Temperaturgesteuerte Montage und Charakterisierung eines Droplet Interface Bilayers

Summary

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines temperaturgesteuerten Wärmesystems zur Förderung der Lipid-Monolayer-Montage und der Tröpfchen-Schnittstellen-Bilayerbildung für Lipide mit erhöhten Schmelztemperaturen und Kapazitätsmessungen zur Charakterisierung temperaturgetriebener Veränderungen in der Membran.

Abstract

Die Droplet Interface Bilayer (DIB)-Methode zur Montage von Lipid-Doppelschichten (d.h. DIBs) zwischen lipidbeschichteten wässrigen Tröpfchen in Öl bietet im Vergleich zu anderen Methoden wichtige Vorteile: DIBs sind stabil und oft langlebig, bilayerBereich kann reversibel abgestimmt werden, Prospektasymmetrie wird leicht über Tröpfchenzusammensetzungen gesteuert und gewebeähnliche Netzwerke von Doppeltöten können durch angrenzende. Die Bildung von DIBs erfordert eine spontane Montage von Lipiden in hochdichte Lipidmonolayer an den Oberflächen der Tröpfchen. Während dies bei gemeinsamen synthetischen Lipiden leicht bei Raumtemperatur vorkommt, bildet sich bei Lipiden mit Schmelzpunkten oberhalb der Raumtemperatur, einschließlich einiger zellulärer Lipidextrakte, keine ausreichende Monoschicht oder stabile Doppelschicht. Dieses Verhalten hat wahrscheinlich die Zusammensetzungen – und vielleicht die biologische Relevanz – von DIBs in Modellmembranstudien eingeschränkt. Um dieses Problem anzugehen, wird ein experimentelles Protokoll vorgelegt, um das Ölreservoir, das DIB-Tröpfchen beherbergt, sorgfältig zu erwärmen und die Auswirkungen der Temperatur auf die Lipidmembran zu charakterisieren. Insbesondere zeigt dieses Protokoll, wie eine thermisch leitfähige Aluminiumhalterung und resistive Heizelemente, die durch eine Rückkopplungsschleife gesteuert werden, verwendet werden, um erhöhte Temperaturen vorzuschreiben, was die Monolayer-Montage und Diebesbildung für einen breiteren Satz von Lipidtypen verbessert. Die strukturellen Eigenschaften der Membran sowie die thermotropen Phasenübergänge der Lipide, die die Bilayer umfassen, werden durch Messung der Veränderungen der elektrischen Kapazität des DIB quantifiziert. Zusammen kann dieses Verfahren bei der Bewertung biophysikalischer Phänomene in Modellmembranen über verschiedene Temperaturen helfen, einschließlich der Bestimmung einer effektiven Schmelztemperatur (T_M) für Mehrkomponenten-Lipidmischungen. Diese Fähigkeit wird somit eine engere Replikation natürlicher Phasenübergänge in Modellmembranen ermöglichen und die Bildung und Verwendung von Modellmembranen aus einem größeren Spektrum von Membranbestandteilen fördern, einschließlich derjenigen, die die Heterogenität ihrer zellulären Gegenstücke besser erfassen.

Introduction

Zellmembranen sind selektiv durchlässige Barrieren, die aus Tausenden von Lipidtypen^1,Proteinen, Kohlenhydraten und Sterolen bestehen, die alle lebenden Zellen verkapseln und unterteilen. Zu verstehen, wie ihre Zusammensetzungen ihre Funktionen beeinflussen, und zu zeigen, wie natürliche und synthetische Moleküle mit Zellmembranen interagieren, anhaften, stören und translozieren, sind daher wichtige Forschungsbereiche mit weitreichenden Implikationen in Biologie, Medizin, Chemie, Physik und Materialtechnik.

Diese Entdeckungsziele profitieren direkt von bewährten Techniken zur Montage, Manipulation und Untersuchung vo....

Protocol

1. Beheizte Vorrichtungsvorbereitung

1. Sammeln Sie 2 Stück von 1 mm dicken isolierenden Gummi auf 25 mm x 40 mm in der Breite und Länge getrimmt, 2 Stück eines 6 mm dicken Gummis, die auch 25 mm x 40 mm sind, eine vorbereitete Aluminium-Basisbefestigung und ein Acrylölreservoir, das in das Sichtfenster der Aluminium-Basishalterung passt (siehe Abbildungen S1, S2 und S3 für Details zur Fertigung und eine explosionsartige Ansicht der Montage). Bereiten Sie die Aluminiumhalterung zuerst vor, indem Sie an der Unterseite der Leuchte ein Glasabdeckungssichtfenster mit UV-härtebarem Klebstoff befestigen und 1 resistives Heizelement an der Oberseite j....

Results

Abbildung 1 zeigt, wie die Aluminiumhalterung und das Acrylölreservoir auf der Mikroskopbühne auf die DIB-Bildung vorbereitet werden. Die Montageschritte 1.2-1.4 dienen dazu, die Leuchte von der Bühne für eine effizientere Erwärmung wärmezudämmen. Die Schritte 1.5-1.7 zeigen, wie das Thermoelement richtig an der Halterung befestigt und das Ölreservoir positioniert wird, und die Schritte 1.8 -1.9 zeigen empfohlene Orte für die Ölabgabe in diese Teile an.

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll enthält Anweisungen für die Montage und den Betrieb eines experimentellen Systems zur Steuerung der Temperatur des Öls und der Tröpfchen, die zur Bildung von DIBs verwendet werden. Es ist besonders vorteilhaft für die Aktivierung der DIB-Bildung mit Lipiden, die Schmelztemperaturen über RT haben. Darüber hinaus kann durch präzise Variation der Temperatur des Ölreservoirs die Doppelschichttemperatur manipuliert werden, um die Auswirkungen erhöhter Temperaturen auf verschiedene Membraneigens.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm x 40 mm x 1 mm isolierender Gummi (x2)	Beliebig		Isoliert die Unterseite der Aluminiumhalterung vom Tisch des Mikroskops
25 mm x 40 mm x 6 mm isolierender Gummi (x2)	Beliebig		Schützt die Heizelemente vor Beschädigungen durch die Clips des Mikroskoptisches und isoliert die Oberseite der Heizelemente.
3-(N-morpholino) propansulfonsäure	Sigma Aldrich	M3183	Puffermittel für Lipidlösung
Acrylsubstrat	eigenen Haus hergestellt	HTD_STG_2	~1000 uL Acrylbohrloch mit einem Poka-Yoke-Außenprofil zur Fixierung
der Ausrichtung Aluminiumarmatur	Haus hergestellt	HTD_STG_1	Basisleuchte mit einer Ölbohrung, die die Acrylleuchte hält und zwei flache Pads neben der Ölquelle für die Heizelemente enthält
Gesamtlipidextrakt des Gehirns	Avanti	131101C-100mg	25 mg/ml Schweinelipidextrakt
Kompaktes Datenerfassungsgehäuse (cDAQ)	National Instruments	cDAQ-9174	Gehäuse für die Aufnahme mehrerer Arten von Sensor-, Mess- oder Ausgangsmodulen
Datenerfassungssystem (DAQ)	Molekulare Bauelemente	Digidata 1440A	Hochauflösender Analog-Digital-Wandler
Verstärker/Netzteil mit fester Verstärkung	Hewlitt Packard	HP 6826A	Verstärkt die Gleichspannungsausgabe vom Spannungsausgangsmodul
Glass Cover Slip Corning CLS284525			Dichtet die Unterseite des Aluminiumsockels ab und ermöglicht die optische Charakterisierung der Doppelschicht
Heizelement (x2)	Omega	KHLV-101/5	25 mm x 25 mm Polymidfolie Kapton-Heizelement mit einer Leistungsgrenze von 5 Watt.
M3 Edelstahlschraube	McMaster Carr	90116A150	Befestigt Thermoelement an Aluminiumhalterung
Patch Clamp Verstärker	Molecular Devices	AxoPatch 200B	Misst den Strom und gibt die Spannung an den Kopftisch aus
Personal Computer	Jeder		Computer mit mehreren Highspeed-USB-Anschlüssen und mindestens 6 GB RAM
Kaliumchlorid	Sigma Aldrich	P3911	Elektrolytlösung aus dissoziierten Ionen
Temperatureingangsmodul	National Instruments	NI 9211	Ermöglicht Messungen von offenen und kalten Vergleichsstellen an Thermoelementen für das cDAQ-Chassis
Thermoelement	Omega	JMTSS-020U-6	U-Typ-Thermoelement mit einem Durchmesser von 0,02 Zoll und einer Länge von 6 Zoll
UV-härtender Klebstoff	Loctite	19739	Befestigt Glasdeckglas an der Aluminium-Grundhalterung
Spannungsausgangsmodul	National Instruments	NI 9263	Analoges Spannungsausgangsmodul zur Verwendung mit dem cDAQ-Chassis
Signalgenerator	Agilent	33210A	Wird verwendet, um eine sinusförmige Wellenform mit 10 mV und 10 Hz auszugeben