Vorbereitung und Betäubung

1. Bereiten Sie 0,016% ige Tricainlösung in Systemwasser vor.
   VORSICHT: Tricain ist ein Reizstoff, wenn es mit den Augen, der Haut oder den Atemwegen in Kontakt kommt.
2. Bereiten Sie einen Schwamm vor, um betäubte Zebrafische während des Sezierprotokolls zu halten. Einen vollen Schwamm in Viertel schneiden. Entfernen Sie mit einer Rasierklinge einen dünnen Schwammkeil, der parallel zur langen Achse des Schwammviertels verläuft.
   1. Der Schlitz sollte lang genug sein, um einen erwachsenen Fisch aufzunehmen (dies variiert zwischen verschiedenen Fischgrößen). Zum Beispiel sollte für einen erwachsenen Fisch mit einer Länge von 35 mm die Länge des Schlitzes 20 mm beträgen. Kopf und Körper werden eng im Schwamm gehalten, der Schwanz verläuft jedoch am Rand des Schwammes vorbei (Abbildung 1B).
3. Den Schwamm in 0,016% igen Tricainlösung einweichen.
4. Erwachsene Zebrafische (entweder männlich oder weiblich) in 625 ml 0,016% Tricainlösung geben.
5. Inkubieren Sie für 6 Minuten oder bis der Fisch nicht mehr ansprechbar ist.
6. Entfernen Sie den Fisch vorsichtig mit einer Zette aus dem Tricainbecken und legen Sie die Ventralseite des Fisches nach oben in die Rille des Schwamms (Abbildung 1A - B).
7. Legen Sie den Schwamm unter ein Seziermikroskop mit Top-Down-Beleuchtung.

2. Chirurgie

1. Mit einer feinen Zette die Haut einklemmen und medial skalieren, nur hinter dem Herzen (Abbildung 1B).
2. Machen Sie mit einer federbelasteten Schere einen Schnitt unter der Zette, um ein Loch in der Körperhöhle zu erzeugen (Abbildung 1C - D). Achten Sie darauf, das Herz oder ein großes Blutgefäß nicht zu verletzen, da dies zu einer erhöhten Mortalität führt.
3. Machen Sie mit einer federbelasteten Schere einen 3-4 mm-Schnitt entlang des Bauches, der nachträglich bearbeitet wird, bis der Schnitt an den Beckenflossen ankommt (Abbildung 1D - E). Zu diesem Zeitpunkt kann der Bauchlappen der Leber durch den Schnitt sichtbar sein.
4. Drücken Sie die Seiten des Schwammes mit einer Hand zusammen, um die viszeralen Organe aus der Körperhöhle zu drücken. Der Bauchlappen der Leber ist oben im Darm sichtbar (Abbildungen 1F, 2A-B). Die Leber erscheint als rosa oder orange Struktur, die über den goldbraunen Darm verteilt ist. Tiere, die als Scheinkontrollen bezeichnet werden, werden an dieser Stelle geborgen.
5. Drücken Sie die feine Zette so zusammen, dass sich die beiden Zinken berühren. Während Sie den Druck auf den Schwamm halten, schieben Sie die Zinken der feinen Zette zwischen Leber und Darm (Abbildung 1G). Achten Sie darauf, den Darm nicht zu punktieren, da dies zu einer erhöhten Mortalität führt.
6. Den Druck auf die Zette langsam lockern, so dass sich die Zinken voneinander entfernen (Abbildung 1H). Diese Gleitwirkung durchtrennt die zahlreichen Pfortaderbefestigungen zwischen Bauchlappen und Darm (Abbildung 2B) und ist notwendig, um den Ventrallappen sauber zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Portalverbindungen zwischen Leber und Darm getrennt wurden.
7. Schälen Sie den Bauchlappen mit einer feinen Zette aus dem Darm zurück und schneiden Sie den Bauchlappen frei vom Rest der Leber (Abbildung 1I).
8. Dieses Verfahren führt zu einer drittelpartiellen Hepatektomie (Abbildung 1J).

3. Wiederherstellung

1. Entfernen Sie den Fisch vorsichtig aus dem Schwamm und legen Sie ihn in einen Tank mit Systemwasser.
2. Pipetten Sie das Wasser für einige Minuten über die Kiemen, bis der Fisch von selbst schwimmt (Abbildung 1K).
3. Überwachen Sie Fische für 2-4 Stunden, bevor Sie sie wieder auf das System legen. Füttern Sie den Fisch nicht für volle 24 Stunden nach der Operation.
4. Überwachen Sie Fische täglich für die Dauer des Experiments.
5. Mit der Zeit heilt der Schnitt in der Körperwand auf natürliche Weise, ohne dass Nähte erforderlich sind (Abbildung 1L, 2C).

4. Analyse der Bauchlappenlänge im Darm

1. Euthanasieren Sie alle Tiere, die für die Analyse bestimmt sind, für 10 Minuten in Eiswasser, bis alle operkulären Bewegungen aufhören.
2. Entfernen Sie den Fisch aus dem Eiswasser und legen Sie ihn mit der ventralen Seite nach oben in die Rille eines Schwammes.
3. Machen Sie mit einer federbelasteten Schere einen Schnitt in die ventrale Körperwand an der vorderen-hinteren Position des Herzens. Machen Sie dann zwei weitere Schnitte, die entlang der vorderen hinteren Achse vom ersten Schnitt bis zu den Beckenflossen verlaufen. (Abbildung 2A).
4. Schälen Sie die Haut und den Muskel zurück, um die viszeralen Organe freizulegen (Abbildung 2A).
5. Erfassen Sie Hellfeld- und Fluoreszenzbilder der viszeralen Organe mit einem Epifluoreszenzmikroskop. Dieses Sichtfeld umfasst den Bereich, in dem der Bauchlappen reseziert wurde. Da Tiere vor der Analyse eingeschläfert werden, schließt diese Art der Analyse eine langfristige Bildgebung desselben Fisches aus.

5. Analyse des Leber-Körpergewichts-Verhältnisses

1. Euthanasieren Sie alle Tiere, die für die Analyse bestimmt sind, für 10 Minuten in Eiswasser, bis alle operkulären Bewegungen aufhören.
2. Fisch in ein 50 ml konisches Rohr geben.
3. 25 ml 4% Paraformaldehyd in 1x PBS und 0,3% Tween in das Röhrchen geben.
   ACHTUNG: Formaldehyd ist giftig, und formaldehydhaltige Lösungen sollten immer in einer chemischen Haube verarbeitet werden.
4. 48 h bei 4 °C nutatetieren.
5. Führen Sie vier 10-minütige Wäschen in 1x PBS und 0,3% Tween durch.
6. Holen Sie Fische mit einer Zette und trocknen Sie sie auf einem Papiertuch ab.
7. Notieren Sie das Gewicht des gesamten Fisches.
8. Machen Sie mit einer federbelasteten Schere einen Schnitt in die ventrale Körperwand an der vorderen-hinteren Position des Herzens. Machen Sie dann zwei weitere Schnitte, die entlang der vorderen hinteren Achse vom ersten Schnitt bis zu den Beckenflossen verlaufen. (Abbildung 2A).
9. Schälen Sie die Haut und den Muskel zurück, um die viszeralen Organe freizulegen (Abbildung 2A).
10. Erfassen Sie Hellfeldbilder der Leber mit einem Epifluoreszenzmikroskop.
11. Sezieren Sie die Leber und legen Sie die Leberstücke auf ein Wiegeboot.
12. Notieren Sie das Gewicht der Leber.

Results

Um das regenerative Potenzial der erwachsenen Zebrafischleber zu untersuchen, haben wir eine partielle Hepatektomie (PHX) bei erwachsenen Zebrafischen durchgeführt. Im Allgemeinen wurden große Erwachsene (30-40 mm Länge) ausgewählt, die zwischen 1,5 und 2,5 Jahre alt waren. In einzelnen Experimenten wurden Tiere aus demselben Tank ausgewählt und auf Alter und Größe abgestimmt. Als angemessene Kontrolle verwendeten wir Scheinoperationen, bei denen das Tier sowohl betäubt wurde als auch einen großen Schnitt in der ventrale...

Discussion

Die anatomischen Unterschiede zwischen Zebrafisch- und Säugetiermodellen für die Leberregeneration stellen einzigartige Herausforderungen für die Leberresektion dar. Die Leber beim Zebrafisch befindet sich in unmittelbarer Nähe zum Herzen und zum Darm; Die versehentliche Schädigung beider Organe führt zu einer erhöhten Mortalität. Die Zebrafischleber ist nicht eingekapselt, was es schwieriger macht, sich vom Darm zu trennen. Die Leber erhält nährstoffreiches Blut aus dem Darm durch Pfortadern. Bei Säugetieren konvergiere...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 % wässrige Paraformaldehyd-Lösung, EM-Qualität	Elektronenmikroskopie Sciences	15700
50 mL Falcon-Zentrifugenröhrchen, Polypropylen, steril	Corning	352098
AS 82/220.R2 PLUS Analysenwaage	Bay State Scale & Systems, INC.	WL-104-1051
Dumont #55 Pinzetten	Fine Science Tools	11295-51
EMS Kühne Deckglas/Probenzange	Elektronenmikroskopie Sciences	72997-07
Epifluoreszenzmikroskop	Zeiss	Discovery.V8
Mastertop Zellulose Reinigungsschwamm	Amazon	B07CBSM53Z
PBS10X Flüssigkeit Conc 4L	EMD Millipore	6505-4L
Superfeine Mikroschere, 3 1/4" gerade	Biomedizinische Forschungsinstrumente	11-1020
Tricain-Methansulfonat	Syndel	TRIC-M-GR-0010
Tween 20, Fisher BioReagents	Fischer Scientific	BP337-500