Präparation von Lamellen aus glasartigen biologischen Proben mit einem Zweistrahl-Rasterelektronenmikroskop für die Kryo-Elektronentomographie

Zusammenfassung

Fokussiertes Ionenstrahlfräsen zur Herstellung von glasartigen On-Grid-Lamellen aus tiefgefrorenen biologischen Proben für die Kryo-Elektronentomographie.

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung von Kryolamellen aus tiefgefrorenen Gittern von Plasmodium falciparum-infizierten humanen Erythrozyten vorgestellt, das leicht für andere biologische Proben adaptiert werden könnte. Die Grundprinzipien für die Probenvorbereitung, das Fräsen und die Betrachtung von Lamellen sind allen Instrumenten gemeinsam, und das Protokoll kann als allgemeiner Leitfaden für die netzgekoppelte Kryo-Lamellenpräparation für die Kryo-Elektronenmikroskopie (KryoEM) und Kryo-Elektronentomographie (KryoET) befolgt werden. Elektronenmikroskopische Gitter, die die Zellen stützen, werden mit einem manuellen oder automatischen Gefrierschrank in flüssiges, stickstoffgekühltes flüssiges Ethan eingefroren und dann auf einem Lichtmikroskop mit Kryotisch gescreent. Gefrorene Gitter werden in ein Kryo-Rasterelektronenmikroskop überführt, das mit einem fokussierten Ionenstrahl (cryoFIB-REM) ausgestattet ist. Die Gitter werden vor dem Fräsen routinemäßig gesputtert, was die Verteilung des Ladungsaufbaus während des Fräsens unterstützt. Alternativ kann mit einem E-Beam-Rotationsbeschichter eine Schicht aus Kohlenstoff-Platin auf die Gitter aufgetragen werden, deren exakte Dicke genauer gesteuert werden kann. Im Inneren des CryoFIB-REM wird eine zusätzliche Beschichtung einer Organoplatinverbindung über ein Gasinjektionssystem (GIS) auf die Oberfläche des Gitters aufgebracht. Diese Schicht schützt die Vorderkante der Lamelle beim Fräsen, deren Unversehrtheit entscheidend für gleichmäßig dünne Lamellen ist. Die interessierenden Bereiche werden mittels REM identifiziert und das Fräsen erfolgt schrittweise, wobei der Strom des Ionenstrahls reduziert wird, wenn die Lamelle Elektronentransparenz erreicht, um eine übermäßige Wärmeentwicklung zu vermeiden. Ein Gitter mit mehreren Lamellen wird dann unter kryogenen Bedingungen in ein Transmissionselektronenmikroskop (TEM) überführt, um eine Tilt-Serienaufnahme zu ermöglichen. Ein robuster und kontaminationsfreier Arbeitsablauf für die Lamellenpräparation ist ein wesentlicher Schritt für nachgelagerte Techniken, einschließlich zellulärer KryoEM, KryoET und Subtomogramm-Mittelung. Die Entwicklung dieser Techniken, insbesondere für das Herausheben und Mahlen von unter hohem Druck gefrorenen Proben, hat in diesem Bereich hohe Priorität.

Einleitung

Nur der zelluläre Inhalt biologischer Proben <500 nm Dicke) kann durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bei kryogenen Temperaturen effektiv abgebildet werden, wodurch der Probenbereich auf Viren, Prokaryoten, einfache einzellige Organismen und dünnere Regionen größerer eukaryotischer Zellen beschränkt^{wird 1}. Das rasterfokussierte Ionenstrahl-Mahlen (FIB) ermöglicht die Verdünnung dickerer, tiefgefrorener biologischer Proben zu elektronentransparenten Lamellen bei kryogenen Temperaturen (< -150 °C). Die resultierenden Lamellen werden dann zur Visualisierung und tomographischen Datenerfassung in ein TEM übertragen, was hochauflösende 3D-Rekonstruktionen der zellulären und molekularen Merkmale im Inneren von Zellen ermöglicht (für Übersichtsarbeiten siehe Rigort et al., 2012², Oikonomou et al., 2016³, und Wagner et al., 2020⁴).

Das FIB-Fräsen ist aus dem Bereich der Materialwissenschaften hervorgegangen, wo Proben routinemäßig verdünnt werden, um sie für die nachgelagerte Analyse vorzubereiten⁵. Sie wird in einem Rasterelektronenmikroskop (REM) durchgeführt, das über zwei optische Säulen verfügt: eine herkömmliche Rasterelektronenmikroskopoptik und eine zweite Säule mit Optiken, die in der Lage sind, einen fokussierten Ionenstrahl (FIB) zu erzeugen und fein zu steuern - ein sogenanntes FIB-REM. Auf diese Weise kann ein bestimmter Bereich der Probe durch Ionen abgetragen werden, die von einer Galliumquelle erzeugt werden, wodurch überschüssiges Material entfernt wird und eine Lamelle⁶ zurückbleibt. Der Fräsprozess wird durch REM-Aufnahmen der Topografie der Probe gesteuert, die zur Lokalisierung von interessanten Bereichen und zur Überwachung des Fräsfortschritts verwendet werden. Für biologische Anwendungen ist der Grundaufbau weitgehend derselbe, aber die Vermahlung erfolgt bei kryogenen Temperaturen. Dies erforderte, dass Standard-FIB-REMs so angepasst wurden, dass sie über kryogekühlte Tische verfügen, die konstante Temperaturen und niedrige Oberflächenkontaminationsraten aufrechterhalten, sowie über Luftschleusen, um den Probentransfer ohne Entglasung oder Kontamination zu erleichtern. Die Probenshuttles wurden ebenfalls modifiziert, um die Montage einer Reihe verschiedener Träger im Inneren des KryoFIB-REM zu ermöglichen, darunter TEM-Gitter, Planchetten und Kapillaren. Mehrere Schlüsselgruppen von Forschern waren von zentraler Bedeutung für die Entwicklung dieser Methoden und den kontinuierlichen technologischen Fortschritt in diesem Bereich 7,8,9,10,11,12. Kommerzielle Lösungen für das biologische FIB-Mahlen bei kryogenen Temperaturen sind jetzt in größerem Umfang verfügbar, und das Fräsen von Lamellen am Netz wird bei einer optimierten Probe immer routinemäßiger.

Eine Reihe von Raumtemperatur- und Kryo-EM-Techniken können verwendet werden, um zelluläre Informationen auf allen Ebenen des Lebens zu visualisieren, von ganzen mehrzelligen Organismen mit bescheidener Auflösung über das Verständnis des Kontexts komplexer Prozesse auf zellulärer Ebene und noch detaillierter bis hin zur Bestimmung von in situ Molekulare Strukturen^{13,14,15,16,17,18,19}. Zu den klassischen Raumtemperaturtechniken gehören das Schneiden von fixierten und gefärbten, in Harz eingebetteten Zellen und Geweben durch Ultramikrotomie zur Analyse der zellulären Morphologie mittels TEM (für eine Übersicht siehe Studer et al., 2008²⁰). Es wurden alternative Techniken entwickelt, die die Sekundärelektronenstreuung durch REM nutzen, um die Oberfläche von Blöcken konservierter Zellen abzubilden, bevor das Material entweder mit einem Messer (serielle Blockflächenbildgebung) oder einem fokussierten Ionenstrahl schrittweise entfernt wird^21,22,23. Diese Technik wurde auch erfolgreich bei kryogenen Temperaturen (als Kryo-Volumen-Bildgebung bezeichnet) mit einem KryoFIB-REM an glasartigen, ungefärbten Zell- oder Gewebeblöcken eingesetzt²⁴. Alternativ können dickere Lamellen (~15 μm dick) gefräst und mittels STEM-Bildgebung untersucht werden²⁵. Mit diesen Techniken können ganze Blöcke mit vielen Zellen abgebildet werden, um Populationsinformationen zu sammeln, oder ein ganzes Organ/Organismus kann abgebildet und in 3D rekonstruiert werden. Um jedoch auf hochauflösende molekulare Informationen aus Zellen zugreifen zu können, müssen die Proben in einem nahezu nativen, gefrorenen hydratisierten Zustand konserviert und daher unter kryogenen Bedingungen präpariert werden. Die Kryo-Elektronenmikroskopie von Glaskörperschnitten (CEMOVIS) ist eine Technik, bei der unter hohem Druck gefrorene Blöcke aus biologischem Material unter kryogenen Bedingungen mit einem Ultramikrotom geschnitten werden. Dabei entstehen Bänder aus Kryoschnitten (40-100 nm dick)²⁶, die an einem EM-Gitter befestigt und im TEM abgebildet werden. Die physikalische Wechselwirkung des Messers mit der Glaskörperprobe verursacht jedoch Spalten- und Kompressionsartefakte, die die Zellstruktur stark verzerren können^27,28,29,30. Dickere Abschnitte sind anfälliger für diese Artefakte, was es unpraktisch macht, Abschnitte zu verwenden, die dicker als ~70 nm sind²⁶. Diese Einschränkung schränkt die 3D-Ansicht der biologischen Struktur im Tomogramm stark ein. Beim FIB-Fräsen bei kryogenen Temperaturen treten diese Probleme nicht auf, sondern es gibt eigene Artefakte, die durch unterschiedliche Mahlraten in Teilen der Probe verursacht werden, was zu unterschiedlichen Dicken innerhalb einer Lamelle führt - dem sogenannten Curtaining. Dieses Problem wird durch das Auftragen einer Organoplatinbeschichtung entschärft, die über ein Gasinjektionssystem (GIS) aufgetragen wird und die Vorderkante der Lamelle während des Fräsens schützt³¹. Die Obergrenze der Probendicke für das On-Grid-FIB-Fräsen wird durch die Fähigkeit definiert, die Probe einzutauchen und gleichzeitig glasig zu halten³², obwohl mit der Einführung von Kryo-Lift-out-Techniken und angepassten Probenträgern für biologische Proben das FIB-Mahlen auch zur Verarbeitung von unter hohem Druck gefrorenen Proben eingesetzt werden kann^31,33,34,35. Darüber hinaus dürfen gefrorene Proben nicht zu dünn sein, da genügend biologisches Material vorhanden sein muss, um eine Lamelle von angemessener Größe zu erzeugen, die genügend Oberfläche bietet, um Kippreihen bei der erforderlichen Vergrößerung zu sammeln. Dieses Problem kann durch das Mahlen von Klumpen kleinerer Zellen wie Bakterien oder Hefen gelindert werden. Die endgültige Lamellendicke (~100-300 nm) wird in der Regel durch die Probenintegrität und die Frässtrategie bestimmt. Dünnere Lamellen eignen sich besser für hochauflösende strukturelle Arbeiten, wie z. B. die Sub-Tomogramm-Mittelung, aber dickere Lamellen enthalten viel größere Zellvolumina, als mit CEMOVIS erreicht werden können, und bieten mehr zellulären Kontext in einer nahezu nativ erhaltenen Probe. Das FIB-Mahlen kann auch verwendet werden, um tiefgefrorene Proteinkristalle für Elektronenbeugungsstudien zu verdünnen³⁶.

Das FIB-Fräsen von Glaskörperzellen ist die Zeit und Mühe wert, wenn die wissenschaftliche Fragestellung hochauflösende molekulare Details von nahezu nativen Proben in situ erfordert. Mit dem Zugang zu mehr Einrichtungen für die routinemäßige Herstellung von Lamellen ist der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt oft die Optimierung der Probe vor dem Fräsen, bei der Zeit genommen werden muss, um sicherzustellen, dass die Probe glasig ist und eine angemessene Dicke aufweist, um robuste und gleichmäßig dünne Lamellen zu erzeugen. Hier wird die Probenoptimierung für das FIB-Fräsen von eingefrorenen menschlichen roten Blutkörperchen beschrieben, die mit Plasmodium falciparum-Parasiten , dem Erreger von Malaria, infiziert sind, aber dieser Ansatz könnte für jede beliebige Probe angepasst werden.

Protokoll

Menschliches Blut wurde von anonymisierten Spendern über den britischen National Blood and Transplant Service gewonnen und wird innerhalb von 2 Wochen nach Erhalt verwendet. Für die Verwendung ist keine ethische Genehmigung erforderlich.

1. Präparation und Einfrieren von mit Plasmodium falciparum infizierten roten Blutkörperchen

1. Isolierung reifer Schizonten durch Zentrifugation (1.580 x g) über ein isotonisches Dichtegradientenmedium mit 70 % (v/v) (für Standardverfahren zur Kultivierung asexueller Blutstadien von 3D7 Plasmodium falciparum in menschlichen Erythrozyten siehe Blackman, M.J., 1995,³⁷).
2. Fixieren Sie die luftgetrockneten dünnen Blutfilme auf einem Objektträger mit 100 % Methanol, um die morphologische Homogenität der Schizonten zu überprüfen, bevor Sie sie mit 10 % Giemsa-Färbung in 6,7 mM Phosphatpuffer, pH 7,1, färben.
   ANMERKUNG: Um die Vorbereitung für Schizonten, die an bestimmten Austrittspunkten blockiert sind, zu bereichern, können Schizonten weiter mit Compound-2- und E64-Inhibitoren synchronisiert werden (siehe Repräsentative Ergebnisse und Abbildung 1 für eine Erklärung der Wirkung dieser Inhibitoren).
   ACHTUNG: Plasmodium falciparum ist ein humanpathogener Krankheitserreger und darf nur in einer geeigneten Sicherheitseinrichtung gemäß den örtlichen Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien gehandhabt werden.
3. Schizonten (240 x g) vorsichtig zentrifugieren, um sie zu pelletieren, und resuspendieren 2x Volumen des Zellpellets des RPMI-Mediums, was zu einer 50%igen Hämatokrit-Suspension führt.
4. Tragen Sie auf einer manuellen Tauchgefrieranlage 2,5 μl Schizonten auf die Kohlenstoffseite eines glühentladenen (Verwenden Sie die Einstellungen der Glimmentladungseinheit von 60 s, 30 mA in Luft, behandeln Sie nur die Kohlenstoffseite des Gitters) 200-Mesh-Kupfergitter mit einem 2/4 löchrigen Kohlenstofffilm auf und tupfen Sie ~ 20 s lang von der Rückseite des Gitters mit Filterpapier der Güteklasse 1 mit einer zerrissenen Kante ab. Tauchen Sie in flüssiges, stickstoffgekühltes flüssiges Ethan ein und überführen Sie die Gitter in den Speicher (siehe Materialtabelle für die in dieser Studie verwendeten Geräte).
   HINWEIS: Das Experiment kann hier pausiert werden, und Gitter können auf unbestimmte Zeit unter flüssigem Stickstoff gespeichert werden.
   VORSICHT: Flüssiger Stickstoff ist ein Erstickungsmittel und verursacht Erfrierungen; Vorsichtig in einer geeigneten Umgebung mit Sauerstoffüberwachung behandeln.
   ACHTUNG: Flüssiges Ethan verursacht schwere Verbrennungen und ist brennbar; Verwendung in einem Abzug fern von Zündquellen.
   HINWEIS: Eingetauchte gefrorene Schizonten sind nicht mehr lebensfähig. Dies wurde durch Inkubation von menschlichem Blut mit mehreren Goldgittern von luftaufgetauten, tiefgefrorenen Schizonten ermittelt und nach mehreren Tagen im Vergleich zu nicht gefrorenen Kontrollen kein Parasitenwachstum beobachtet. Gefrorene Schizontengitter können daher außerhalb von Sicherheitseinrichtungen unter Verwendung der üblichen Sicherheits- und Dekontaminationsverfahren (Handschuhe, Oberflächen-/Werkzeugsterilisation mit >70 % Ethanol und Entsorgung von Gittern mit >70 % Ethanol) sicher gehandhabt werden.
5. Siebgitter mit einem Kryotisch für ein Lichtmikroskop unter besonderer Berücksichtigung des Eisgradienten über das Gitter. Überprüfen Sie in den dünneren Bereichen des Eises die einzelnen Gitterquadrate auf Zellbedeckung.
   HINWEIS: Die besten Quadrate sollten in der Mitte des Rasterquadrats eine Zelle dick sein (Abbildung 2). Dadurch wird sichergestellt, dass eine Lamelle quer über die Mitte des Quadrats gefräst werden kann, ohne das dickere Eis an den Rändern gegen die Gitterstäbe zu schlagen. Hier kann das Experiment pausiert werden, und Gitter können auf unbestimmte Zeit unter flüssigem Stickstoff gelagert werden. Wenn Zellen einen Fluoreszenzmarker tragen, können Gitter auch mit cryoCLEM gescreent werden, um relevante X/Y-Positionen zu lokalisieren, die mit Gitterpositionen im KryoFIB-REM korreliert werden können, um das Fräsen zu steuern.

2. On-Grid-FIB-Fräsen von tiefgefrorenen Tauchzellen

1. Markieren Sie die Vorderseite der CryoFIB-spezifischen Autogrid-Felgen mit einem schwarzen, unauslöschlichen Markierungsstift, um die Mitte des Ausschnitts und die gegenüberliegende Seite der Felge anzuzeigen (Abbildung 3). Richten Sie die Clipstation ein und clippen Sie die Gitter mit der Carbonseite nach unten in die markierten Ringe.
2. Laden Sie die Gitter mit der Kohlenstoffseite nach oben in das CryoFIB-REM-Shuttle (typischerweise 2 Gitter, je nach Shuttle) und tragen Sie eine Platin-Sputterschicht in einer Argonatmosphäre (5 x ^10-2 mbar) (5 mA für 60 s - Dicke ist variabel) oder eine Kohlenstoff/Platin-E-Beam-Rotationsschicht (~4 nm Dicke) auf die Oberfläche der Zellen auf.
   HINWEIS: Beide Arten von Beschichtungen unterstützen die Ladungsverteilung während der REM-Bildgebung. Der Vorteil des e-beam Rotationsbeschichters besteht darin, dass die exakte Dicke der Beschichtung vorgegeben werden kann.
3. Laden Sie das Shuttle in das kryoFIB-REM und beurteilen Sie die Zellverteilung auf jedem Gitter mittels REM bei 5 kV (13 pA oder 25 pA). Machen Sie eine Übersicht mit geringer Vergrößerung (~100x), um die Eisgradienten im Gitter zu betrachten. Nehmen Sie dann Bilder mit höherer Vergrößerung (~5.000-fach) auf, um einzelne Rasterquadrate zu betrachten und die Bereiche des Gitters mit sichtbaren zellulären Merkmalen und geringer Oberflächenkontamination zu identifizieren, die gefräst werden sollen.
4. Mit dem Gasinjektionssystem (GIS) wird eine >2 μm Organoplatinschicht auf die Oberfläche jedes Gitters aufgetragen. Führen Sie dazu die GIS-Nadel in die Kammer über dem Gitter ein und erwärmen Sie die Organoplatinquelle für eine bestimmte Zeit auf eine eingestellte Temperatur (z. B. ~27 °C für 3-10 s), um einen Dampfstrom zu erzeugen.
   HINWEIS: Der Anwendungswinkel, die Temperatur und das Timing der Organoplatinbeschichtung über die GIS-Nadel sollten optimiert werden, um eine gleichmäßige Beschichtung zu maximieren. Dies hängt vom verwendeten KryoFIB-REM ab (weitere Erläuterungen finden Sie unter Repräsentative Ergebnisse ).
5. Kippen Sie die Probe so, dass die Ebene des Gitters ~10° vom Einfallswinkel des Ionenstrahls entfernt ist, und verschieben Sie die Mitte eines geeigneten Gitterquadrats, das sowohl in den REM- als auch in den FIB-Bildern zu sehen ist.
6. Untersuchen Sie das Gitter mit dem Ionenstrahl bei niedrigem Strom (nominell 1,5 pA, 30 kV) und gehen Sie zu einer ausreichend hohen Vergrößerung (~7.000x), um die Zellen in der Mitte eines Gitterquadrats sichtbar zu machen. Bringen Sie die Probe beim ersten Frässtrom (300 pA) in den Fokus und korrigieren Sie sie auf Astigmatismus. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast an und markieren Sie dann zwei rechteckige Muster, die gefräst werden sollen, eines über und eines unter einem 3 μm dicken geschützten Bereich, dessen Mitte die gewünschte Position der endgültigen Lamelle ist.
   HINWEIS: Die gewählte Breite der Muster hängt von der Topografie der umgebenden Zellschicht und der Zellgröße ab. 7-20 μm ist eine geeignete Breite für Schizonten, aber breitere Lamellen brauchen länger zum Fräsen. Die gewählte Höhe der Muster für den ersten Frässchritt hängt von der Probendicke ab und beginnt bei etwa 6 μm; Dies muss ggf. während des Fräsens angepasst werden. Das Fräsen erfolgt gerichtet von der äußeren Ober- und Unterkante der Muster in Richtung der Lamellenfläche. Dies kann parallel erfolgen, wobei beide Muster gleichzeitig oder nacheinander gefräst werden, wobei zuerst Material von oben und dann von unten entfernt wird.
7. Beginnen Sie mit dem Fräsen beim ersten Strom; Überwachen Sie den Live-Fortschritt in der Ionenstrahlansicht und intermittierend per REM (5 kV, 13 oder 25 pA). Prüfen Sie, ob der Ionenstrahl die Probe ober- und unterhalb des geschützten Bereichs durchbrochen hat. Wenn nicht, erhöhen Sie die Höhe der rechteckigen Muster, um mehr Material zu entfernen. Stoppen Sie, wenn die Oberfläche ober- und unterhalb der Lamelle in der Ionenstrahlansicht vollständig glatt ist.
   ANMERKUNG: Der Ionenstrahl hat die Probe ober- und unterhalb des geschützten Bereichs durchbrochen, wenn das Innere der rechteckigen Muster keine Merkmale in der Brennebene enthält. Einige Funktionen, wie z. B. Rasterleisten, sind möglicherweise unscharf im Hintergrund sichtbar.
8. Wechsel auf den nächsten Frässtrom (100 pA); Fokussieren Sie und passen Sie die Helligkeit/den Kontrast an. Verringern Sie den Abstand zwischen den beiden rechteckigen Mustern auf 1,5 μm und verringern Sie die Musterhöhe, um nur das ungefräste Material abzudecken. Beginnen Sie mit dem Fräsen mit dem neuen Strom, bis die Oberfläche ober- und unterhalb der Lamelle vollständig glatt ist.
9. Wiederholen Sie diesen Vorgang schrittweise, bis eine Dicke von 0,3 μm erreicht ist, wobei der Ionenstrahlstrom jedes Mal gemäß dem Frässchema in Tabelle 1 reduziert wird.
10. Fräsen Sie mehrere Lamellen (die Menge ist abhängig von der Dicke der Probe und der zur Verfügung stehenden Zeit) auf einem oder beiden Gittern auf eine Dicke von 0,3 μm, notieren Sie die X/Y/Z-Position jeder Lamelle und reservieren Sie am Ende der Sitzung ~1-2 h, um die Lamellen auf ihre endgültige Dicke (60-200 nm) zu polieren.
11. Verschaffen Sie sich einen REM-Überblick über das gesamte Gitter bei geringer Vergrößerung und planen Sie eine Polierroute, die von den Lamellen an der Vorderseite des Gitters (näher an der Ionenstrahlquelle) bis zu den Lamellen am hinteren Teil des Gitters (am weitesten von der Ionenstrahlquelle entfernt) beginnt (Abbildung 5).
    Anmerkungen: Dadurch wird die erneute Ablagerung von abgetragenem Material auf der Oberfläche von polierten Lamellen reduziert.
12. Reduzieren Sie den Abstand zwischen den beiden rechteckigen Mustern auf 100-200 nm und beginnen Sie den letzten Polierschritt mit einem Ionenstrahlstrom von 30 pA. Überwachen Sie den Fortschritt durch REM bei 2-3 kV (13 pA, Verweilzeit = 300 n, 3072 x 2048, ~2 s für ein Vollformat) und stoppen Sie das Polieren, wenn der Kontrast in der Lamelle durch das REM verloren geht oder wenn die Organoplatinschicht der Lamelle selbst an Integrität verliert.
13. Bevor Sie die Gitter entfernen, nehmen Sie ein REM-Bild des gesamten Gitters mit geringer Vergrößerung auf und speichern Sie Bilder von jeder Lamelle. Verwenden Sie sie, um das Raster später im TEM zu überprüfen. Unterbrechen Sie hier das Experiment und lagern Sie die Gitter mit Lamellen unter flüssigem Stickstoff - vorsichtig behandeln.
    Anmerkungen: Die Gitter können bei der Entnahme aus dem CryoFIB-REM leicht gesputtert werden, was dazu beitragen kann, die Drift und Aufladung im TEM bei hoher Vergrößerung zu begrenzen, aber dies sollte mit Vorsicht erfolgen, da zu viel Sputterbeschichtung den biologischen Inhalt in den Lamellen verdecken kann. In diesem Stadium ist es möglich, Lamellen auf Fluoreszenz zu untersuchen. Um ein ausreichendes Signal zu erhalten, hängt es jedoch von der Häufigkeit des markierten Proteins innerhalb der Dicke der Lamelle ab. Bei der Handhabung der Gitter ist große Vorsicht geboten, um Schäden an den Lamellen zu begrenzen und Oberflächenverunreinigungen zu vermeiden.

3. Tilt-Serienerfassung und allgemeiner Überblick über die Datenverarbeitung

1. Laden Sie die Gitter in den TEM und richten Sie die Fräsrichtung senkrecht zur Neigungsachse des Tisches aus.
   Anmerkungen: Die Ausrichtung der Gitter erfolgt mit dem Auge anhand der Markierungen auf dem Autogrid-Rand. Eine Fehlerspanne von ~10° ist akzeptabel, da sonst die Wände des Grabens auf beiden Seiten der Lamelle die Lamelle verdecken können, wenn das Gitter geneigt wird.
2. Erfassen Sie eine Karte mit geringer Vergrößerung (~150x) des gesamten Gitters und lokalisieren Sie die Lamellen. Erfassen Sie dann eine Karte mit mittlerer Vergrößerung (~1.500x, abhängig von der Lamellengröße) jeder Lamelle und lokalisieren Sie die interessierenden Bereiche.
3. Kippen Sie das Gitter um ±10°, um die Ebene der Lamelle (nicht das Gitter) senkrecht zur optischen Achse zu machen
   HINWEIS: Die Richtung der Vorneigung kann durch die Position der Vorderkante der Lamellen (auf der Suche nach der übrig gebliebenen Organoplatinschicht) in den Karten mit niedriger und mittlerer Vergrößerung bestimmt werden. Für das hier verwendete TEM benötigen Gitter eine Vorneigung von +10°, wenn die Vorderkanten der Lamellen in den Karten nach oben zeigen, und eine Vorneigung von -10°, wenn sie nach unten zeigen. Jedes Raster kann unterschiedlich sein, je nachdem, wie es aufgenommen und in den Autoloader eingefügt wurde.
4. Erfassen Sie die dosissymmetrische Neigungsreihe³⁸ (z. B. -54° bis +54° mit einem Inkrement von 3-5°) mit einer Pixelgröße, die sowohl das Sichtfeld als auch die Auflösung ermöglicht, die für den interessierenden Bereich erforderlich ist. Verwenden Sie einen Bereich von Unschärfewerten zwischen -2 und -5 μm. Sammeln Sie Filme mit 3-10 Bildern in jedem Schritt und passen Sie dazu diese Parameter je nach Pixelgröße an, um eine Gesamtdosis von ~150 e^-/Ų (für ein 300 kV TEM) zu akkumulieren.
   Anmerkungen: Risse in der Lamelle sollten vermieden werden, da diese Bereiche abdriften können. Oberflächenverunreinigungen sollten ebenfalls vermieden werden, da sie den interessierenden Bereich oder den Fokusbereich bei hoher Neigung verdecken können.
5. Korrigieren Sie die Filme mit einem Programm wie MotionCor2³⁹. Wenden Sie einen Dosisgewichtungsfilter auf die korrigierten Bilder (akkumuliertes e^-/Bild)⁴⁰ an und schätzen Sie die Unschärfe jedes Bildes mit einem Programm wie CTFFIND4⁴¹.
6. Verwenden Sie Fiducial-less Alignment (Patch Tracking) in einem Programm wie z.B. bei etomo (IMOD)⁴² , um die Ausrichtung und Winkelbeziehung der Bilder in Tilt-Serien zu berechnen.
7. Geben Sie die Ausrichtungs- und Rotationsinformationen zusammen mit den Unschärfewerten in ein Programm ein, das eine dreidimensionale CTF-Korrektur anwenden kann, z. B. NovaCTF⁴³. Berechnen Sie ein korrigiertes Tomogramm, um Ausgabetomogramme mit Binning-Faktoren zu erhalten, die für die nachgelagerte Analyse relevant sind.
8. Analysieren Sie die Rekonstruktionen und bereiten Sie sich auf eine nachgelagerte Verarbeitung vor, z. B. Filterung, Segmentierung oder Sub-Tomogramm-Mittelung.

Ergebnisse

Vorbereitung von P. falciparum schizonts für das Einfrieren
Compound-2- und E64-Inhibitoren werden verwendet, um Schizonten in verschiedenen Stadien des Ausstiegs aufzuhalten, wodurch eine angereicherte Population von Schizonten für nachfolgende Studien generiert wird. Dies ist wichtig, da ohne eine komplementäre korrelative Technik das Fräsen spezifischer subzellulärer Ziele oder Zelltypen eine Herausforderung darstellt, da der Prozess im Wesentlichen blind ist. Verbindung 2 ist ein Proteinkinase-Inhibitor, der den Austritt vor der Vakuolenruptur aufhält. Schizonten können 4 h lang mit Verbindung 2 synchronisiert und dann mit verbindungs-2-freien Medien gewaschen werden, um den Inhibitor zu entfernen, woraufhin die Schizonten reifen und nach ca. 30 Minuten austreten. Alternativ können Compound-2-synchronisierte Schizonten in E64, einen irreversiblen Breitspektrum-Cystein-Protease-Inhibitor, gespült und etwa 1 h lang inkubiert werden, um den Austritt nach dem Punkt der Vakuolenruptur, aber vor der Ruptur der Wirtszelle zu stoppen. Die Morphologie und Homogenität der behandelten Schizonten sollte vor dem Einfrieren durch Giemsa-gefärbte Blutausstriche überprüft werden (Abbildung 1). Schizonts können in beiden Zuständen mit der in dieser Publikation beschriebenen Methode eingefroren werden.

Abbildung 1: Die Morphologie von Verbindung 2 und E64-gestallten P. falciparum schizonts durch Giemsa-gefärbte Blutausstriche. (A) In Gegenwart von Verbindung 2 ist die parasitophore Vakuole (PV) dicht gepackt mit Merozoiten (violette Kreise) mit einer einzigen Ansammlung von Hämozoinkristallen (dunkelbrauner Kreis). Die Grenze zwischen dem PV und dem umgebenden Hämoglobin in den roten Blutkörperchen des Wirts (hRBC) (graues Band) ist gut definiert, ebenso wie die hRBC-Membran. (B) In Gegenwart von E64 wird die PV-Membran gerissen und die Merozoiten verteilen sich innerhalb des hRBC. Jeder Schizont enthält immer noch eine einzelne Ansammlung von Hämozoinkristallen. Die Wirtszellmembran ist undicht und teilweise kollabiert, daher ist in der Zellperipherie kein Hämoglobin sichtbar und die Grenze der hRBC-Membran ist nicht leicht sichtbar. Maßstabsbalken, 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Optimierung des Tauchfrostens
Während der Optimierung der Blotting-Bedingungen für P. falciparum-infizierte rote Blutkörperchen wurde eine Reihe von Gittern mit unterschiedlichen Lochgrößen getestet, darunter 2/2, 3/3, 3,5/1 und 5/2 (quadratischer) löchriger Kohlenstoff auf Gold- und Kupfergittern mit 200 Maschen. 200-Maschen-Kupfer-Suchergitter mit 2/4 löchrigem Kohlenstofffilm bieten eine entsprechend dicke Zellschicht zum Fräsen langer Glaskörperlamellen. Größere oder kleinere Löcher führten in der Regel zu zu dünnen bzw. zu dicken Zellschichten (Abbildung 2A-C). Bei 2/4 löchrigem Kohlenstoff werden Schizonten durch die 2-μm-Löcher gezogen, indem das Gitter von hinten (Nicht-Kohlenstoff-Seite) abgetupft wird, was dazu führt, dass Zellen über und unter dem Kohlenstofffilm herausragen. Die 4 μm lange Kohlenstoffstrecke zwischen den Löchern führt zu einem Kohlenstoffstreifen, der durch die Mitte der meisten der resultierenden Lamellen verläuft und die Festigkeit erhöht. Suchergitter eignen sich am besten für Korrelations- und Rasterzwecke⁴⁴, aber es muss darauf geachtet werden, dass die Zahlen/Buchstaben im Netzdesign nicht zu groß sind, da dies Bereiche zum Fräsen blockiert.

Die Löschzeit auf einem manuellen Kolben beträgt ungefähr 20 s, aber der genaue Punkt, an dem das Ablöschen gestoppt werden sollte, wurde mit dem Auge beurteilt, wenn sich der Flüssigkeitstropfen, der aus dem Gitter gezogen wurde, nicht mehr auf dem Filterpapier ausbreitete. Eine gerissene Kante war erforderlich, um die Oberflächenspannung des Tropfens zu brechen und den Blotting-Prozess zu starten. Ein automatisierter Gefrierschrank wurde in dieser Studie nicht verwendet, aber ein vernünftiger Ausgangspunkt für diese Probe wäre, das gleiche Volumen an Zellen und den gleichen Gittertyp wie für einen manuellen Kolben zu verwenden, wobei darauf zu achten ist, dass die Gitter bei hoher Luftfeuchtigkeit (~70 %) und Umgebungstemperatur (~25 °C) von hinten abgetupft werden. Die Blotting-Zeiten und -Bedingungen müssten für das jeweilige automatisierte System optimiert werden.

Gefrorene Gitter von P. falciparum schizonts wurden nicht mit TEM, sondern mit einem Lichtmikroskop untersucht, das mit einem Kryotisch ausgestattet war, da die Probe nicht auf Elektronen übertragbar war. Bei dünneren Proben können die Gitter vor dem Probentransfer in das KryoFIB-REM mittels TEM (Gesamtgitteratlas bei ~150-facher Vergrößerung) gescreent werden, was eine Voraussetzung für den Zugang zu einer nationalen Einrichtung sein kann. Besonderes Augenmerk sollte auf den Gradienten der Eisdicke über das Gitter und auch innerhalb einzelner Gitterquadrate gelegt werden. Gute Gitterquadrate sollten eine Zelle dick sein oder den Kohlenstofffilm in ihrer Mitte treffen (Abbildung 2C). Dadurch wird vermieden, dass das dickere Eis gegen die Gitterstäbe am Rand des Gitterquadrats gefräst wird, und es wird sichergestellt, dass der Ionenstrahl ober- und unterhalb der Zellschicht durchbricht, wodurch eine freie Lamelle anstelle eines Keils entsteht. Sobald die reproduzierbaren Blotting- und Tauchfrostbedingungen optimiert sind, ist eine Siebung vor dem FIB-Fräsen in der Regel nicht mehr erforderlich.

Abbildung 2. Analyse der Zellverteilung auf Gittern von tiefgefrorenen P. falciparum schizonts mittels Kryo-Lichtmikroskopie. (A) Ein Beispiel dafür, dass Eis in einem Gitterquadrat durch Kryolichtmikroskopie zu dick ist und die Zellen und den Kohlenstofffilm verdeckt. Maßstabsbalken, 10 μm. (B) Ein Beispiel dafür, dass die Lochgröße (300-Maschen-Kupfergitter mit 5/2 quadratisch löchrigem Kohlenstofffilm) zu groß für die Zellen ist, was zu einer sehr dünnen Schicht biologischen Materials führt, die von leeren Regionen ohne Eis umgeben ist. Solche Gitter erzeugen sehr kurze, instabile Lamellen. Maßstabsbalken, 10 μm. (C) Ein Beispiel für eine gute Zellverteilung auf einem 200-Mesh-Kupfergitter mit 2/4 löchrigem Kohlenstofffilm. Diese Schizonten wurden mit E64-Inhibitoren behandelt. Die großen Zellen (roter Kasten, ~5 μm Durchmesser) mit einer gut definierten Peripherie sind infizierte rote Blutkörperchen, die noch eine intakte Vakuolenmembran haben. Die Ansammlungen kleiner Zellen (blauer Kasten, ~1 μm) sind die einzelnen Merozoiten, die in einem teilweise kollabierten roten Blutkörperchen des Wirts enthalten sind. Jeder Schizont hat einen schwarzen Fleck in der Mitte, der die Position der Hämozoinkristalle anzeigt (siehe Abbildung 1 für weitere Details). Der Unterschied in der Zellmorphologie ist nicht so leicht zu erkennen, wenn man sich einmal im KryoFIB-REM befindet. Daher ist ein Vorscreening mittels Kryo-Lichtmikroskopie von Vorteil, bis reproduzierbare Blotting-Bedingungen erreicht sind. Die Zellenabdeckung an den Rändern des Rasterquadrats neben den Rasterbalken (weiß gestrichelte Bereiche) ist zu dick zum Fräsen. Der dünnere Bereich in der Mitte des Gitterquadrats (gelb gestrichelter Bereich) ist ein idealer Ort, um von dort aus zu fräsen, wodurch die Lamelle in die umgebende Zellschicht verlängert wird. Maßstabsbalken, 6 μm. (D) Abbildung eines KryoFIB-spezifischen Autogrid-Randes mit zwei schwarzen Markierungen, eine innerhalb des Cutaway-Abschnitts (schwarze Klammer) und die andere gegenüber, bei 12 Uhr und 6 Uhr. Der schwarze Pfeil stellt die Fräsrichtung dar. (E) Wenn die Gitter in die Autoloader-Kassette geladen werden, müssen die Markierungen auf beiden Seiten der Ladepinzette gleich weit voneinander entfernt sein, was dazu führt, dass die Lamellen senkrecht zur Neigungsachse des Tisches liegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Markierung von KryoFIB-spezifischen Autogrid-Rändern für die Tomographie
In der Regel werden die Gitter vor dem Fräsen in die Autogrid-Felgen geklipst, um die Handhabung zu erleichtern und die Steifigkeit zu erhöhen, die die Lamellen vor Beschädigungen während der nachfolgenden Transferschritte schützt. CryoFIB-spezifische Autogrid-Felgen wurden mit einer Cutaway-Funktion ausgestattet, um beim Fräsen einen größeren Zugang zur Gitterfläche zu ermöglichen. Es ist wichtig, die Fräsrichtung senkrecht zur Kippachse des TEM so auszurichten, dass die Erfassung der Neigungsreihe durch Drehen der Lamelle entlang ihrer Länge erfolgt. Dadurch wird sichergestellt, dass die hohen Wände des Grabens, der die Lamelle umgibt, die biologischen Informationen nicht verdecken, wenn das Gitter gekippt wird.

In der Regel ist der Autogrid-Rand markiert, um die visuelle Ausrichtung innerhalb des CryoFIB-REM-Shuttles und später beim Laden des TEM zu erleichtern. Für diese Proben wurden zwei Markierungen bei 12 Uhr und 6 Uhr mit einer unauslöschlichen Markierung angebracht (siehe Materialtabelle), eine in der Mitte des Ausschnitts des Cliprings und die zweite direkt gegenüber (Abbildung 2D). Beim Laden in das TEM (siehe Materialtabelle) sollten beide Markierungen auf beiden Seiten der Ladepinzette sichtbar sein und 90° zum Rand der Pinzette ausgerichtet sein (Abbildung 2E). Es ist zu beachten, dass der Hersteller empfiehlt, die Raster anhand der eingravierten Punkte auf den Autogrid-Rändern auszurichten, da bestimmte Tinten in der Nähe des Ionenstrahls das Fräsen stören können.

Beschnittene Gitter können lichtmikroskopisch mit einer modifizierten Kassette für einen Kryotisch gescreent werden, was von Vorteil sein kann, um zu überprüfen, ob der Clipping-Prozess den Kohlenstofffilm des Gitters nicht zerstört hat. Abhängig von der Probenkassette können auch ungeclippte Gitter gefräst werden, jedoch ist bei der Übertragung vom KryoFIB-REM auf das TEM große Vorsicht geboten, um eine Biegung des Gitters zu begrenzen, da dies zu einem Bruch der Lamellen führt. Nicht geclipste Gitter können mit Kryohaltern mit seitlichem Einstieg in das TEM geladen werden, aber es besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass die Lamellen brechen, wenn nach dem Fräsen geclippt wird.

Organoplatin-Beschichtung
Die Organoplatinbeschichtung erfolgt auf einem oder beiden Gittern, sobald diese in das cryoFIB-REM geladen wurden. Die Nadel des Gasinjektionssystems (GIS) wird in die Kammer über der Probe eingeführt, um einen Strom von Organoplatindampf von einer erhitzten Quelle für eine bestimmte Zeit über die Oberfläche des Gitters zu leiten. Der Dampf kondensiert auf kalten Oberflächen und bildet eine feste Schicht (~2 μm dick). Die Unversehrtheit dieser Beschichtung ist entscheidend, damit gleichmäßig dünne Lamellen gefräst werden können. Die optimalen Anwendungsbedingungen für die Organoplatinbeschichtung werden in der Regel vom Hersteller des Instruments vorgegeben, es können jedoch noch einige Optimierungen erforderlich sein. Die meisten Systeme richten die GIS-Nadel entweder nahe zur Fräsrichtung oder senkrecht zur Fräsrichtung aus, abhängig von der Geometrie der Anschlüsse in der Kammer und den Rotationsgrenzen des Tisches. Verschiedene Einstellungen können ausprobiert werden, indem das Gitter beschichtet, ein kleiner Bereich gefräst, der Tisch gekippt und die Dicke der Beschichtung mit REM gemessen wird.

Neben dem Aufbau des CryoFIB-REM selbst können eine Reihe weiterer Faktoren die Anwendung der Organoplatinbeschichtung beeinflussen, darunter 1) die Topographie der Probe, 2) Oberflächenkontamination auf dem Gitter und 3) die Reproduzierbarkeit des Dampfstroms von der GIS-Nadel. Da die GIS-Strömung gerichtet ist, kann eine ungleichmäßige Topografie dazu führen, dass Regionen im Schatten von Zellen oder Oberflächenverunreinigungen unbeschichtet sind oder eine dünnere Beschichtung aufweisen. Dies kann beim Polieren zu einem Kollaps der Organoplatinschicht führen (Abbildung 3). Bei der Auswahl eines zu fräsenden Bereichs ist es notwendig, die umgebende Topografie zu berücksichtigen, z. B. große Oberflächenverunreinigungen, Zellklumpen oder gebrochener Kohlenstoff, die bis zu ein paar Gitterquadrate entfernt aus der Oberfläche des Gitters herausragen, können den Dampffluss blockieren und einen Schatten aus dünnerem Organoplatin erzeugen, der eine Lamelle schwächen kann. Darüber hinaus sollten auch sehr kleine Partikel von Oberflächenverunreinigungen in der Nähe der Vorderkante der Lamelle vermieden werden, da sie beim Fräsen abspringen und eine geschwächte Stelle auf blankem Eis hinterlassen können, die dazu führen kann, dass sich beim Polieren ein Loch in der Lamelle bildet. Wenn das Fräsen begonnen hat und die Organoplatinbeschichtung instabil aussieht, beschichten Sie sie erneut, länger, oder wechseln Sie sie auf ein Reservegitter.

Abbildung 3: Eine qualitativ hochwertige Organoplatinbeschichtung ist entscheidend, um dünne, gleichmäßig gefräste Lamellen zu erhalten. (A) Eine Schliffaufnahme der Vorderkante einer Lamelle, bei der die Organoplatinbeschichtung (OP, gelb) zu dünn aufgetragen wurde, was zu einem Loch in der Vorderkante der Lamelle führt, das sich beim Polieren (grüner Kreis) und ungleichmäßigem Fräsen über die gesamte Breite der Lamelle (Schlieren) entwickelt hat. Die Organoplatinoberfläche wurde durch den Ionenstrahl abgeschert, was zu einem Materialspritzer hinter der Vorderkante der Beschichtung führte (gelb gestrichelte Linie). (B) Die Organoplatinschicht (OP) wurde dicker aufgetragen, was zu einer gleichmäßigeren Verdünnung der Lamelle führt. Die Unversehrtheit der Schicht bleibt über die gesamte Breite der Lamelle erhalten und die Grenzfläche zwischen der Organoplatinschicht und dem verglasten biologischen Material ist gut definiert (gelb gestrichelte Linie). Die Carbonschicht verläuft durch die Rückseite der Lamelle (orange). Maßstabsbalken, 1 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Beurteilung der Gitterqualität im cryoFIB-REM und des Fräsprozesses
Sobald die Gitter auf das KryoFIB-REM übertragen wurden, kann die Integrität des Kohlenstofffilms und die Verteilung der Zellen auf den Gittern mit dem REM überprüft werden (Abbildung 4A-C). Eisgradienten, die Positionen von Gitterstäben und die Position von Gitternummern auf Suchergittern können durch REM mit geringer Vergrößerung bei 30 kV überprüft werden (Abbildung 4B), aber die Spannung sollte wieder auf 5 kV reduziert werden, während Fräspositionen mit hoher Vergrößerung lokalisiert und der Fräsprozess überwacht wird, um den Kontrast zur Oberflächentopographie zu erhöhen.

Abbildung 4: Beurteilung der Netzqualität und Lokalisierung der zu fräsenden Bereiche im KryoFIB-REM . (A) Ein Überblick über ein Gitter bei 5 kV mit geringer Vergrößerung über das REM. Der Ausschnitt des Autogrid-Rands ist am unteren Rand des Bildes sichtbar. Maßstabsbalken, 0,5 mm. (B) Das gleiche Gitter bei 30 kV mittels REM, das Bereiche mit dickerem Eis (dunklere Gitterquadrate) und dünnerem Eis (hellere Gitterquadrate) zeigt. Der Einschub zeigt den Bereich im Kasten mit Pfeilen, die die Nummerierung auf dem Suchergitter anzeigen, die bei 30 kV sichtbar ist. Maßstabsbalken, 0,5 mm. (C) Eine Übersicht über zwei Gitterquadrate mit mittlerer Vergrößerung, die die Verteilung der Zellen auf dem Kohlenstofffilm und die Position der Gitterbalken bewertet. Maßstabsbalken, 50 μm. (D) Die Anordnung der Fräsmuster für den ersten Schnitt bei hoher Vergrößerung (Ionenstrahlansicht bei 1,5 pA und 30 kV). Der rote Bereich (3 μm dick) wird geschützt, während die gelben Bereiche durch den Ionenstrahl abgetragen werden. Die weiß gestrichelte Linie zeigt die Position der letzten Lamelle an. Maßstabsbalken, 10 μm. (E) Eine stark vergrößerte Ansicht bei 3 kV über das REM einer polierten 200 nm dicken Lamelle (10 μm breit x 15 μm lang). Der Kontrastverlust innerhalb der Lamelle bei 3 kV zeigt an, dass eine geeignete Dicke erreicht wurde. Die hochweiße Vorderkante ist die verbleibende Organoplatinschicht, die vor dem Fräsen über das GIS auf das Raster aufgebracht wird. Maßstabsbalken, 5 μm. (F) Die gleiche Lamelle aus (E) mit dem Ionenstrahl bei 30 kV und 1,5 pA. Die dünne weiße Linie quer über das schwarze Quadrat (weißer Pfeil) ist die verbleibende Organoplatinschicht am vorderen Rand der Lamelle. Maßstabsbalken, 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ein zu fräsender Bereich wird ausgewählt, indem ein Paar rechteckiger Muster auf beiden Seiten eines geschützten Bereichs mit hoher Vergrößerung (~7.000x für Schizonten) in der Ionenstrahlansicht ausgelegt wird (Abbildung 4D). Es ist wichtig, dass sich keine Partikel der Oberflächenverunreinigung in der Nähe des Mahlbereichs anlagern, da diese das Auftragen der schützenden Organoplatinbeschichtung verdeckt haben könnten. Es ist auch wichtig, dass die Topografie der Region geeignet ist, die Seiten der Lamelle zu stützen, sobald ihre endgültige Dicke erreicht ist.

Bei Malaria-Schizonten (Zellgröße: ~5 μm Durchmesser x 2 μm dick, scheibenförmig) können Lamellen zwischen 7-20 μm Breite gefräst werden. Wenn die Zellschicht entsprechend dick ist, werden die Lamellen in der Regel ~10-15 μm lang sein und mehrere Zellen über und unter der Kohlenstoffschicht einfangen (Abbildung 4E-F). Es ist zu erwarten, dass 5-10 Lamellen in einer 8-stündigen Sitzung gefräst werden (6-7 h Fräsen und 1-2 h Polieren). Dies hängt von der Dicke der Probe und der Breite der Lamellen ab, wobei das Fräsen dickerer Proben und breiterer Lamellen länger dauert. Selbst beschädigte Gitter können gefräst werden, da nur eine Handvoll guter Gitterquadrate benötigt werden, um einen Satz von Lamellen zu erzeugen (Abbildung 5A). Wenn die Probe dünner als erwartet ist, z. B. aufgrund von übermäßigem Blotting oder Variation des Hämatokritwerts der Kultur, können kürzere Lamellen relativ schnell gefräst werden. Ihre kürzere Länge schränkt jedoch den Bereich ein, der für die Datenerhebung im TEM zur Verfügung steht (Abbildung 5B).

Abbildung 5: Feststellung, wann die endgültige Lamellendicke beim Fräsen erreicht ist. (A) Überblick über ein Gitter mit geringer Vergrößerung durch REM bei 5 kV, das eine Kohlenstoffschädigung während des Clippings zeigt. Die unbeschädigten Bereiche enthielten aufgrund von übermäßigem Blotting sehr dünne Proben; Es war jedoch immer noch möglich, sechs Lamellen auf diesem Gitter (der Bereich innerhalb des weiß gestrichelten Umrisses) in einer ganztägigen Sitzung auf dem cryoFIBSEM zu fräsen. Maßstabsbalken, 0,5 mm. (B) Eine kurze Lamelle (~10 μm breit x 3 μm lang, ohne Organoplatinschicht), die aus diesem Gitter (REM bei 3 kV) erzeugt wurde und immer noch zwei Bereiche bot, aus denen Kippreihen gesammelt werden konnten. Maßstabsbalken, 25 μm. (C) Eine Reihe von REM-Bildern (3 kV) einer Lamelle während des letzten Polierschritts, die zeigen, wie der Kontrast in der Lamelle verloren geht, wenn sie verdünnt wird (von links nach rechts). Die dunkelschwarze Linie in der Mitte der Lamelle ist in allen Bildern ein Streifen Kohlefilm aus dem Raster. Zellen vor dieser Region wurden oberhalb des Kohlenstofffilms und Zellen hinter dieser Region unterhalb des Kohlenstofffilms vitrifiziert. Das Fräsen wurde gestoppt, als die Organoplatinschicht auf der linken Seite der Vorderkante der Lamelle kurz davor war, die strukturelle Integrität zu verlieren. Dieser Haltepunkt war, bevor die gesamte Lamelle auf eine gleichmäßige Dicke gebracht wurde, weshalb sich im hinteren Teil der Lamelle noch etwas kontrastreicheres Material befindet. (D) Ein Beispiel für eine Polierstrecke auf der Grundlage der Lamellen, die auf dem in (A) gezeigten Gitter gefräst sind. Eine Polierroute sollte an den Lamellen beginnen, die näher an der FIB-Quelle liegen, und sich von der FIB-Quelle entfernen, um die erneute Ablagerung von gefrästem Material auf der Oberfläche der Lamellen zu begrenzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Während des Polierens hängt die endgültige Dicke einer Lamelle von der Struktur der Probe im zu fräsenden Bereich, der Integrität der Organoplatinschicht und der verfügbaren Zeit ab. Idealerweise sollte die Probe verdünnt werden, bis der Kontrast über die gesamte Oberfläche der Lamelle durch REM bei 3 kV verloren geht, was darauf hindeutet, dass sie gleichmäßig elektronentransparent und etwa 150-200 nm dick ist (Abbildung 5C). Es kann jedoch erforderlich sein, das Fräsen vor diesem Zeitpunkt abzubrechen, wenn die Organoplatinschicht ein Loch entwickelt oder sich die Lamelle zu biegen beginnt. In diesem Fall kann die Lamelle vorne noch dünn genug sein und für die Tomographie nützlich bleiben. Umgekehrt ist es möglich, die Kontrastverluststufe zu verdünnen, wenn die Lamelle stabil aussieht, und sie noch dünner zu machen, indem die Fräsmuster näher zusammenrücken (~100 nm oder weniger). Dies hängt davon ab, welche Dicke für den nachgelagerten Workflow erforderlich ist. Ein REM-Bild mit geringer Vergrößerung ist erforderlich, um eine Polierroute zu planen, die näher an der Ionenstrahlquelle beginnt und sich abarbeitet (Abbildung 5D). Die Richtung des Polierweges ist wichtig, um eine erneute Ablagerung von abgetragenem Material auf bereits fertiggestellten Lamellen zu verhindern.

Sammeln und Verarbeiten von Tilt-Seriendaten
Nach dem Laden in das TEM identifiziert eine Vollrastermontage mit geringer Vergrößerung (~150x) die Positionen der Lamellen, die mit dem am Ende des Fräsens aufgenommenen REM-Bild mit geringer Vergrößerung korreliert werden können. Bei eingefrorenen Schizonten ist der größte Teil des Gitters für Elektronen nicht transparent, so dass die Lamellenpositionen als weiße Kerben auf schwarzem Hintergrund erscheinen (Abbildung 6A). Der Winkel der Lamellen in Bezug auf die Neigungsachse des Mikroskops sollte beachtet werden, da mehr als ~10° von der Senkrechten entfernt die Erfassung von Neigungsreihen erschweren könnte. Eine Montage mit mittlerer Vergrößerung (~1.500x) an der Stelle jeder Lamelle gibt einen Überblick über den biologischen Gehalt und prüft auf Übertragungsschäden, kristallines Eis oder übermäßige Oberflächenkontamination (Abbildung 6B-D). Dies sollte auch bei hoher Neigung überprüft werden, um sicherzustellen, dass keine Oberflächenverunreinigungen den Aufnahme- oder Fokusbereich verdecken. Die Wahl einer Erfassungsregion hängt nicht nur von den biologischen Merkmalen ab, sondern auch von der strukturellen Integrität des Eises in der Umgebung, z. B. von der Vermeidung von Rissen, da diese Regionen driften, oder von Bereichen mit übermäßigem Vorhang, in denen eine Lamelle eine variable Dicke aufweist. Vor dem Erfassen einer Neigungsreihe wird eine Vorneigung von ±10° auf das Gitter angewendet, um die Ebene der Lamellen (nicht des Gitters) senkrecht zur optischen Achse zu machen. Die Richtung der Vorneigung kann durch die Position der Vorderkante der Lamellen (auf der Suche nach der übrig gebliebenen Organoplatinschicht) in der Montage mit mittlerer Vergrößerung bestimmt werden. Für das hier verwendete TEM (300 kV Titan Krios) erforderte eine Vorneigung von +10°, wenn die Vorderkanten der Lamellen in der Karte nach oben zeigten, und wenn sie nach unten zeigten, eine Vorneigung von -10°. Jedes Gitter kann aufgrund der Ausrichtung, in der es mit der Pinzette aufgenommen und in den Autoloader eingesetzt wurde, unterschiedlich sein (Schnittabschnitt nach links oder rechts, erzeugt eine 180°-Drehung). Eine letzte Überlegung ist die Pixelgröße. Routinemäßig werden Neigungsreihen um 2,5-7 Å/Pixel erfasst, wobei die Größe des interessierenden Merkmals, die Zielauflösung der resultierenden tomographischen Daten und die Oberfläche der Lamelle, die die Größe des Aufnahmebereichs begrenzen kann, berücksichtigt werden. Es ist möglich, eine kleinere Pixelgröße zu verwenden, um hochauflösende Informationen zu erhalten, und die kleinste, die wir bei diesen Beispielen erfolgreich verwendet haben, ist 1,4 Å/Pixel (Daten nicht gezeigt). Die Drift ist bei einer kleineren Pixelgröße deutlicher und eignet sich nur für dünne (<100 nm) Lamellen, bei denen die Maximierung der Auflösung in der Studie von Bedeutung ist.

Abbildung 6: Auswahl zugänglicher Bereiche von Interesse, aus denen Neigungsreihen erfasst werden sollen (A) Ein Ausschnitt aus einer TEM-Karte mit geringer Vergrößerung, der einen Bereich mit Lamellen zeigt, die als sechs weiße Kerben auf schwarzem Hintergrund (rote Pfeile) erscheinen. Bei den weißen Quadraten handelt es sich um gebrochenen Kohlefilm. (B) Eine Karte einer beschädigten und entglasten Lamelle mit mittlerer Vergrößerung. An der Vorderkante der Lamelle (FE) ist die Organoplatinschicht abgebrochen (1). In der Mitte der Lamelle befindet sich ein klarer Fleck aus kristallinem Eis (2). Der Ionenstrahl ist an der hinteren Kante der Lamelle (BE) nicht durchgebrochen, weil das Eis neben den Gitterstäben zu dick ist. Nur ein kleiner Teil der Lamelle ist am BE (3) frei vom umgebenden Eis, wodurch ein Keil entsteht. Die Dicke hat auch dazu geführt, dass Regale über der Lamelle (4) durchtrennt wurden, was höchstwahrscheinlich die Sicht auf die Zellen bei hoher Neigung im TEM versperren wird. (C) Montage einer ganzen Lamelle mit mittlerer Vergrößerung im TEM. Typische Probleme oder Bereiche, die bei der Entnahme von Neigungsreihen von Lamellen vermieden werden sollten, sind Bereiche: mit Oberflächenverunreinigungen (SC), bedeckt durch die Organoplatinschicht (OP, gelb), in der Nähe von Rissen (CR und schwarze Pfeile), mit Vorhängen aufgrund von Dichteänderungen im biologischen Material (CU und Bereich innerhalb blauer Klammern) und Bereiche, die durch Brüche in der Organoplatinschicht geschwächt sind (grüner Kreis). Die einzigen Bereiche, die für die Erfassung von Tilt-Serien zugänglich sind, sind die Bereiche innerhalb der beiden schwarz gestrichelten Kästchen (mit 1 und 2 beschriftet). Die Ansicht muss bei starker Neigung überprüft werden, um sicherzustellen, dass Oberflächenverunreinigungen den interessierenden Bereich oder den Fokusbereich nicht verdecken. (D) Eine Montage mit mittlerer Vergrößerung einer viel saubereren Lamelle, die jedoch immer noch Risse (CR) aufweist, die durch das Ausdünnen der Organoplatinschicht (grüner Kreis) während des Polierens verursacht wurden. Hier wird die interessierende Region durch den innerhalb der Lamellen beobachteten Zelltyp hervorgehoben, in diesem Fall um die einzelnen Merozoiten, die hinter der Kohlenstoffschicht (orange) im hinteren Teil der Lamelle positioniert sind (schwarz gestrichelter Kasten). Maßstabsbalken, 3 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Erfassung von Kryo-ET-Daten von FIB-gefrästen Lamellen. (A) Mikroskopische Aufnahme einer Region einer Lamelle, die ein rotes Blutkörperchen enthält, das kürzlich von einem P. falciparum-Merozoiten befallen wurde. In (B) ist das gleiche Bild mit Anmerkungen versehen, um die Grenze des roten Blutkörperchens (rot), eine Reihe doppelwandiger intrazellulärer Vesikel (violett und blau für die innere bzw. äußere Membran) und des Merozoiten (grün) zu zeigen, der von einer zweiten Membran umgeben ist, die von der Wirtszelle abgeleitet ist (gelb). Ein schwarzes Kästchen zeigt den Bereich, in dem eine Tilt-Serie erfasst wurde. Maßstabsleiste, 500 nm. (C) Ein Durchschnitt von 20 zentralen Schichten, die in der XY-Ebene aus einem 8x Binn-Tomogramm (2,4 Å/Pixel) betrachtet wurden, das am apikalen Ende des Merozoiten und in (D) seiner Annotation aufgenommen wurde und die beiden Membranen zeigt, die die Zelle umgeben (grün und gelb) und vier Membranen, die in der Spitze des Merozoiten (blau) gestapelt sind und mit einem elektronendichten, pilzförmigen Merkmal (lila) verbunden sind. Ein roter Pfeil zeigt die Verbindung der Membranstapel im Scheitelpunkt und das pilzförmige Merkmal (auch in Teil F, i dargestellt) an. Ein schwarzer Pfeil zeigt ein Fusionsereignis zwischen der Merozoiten-Plasmamembran und einem der mehrschichtigen Vesikel innerhalb des Parasiten an (auch in Teil F, ii dargestellt). Die Membran der roten Blutkörperchen des Wirts ist dargestellt (rot) und eine schwarz gestrichelte Linie zeigt die Position eines Querschnitts in der XZ-Ebene, dargestellt in (E). Die Merkmale im Querschnitt (E) sind wie in Teil (D) eingefärbt und beschriftet, wobei farbige Pfeile auf die Membranen zeigen. Ein schwarzer Pfeil zeigt die Position einer Sputterschicht an, die nach dem Fräsen auf die Lamelle aufgetragen wird, und die Dicke der Lamelle ist angegeben. Für Teile (C-E), Maßstabsbalken, 500 nm. (F) Eine detailliertere Ansicht der Merkmale, die durch die roten und schwarzen Pfeilspitzen in Teil (C) angedeutet sind, zeigt die Definition in den Lipiddoppelschichten des Membranstapels in der Spitze des Merozoiten (i) und das Fusionsereignis zwischen dem mehrschichtigen Vesikel und der Merozoiten-Plasmamembran. Maßstabsleiste, 75 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Das Hauptaugenmerk der Arbeit liegt auf der Analyse des Weges des Merozoitenaustritts in P. falciparum Da die in der Studie verwendete Zellpopulation jedoch nie vollständig homogen sein kann, wurden häufig andere Stadien der Zellentwicklung innerhalb der Lamellen beobachtet. Das hier gezeigte Beispiel (Abbildung 7) enthält ein rotes Blutkörperchen, das kürzlich von einem P. falciparum Parasit (Merozoite). Die verwendete Lamelle war 240 nm dick und das Gitter war vor dem Einsetzen in das TEM in einer Argonatmosphäre leicht mit Platin besprüht worden, was zu etwas weniger Kontrast führte, als normalerweise zu erwarten wäre. Die Membran der roten Blutkörperchen konnte in ihrer Gesamtheit um die Zelle herum verfolgt werden. Innerhalb der roten Blutkörperchen befanden sich drei geschlossene membrangebundene Strukturen, zwei Vesikel, die jeweils von einer Doppelmembran und einem glühbirnenförmigen Merkmal (1,2 μm x 0,9 μm an den breitesten Stellen) umgeben waren, was mit einem Merozoiten (Abbildung 7A-B). Der Inhalt der beiden Vesikel schien im Gegensatz zu dem Inhalt der roten Blutkörperchen ähnlich zu sein, was darauf hindeutet, dass diese Vesikel Hämoglobin enthalten könnten. Das Vorhandensein von Vesikeln innerhalb der roten Blutkörperchen des Wirts nach der Invasion wurde bereits früher beobachtet⁴⁵. Es wird angenommen, dass sie durch die Sekretion von Lipiden und anderen Virulenzfaktoren aus sekretorischen Organellen, den Rhoptrien im Merozoiten, entstehen, die sich während der Invasion in die roten Blutkörperchen des Wirts entladen. Der Merozoite ist von zwei eng miteinander verbundenen Membranen umgeben, von denen die innerste vermutlich die native Plasmamembran des Merozoiten ist, auf der sich keine sichtbare Oberflächenschicht befindet, und die äußerste muss von der Membran der roten Blutkörperchen des Wirts stammen, die den Merozoiten umhüllt, wenn er eindringt. Das Zytoplasma des Merozoiten enthält viele mehrschichtige Vesikel und ein elektronendichtes, pilzförmiges Merkmal, das an einen Stapel von Membranen an der Spitze angrenzt. Eine Tilt-Serie, die über diesen Bereich (2,4 Å/Pixel) aufgenommen wurde, zeigt, dass er einen Stapel von vier Membranen enthält, die mit dem pilzförmigen Merkmal (Abbildung 7C-E). Auffallend ist, dass sich diese Morphologie deutlich von der normalen Anordnung von Organellen und Zellstrukturen am apikalen Ende eines reifen Merozoiten unterscheidet. Um dies zu beurteilen, wurde eine vergleichende Neigungsreihe (2,74 Å/Pixel) über das apikale Ende eines reifen Merozoiten von einem Schizonten erhalten, der vor dem Tauchfrosten und Mahlen mit E64 behandelt worden war (Abbildung 8). Dies zeigt, dass das apikale Ende eines Merozoiten zwei prominente keulenförmige sekretorische Organellen enthält, die Rhoptrien genannt werden, eingebettet in einen Satz von drei polaren Ringen an der apikalen Spitze der Zelle und umgeben von einer Reihe kleinerer sekretorischer Organellen, die Mikroneme genannt werden. Der innerste polare Ring ist an eine Doppelmembranstruktur gebunden, die der Merozoiten-Plasmamembran zugrunde liegt, dem sogenannten inneren Membrankomplex, der Motorproteine enthält, die die Invasion vorantreiben. Es wurde gezeigt, dass während der Invasion der Inhalt der sekretorischen Organellen auf die Merozoitenoberfläche und in die roten Blutkörperchen des Wirts abgegeben wird, was die Anheftung von Merozoiten an die roten Blutkörperchen des Wirts erleichtert und den motorischen Komplex initiiert, der die Invasion antreibt⁴⁵. Die Daten hier zeigen, dass der Merozoite nach der Invasion keine beobachtbaren Strukturen enthält, die Rhoptrien, Mikronemen oder Polarringen ähneln, was darauf hindeutet, dass sich die Morphologie des apikalen Endes des Merozoiten dramatisch verändert. Die Verschmelzung von Rhoptrien vor der Invasion wurde bereits durch TEM von festen Abschnitten bei Raumtemperatur gezeigt⁴⁶, was mit der Produktion des pilzförmigen Merkmals übereinstimmt, das wir in unserem Merozoiten nach der Invasion beobachten. Die Membranstapel, die mit diesem Merkmal verbunden sind, wurden bisher nicht beobachtet, und da es keinen Hinweis auf ein IMC im neu eingedrungenen Merozoiten gibt, vermuten wir, dass es sich bei den Membranstapeln um die Überreste der IMC-Maschinerie handeln könnte, die nach Abschluss der Invasion übrig geblieben sind, aber dies muss noch bestätigt werden.

Abbildung 8: Das apikale Ende reifer Merozoiten mittels Kryo-ET einer FIB-gefrästen Lamelle und TEM von Kunststoffprofilen. (A) Durchschnittlich 20 zentrale Schichten aus einem 8x Binn-Tomogramm (2,74 Å/Pixel) aus einer 230 nm dicken Lamelle, die die typische Morphologie des apikalen Endes eines reifen Merozoiten zeigen. Die Schizonten wurden vor dem Einfrieren mit E64 behandelt, so dass die PV-Membran gerissen ist und die Merozoiten in den roten Blutkörperchen des Wirts enthalten sind. (B) zeigt das Gleiche wie in (A), jedoch mit Anmerkungen, die die Membran der roten Blutkörperchen des Wirts (RCM, rot), die Merozoiten-Plasmamembran (grün), den inneren Membrankomplex (IMC, lila), die polaren Ringe (PR, schwarz), Mikroneme (M, gelb), die Rhoptrien (R, grau) und die Kernhülle (NE, blau) angeben. Ein benachbarter Merozoite, der sich in diesem Bereich des Tomogramms außerhalb der Ebene befindet, ist durch ein grünes Dreieck gekennzeichnet. Maßstabsleiste, 200 nm. (C) Die zellulären Merkmale, die durch KryoET beobachtet wurden, stimmen mit denen von TEM von Schizonten überein, die in plastischen Schnitten konserviert wurden. Ähnliche zelluläre Merkmale werden in einem reifen Merozoiten aus einem Schizonten angezeigt, der mit Verbindung 2 behandelt wurde und den Austritt vor dem Bruch der PV-Membran verzögert. Maßstabsleiste, 500 nm. (D) Ein kommentiertes Schema eines Merozoiten, das die zellulären Merkmale in Teilen (A-C) zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Dicke des geschützten Bereichs zwischen den rechteckigen Fräsbildern (μm)	Nominaler Ionenstrahlstrom (pA) bei 30 kV
3	300
1.5	100
0.75	50
0.3	30
0,2 - 0,06 (Endpolitur)	30*

Tabelle 1: Frässtrategie zur Herstellung dünner Lamellen. Das schrittweise Fräsen erfolgt durch Reduzierung des Ionenstrahlstroms entsprechend der Dicke des geschützten Bereichs. Dadurch wird die Erwärmung der Probe begrenzt und eine Entglasung verhindert. *Das Polieren sollte parallel durchgeführt werden, um die Lamellen von beiden Seiten gleichmäßig zu erhitzen und das Risiko zu verringern, dass sie sich verbiegen oder verbiegen, wenn sie ihre endgültige Dicke erreichen. Andere Schritte können nacheinander ausgeführt werden, indem das Muster über der Lamelle und dann unter der Lamelle gefräst wird, bevor zum nächsten Strahlstrom übergegangen wird. Die Vermessung des Gitters zur Lokalisierung von Fräspositionen sollte mit einem Strahlstrom von 1,5 pA durchgeführt werden, um die Erwärmung der Probe zu minimieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Während das KryoFIB-Mahlen immer mehr zur Routine wird, ist dies bei der Vorbereitung optimaler Proben für das Mahlen nicht der Fall. Daher finden die meisten kritischen Schritte in diesem Protokoll statt, bevor die Probe das KryoFIB-REM erreicht. Eine Probenoptimierung durch mehrere Runden der Zellpräparation, Tauchgefrieren und Screening durch Licht- und Elektronenmikroskopie ist erforderlich, um die bestmögliche Probe zu erzeugen, bevor das Mahlen versucht wird. Die bestmögliche Probe erhöht nicht nur die Erfolgschancen, sondern optimiert auch den Einsatz der Geräte. Aus diesem Grund verlangen die meisten nationalen Einrichtungen den Nachweis, dass eine ausreichende Optimierung durchgeführt wurde, bevor sie Zeit für ihre Maschinen gewähren. Im Inneren des CryoFIB-REM ist die Maximierung der Wirksamkeit der Organoplatinbeschichtung von entscheidender Bedeutung, um gleichmäßig dünne Lamellen zu erzeugen. Schließlich sind Geduld und eine gute Probenhandhabung eine Grundvoraussetzung für den Benutzer, der mehrere Tage lang sitzen muss, um Gitter mit empfindlichen Lamellen herzustellen und dann zu übertragen. Dies kann sich mit der Einführung automatisierter Frässtrategien ändern^47,48, aber noch ist der gesamte Fräsprozess in den meisten Anlagen weitgehend manuell.

Während sich die Arbeit ausschließlich auf P. falciparum schizonts konzentrierte, konnte die hier vorgestellte Methode leicht modifiziert werden, um die Gitterpräparation und das Mahlen für andere Zelltypen zu optimieren. Wichtige Faktoren, die zu berücksichtigen sind, sind die Dichte der Zellen, die auf das Gitter aufgetragen werden, der Gittertyp (Kupfer ist für einige Zellen giftig), die Größe und der Abstand der Löcher im Kohlenstofffilm, die Löschzeit und die Methode des Löschens (ein-/doppelseitig, manuell oder automatisiert). Wenn die Zellen auf den Gittern (in der Regel Goldgitter mit einem löchrigen Kohlenstofffilm) gezüchtet werden, kann die Konfluenz vor dem Abtupfen und Einfrieren durch Lichtmikroskopie überprüft werden. Die Frässtrategie hängt davon ab, wie die Zellen auf dem Gitter abgelegt werden. Bei mit Malaria infizierten roten Blutkörperchen ist das Gitter im Wesentlichen von einer ununterbrochenen Zellschicht überzogen, die in einigen Bereichen dicker und in anderen Bereichen dünner ist. Das Fräsen wird an mehreren Stellen in einem Bereich entlang dieses Gradienten durchgeführt, wo die Eisdicke Lamellen erzeugt, die eine für die Tomographie geeignete Größe haben. Dieser Ansatz eignet sich gut für kleinere Zellen, da Sie Lamellen erzeugen können, die eine Scheibe durch mehrere Zellen enthalten. Bei größeren Zellen oder Zellklumpen kann es sein, dass eine Zelle oder ein Zellklumpen eine Lamelle bildet.

Die Handhabung des Rasters und der Probentransfer sind nach wie vor eine der größten Herausforderungen dieses Arbeitsablaufs. Lamellen können aufgrund von Brüchen oder Rissen, Vorhangartefakten, die die Biologie verdecken, übermäßiger Oberflächenkontamination sowie Problemen mit der Gitterausrichtung innerhalb des TEM verloren gehen, was einen zusätzlichen Handhabungsschritt erfordert, um das Gitter neu zu positionieren. Das Ausmaß der Verluste variiert von Tag zu Tag und von Netz zu Netz, wird aber durch Übung und Erfahrung im Umgang mit der Zeit verbessert. In dieser Studie wurde festgestellt, dass die Gitter im Autoloader mehrmals vorsichtig neu ausgerichtet werden können, ohne die Lamellen zu zerstören, was manchmal den Vorteil hat, dass Oberflächeneis abgewaschen wird. Eine weitere große Einschränkung dieses Arbeitsablaufs ist die Zeit, die für die Herstellung von Lamellen benötigt wird. Da die Produktion langsam ist, ist es wichtig, eine richtig optimierte Probe zu haben, um das Fräsen so effizient wie möglich zu gestalten.

In jüngster Zeit wurden eine Reihe von Anpassungen für das FIB-Mahlen von glasartigen biologischen Proben eingeführt. Ein Game-Changer ist die Implementierung von kryogenisch gekühlten Lift-Out-Werkzeugen innerhalb der CryoFIB-REM-Kammer, die es ermöglichen, größere Materialblöcke aus unter hohem Druck gefrorenen Proben zu fräsen. Die Blöcke können an einem Metallstab befestigt oder in einem Greifer aufgenommen und zu einer zweiten Probenposition bewegt werden, die ein speziell modifiziertes EM-Gitter enthält. Anschließend können die Blöcke mit Organoplatin beschichtet und zu Lamellen gefräst werden. Die Möglichkeit, Lamellen aus unter hohem Druck gefrorenem Material zu fräsen, bedeutet, dass viel größere Zellen und Gewebe verarbeitet werden können, die durch korrelative Fluoreszenzmikroskopie gezielt auf Bereiche abzielen¹². Zu den weiteren neueren Anpassungen der FIB-Fräsmethode gehören die Reduzierung von Vorhangartefakten durch Keilvorfräsen der Probe¹⁶, die mikrofluidische Kryofixierung⁴⁹ und die Photomikrostrukturierung von Elektronenmikroskopiegittern zur Verbesserung der Zellverteilung⁵⁰. Es wurde auch gezeigt, dass das Fräsen von Mikrodehnungsfugen auf beiden Seiten einer Lamelle die Kompression durch die umgebende Probe verringern kann, wenn sie ihre endgültige Dünne^{erreicht 51}. Dies kann besonders nützlich sein, wenn kontinuierliche Zellschichten gefräst werden, wie z. B. bei der Probe in dieser Studie, bei der während des letzten Polierschritts manchmal eine Biegung der Lamellen zu sehen ist.

Die Zukunft der Elektronenmikroskopie wird wahrscheinlich die Bestimmung von in situ molekularen Strukturen durch Sub-Tomogramm-Mittelung sein, und das FIB-Fräsen ist ein wichtiges Werkzeug, das die Herstellung von glasartigen biologischen Proben für diese Art von Arbeitsabläufen erleichtern wird. Während das FIB-Fräsen für biologische Anwendungen noch in den Kinderschuhen steckt, schreitet die Methodenentwicklung dank der harten Arbeit von Forschern, sowohl akademischer als auch nationaler Einrichtungen, sowie kommerzieller Investitionen in die Entwicklung der KryoFIB-REM-Technologie zur Unterstützung der Forschung in rasantem Tempo voran.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
c-clips	Thermo Fisher Scientific	1036171
Clipstation	Thermo Fisher Scientific	n/a	Direktes Zitat von Thermo
Clipping station	Sub-angström	CSA-01
Compound 2	n/a	n/a	Synthetisiert von Dr. Simon A. Osborne, LifeArc
Cryo-FIB spezifische Autogrid-Felgen	Thermo Fisher Scientific
E64	Sigma	E3132
Emitech K100X Glimmentladungseinheit	Quorum	n/a
Gibco RPMI 1640 Medien	Thermo Fisher Scientific	12633012	Die für die Kultivierung verwendete Formulierung ist eine Sonderanfertigung (REF 041-91762 A) und enthält Albumax, Glutamin, HEPES und Hypoxanthin-Ergänzungen
Giemsa Stain	VWR International	350864X
Objektträger	Thermo Fisher Scientific	11562203
Gitterboxen	Sub-angström	PB	Für abgeschnittene Gitter
Gitterboxen	Thermo Fisher Scientific	n/a	Für geclippte Gitter - direktes Zitat von Thermo Fisher Scientific
Gitterboxen	Agar Scientific	AGG3727
Hausgemachte manuelle Tauch-Gefrieranlage	n/a	n/a	Mit einem isolierten Ethantopf (Schaumstoff hoher Dichte) und einem Flüssigstickstoffbad (Polystyrol) auf einer Tischplatte in einer Sicherheitseinrichtung.
Menschliches Blut	n/a	n/a	UK National Blood and Transplant service
JEOL 4700F Z JSM mit einem Leica VCT500 Tischkühlsystem	JEOL	n/a	FIB-SEM
Leica EM ACE600 mit einem VCT500 Kryotisch	Leica	n/a	Sputter Coater
Leica EM ACE900	Leica	n/a	E-Beam Rotary Coater. In einem Raum mit kontrollierter Luftfeuchtigkeit.
Linkam Kryotisch für Lichtmikroskop	Linkam	Modell Nr . CMS196	Kassetten für beschnittene und unbeschnittene Gitter. In einem Raum mit kontrollierter Luftfeuchtigkeit.
Methanol	Sigma	179957
Nikon Eclipse E200 Lichtmikroskop	Nikon	n/a	mit Linkam Kryo-Tisch in einem feuchtigkeitskontrollierten Raum.
Percoll	VWR International	17-0891-01	Die Lösung für Percoll-Kissen besteht aus 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 Medien und 315 ml Percoll
Quantifoil Kupfer 200 Mesh 2/4 löchrigen Carbon EM Finder Gittern	Quantifoil	N1-C17nCuH2-01	100 Packung
Quantifoil Kupfer 200 Mesh 2/4 löchrigen Carbon EM Gittern	Quantifoil	N1-C17nCu20-01	100 Packung
Quorum PP3010 Quorum für die Vorbereitungskammer	Quorum	n/a	Sputter-Coater
Scios Dual Beam, ausgestattet mit einem Quorum PP3010 Transfertisch.	FEI	n/a	FIB-SEM
Staedtler Lumocolor feiner schwarzer Permanentmarker Viking		Direct ND538522
TFS Titan Krios 300 kV TEM	Thermo Fisher Scientific	n/a	TEM ausgestattet mit einer K2 oder K3 Kamera.
Whatmann Grade 1 Filterpapier	Sigma	WHA1001150
Zeiss Axio Scope A1 Lichtmikroskop	Zeiss	n/a	mit Linkam Kryo-Tisch in einem feuchtigkeitskontrollierten Raum.