Probenvorbereitungs- und Übertragungsprotokoll für die In-Vakuum-Langwellenkristallographie auf der Beamline I23 an der Diamantlichtquelle

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll für die kryogene Probenvorbereitung und den Transfer von Kristallen in die Vakuumendstation auf der Beamline I23 an der Diamond Light Source für langwellige makromolekulare Röntgenkristallographie-Experimente vor.

Abstract

Die langwellige makromolekulare Kristallographie (MX) nutzt die anomalen Streueigenschaften von Elementen wie Schwefel, Phosphor, Kalium, Chlor oder Kalzium, die oft nativ in Makromolekülen vorhanden sind. Dies ermöglicht die direkte Strukturlösung von Proteinen und Nukleinsäuren durch experimentelles Phasing ohne zusätzliche Markierung. Um die signifikante Luftabsorption von Röntgenstrahlen in diesem Wellenlängenbereich zu eliminieren, werden diese Experimente in einer Vakuumumgebung durchgeführt. Beamline I23 an der Diamond Light Source, Großbritannien, ist das erste Synchrotroninstrument seiner Art, das für MX-Experimente im langen Wellenlängenbereich bis 5 Å entwickelt und optimiert wurde.

Um dies zu ermöglichen, umschließt ein großes Vakuumgefäß alle Endstationskomponenten der Probenumgebung. Die Notwendigkeit, Proben während der Lagerung und Datenerfassung im Vakuum bei kryogenen Temperaturen zu halten, erfordert die Verwendung von wärmeleitfähigen Probenhaltern. Dies ermöglicht eine effiziente Wärmeabfuhr, um eine Probenkühlung auf ca. 50 K zu gewährleisten. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Verfahren zur Probenvorbereitung und zum Transfer von Proben ins Vakuum auf der Beamline I23. Um die Einheitlichkeit der Praktiken und Methoden zu gewährleisten, die bereits in der makromolekularen Kristallographie-Gemeinschaft etabliert sind, kann die Probenkühlung auf flüssige Stickstofftemperatur in jeder Laborumgebung durchgeführt werden, die mit Standard-MX-Werkzeugen ausgestattet ist.

Die kryogene Lagerung und der Transport von Proben erfordern nur handelsübliche Geräte. Für den Transfer von kryogen gekühlten Kristallen aus flüssigem Stickstoff in die Vakuumendstation ist eine spezielle Ausrüstung erforderlich. Maßgeschneiderte Probenhandhabungswerkzeuge und ein spezielles Kryotransfersystem (CTS) wurden im eigenen Haus entwickelt. Beugungsdaten, die an Proben gesammelt wurden, die mit diesem Protokoll hergestellt wurden, zeigen ausgezeichnete Zusammenführungsstatistiken, die darauf hindeuten, dass die Qualität der Proben während des Verfahrens unverändert bleibt. Dies eröffnet einzigartige Möglichkeiten für MX im Vakuum in einem Wellenlängenbereich jenseits von Standard-Synchrotron-Beamlines.

Introduction

Langwellige Röntgenbeugung wird verwendet, um die anomalen Streueigenschaften bestimmter Lichtatome zu nutzen, die nativ in Makromolekülen vorhanden sind. Dies hilft, das kristallographische Phasenproblem zu lösen und die Identität und Lage solcher Elemente innerhalb von Makromolekülen eindeutig zu bestätigen. Während in den frühen Tagen der makromolekularen Kristallographie De-novo-Strukturen durch multiplen isomorphen ^Ersatz1 gelöst wurden, sind mit dem Aufkommen abstimmbarer Röntgenstrahllinien an Synchrotrons experimentelle Phasen, die auf anomalen Beugungstechniken mit mehreren Wellenlängen und Einzelwellenlängen (SAD) basieren, zu den dominierenden Methoden ^geworden2 . Beide Methoden stützten sich in der Vergangenheit auf das isomorphe oder anomale Signal von Schwermetallen, die künstlich durch Mitkristallisation oder Kristalleinweichen in die Kristalle eingebracht werden ^müssen3. Der Trial-and-Error-Ansatz und das unvorhersehbare Ergebnis können diese Experimente frustrierend zeitaufwendig machen. Der Einbau von Seleno-Methionin während der ^{Proteinexpression4} ist ein sehr eleganter Weg, um diese Einschränkungen zu überwinden und die anomale Beugung bei kurzen Wellenlängen auszunutzen, obwohl sie in eukaryotischen Proteinexpressionssystemen sehr schwierig sein kann.

Langwelliges MX ist äußerst attraktiv für die Strukturbestimmung durch native ^{SAD-Experimente5,6} aufgrund der Bequemlichkeit, Kristalle direkt aus einer erfolgreichen Kristallisationsstudie ohne weitere Behandlung zu verwenden. Darüber hinaus eröffnet der Zugang zu den Absorptionsrändern von Elementen von hoher biologischer Bedeutung wie Kalzium, Kalium, Chlor, Schwefel und Phosphor die Möglichkeit, die Positionen dieser Elemente in Makromolekülen direkt zu identifizieren7,8,9,10. Bei mittlerer und niedriger Auflösung kann die Elementzuordnung basierend auf der 2Fo-Fc-Elektronendichte und der chemischen Umgebung schwierig sein, insbesondere für Elemente mit ähnlicher Elektronenanzahl oder schwach gebundenen Ionen mit Teilbelegungen. Diese Mehrdeutigkeiten können gelöst werden, indem Daten unterhalb und oberhalb der Absorptionskante des interessierenden Elements gesammelt und die resultierende modellgestufte anomale Differenz interpretiert werden ^{Fourier-Karten11,12}. Die Lokalisierung von Schwefelatompositionen in diesen Karten kann auch die Modellbildung in Niedrigauflösungskarten für die Elektronendichte ^{unterstützen13}. Die Absorptionskanten dieser Lichtelemente werden bei Wellenlängen zwischen λ = 3 und 6 Å beobachtet (siehe Abbildung 1, oben). Dieser Wellenlängenbereich ging weit über die Fähigkeiten jeder Synchrotron-MX-Beamline hinaus, und ein effizienter Betrieb in diesem Bereich erfordert die Überwindung mehrerer technischer Herausforderungen, wie unten beschrieben.

Beamline I23 at Diamond Light Source, UK, ist ein einzigartiges Instrument, das speziell für langwellige MX-Experimente entwickelt wurde und in einem Wellenlängenbereich zwischen λ = 1,13 und 5,9 Å (Energiebereich zwischen E = 2,1 und 11 keV) abstimmbar ist. Durch den Betrieb in einer Hochvakuumumgebung14 werden Luftabsorption und -streuung eliminiert, wodurch die Effizienz von Beugungsexperimenten und das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert werden. Eine grosse Vakuum-Endstation umschließt alle Komponenten der Probenumgebung, einschliesslich des halbzylindrischen Pilatus 12M Detektors, eines Mehrachs-Goniometers, der Online-Sicht- und Kollimationssysteme sowie der massgeschneiderten Ausrüstung für probentransfer und -lagerung (Abbildung 2). Jedes Gerät wurde optimiert, um sicherzustellen, dass langwellige Daten in bester Qualität gesammelt werden können. Der gekrümmte Pilatus 12M Detektor kann Beugungswinkel von 2θ = ±100° sammeln, was zu ausreichend hochauflösenden Beugungsdaten auch bei längsten Wellenlängen führt (Abbildung 1, unten). Die 120 Detektormodule wurden speziell für die Niedrigenergiekompatibilität ausgewählt und Kalibrierungen für einen zusätzlichen Ultra-High-Gain-Modus wurden bereitgestellt.

Die niedrigstmögliche Detektorschwelle beträgt 1,8 keV, was zu erhöhten Ecken- und Kanteneffekten für Energien unter 3,6 keV führt und eine beeinträchtigte Datenqualität bei den längsten Wellenlängen, insbesondere für Kristalle mit geringer Mosaikität, beobachtet werden kann. Dieser Effekt in Kombination mit der Abnahme der Quanteneffizienz des ^Detektors15 muss bei der Planung eines Experiments berücksichtigt werden. Das mehrachsige Goniometer ermöglicht die Neuausrichtung der Kristalle, um Datenerfassungsstrategien zu ermöglichen, die die Qualität und Stärke des anomalen Signals sowie die Vollständigkeit der gesammelten anomalen Daten maximieren. Die Probenabsorption ist ein limitierender Faktor für die Experimente, insbesondere bei längsten Wellenlängen. Absorptionskorrekturen, wie sie in häufig verwendeten MX-Verarbeitungssoftwarepaketen16,17 implementiert sind, funktionieren gut bei Wellenlängen um 3 Å. Längere Wellenlängen erfordern analytische Absorptionskorrekturen auf der Grundlage tomographischer ^{Rekonstruktionen18} oder Laserablation, um nicht entschärfendes Material zu entfernen und die Kristalle in genau definierte Formen zu ^schneiden19. Letzteres wird auch dazu beitragen, die Größe größerer Kristalle zu reduzieren, da Röntgenbeugungsexperimente bei längeren Wellenlängen für kleinere Kristalle effizienter ^sind14. Die Herausforderung, Proben während der Datenerfassung bei kryogenen Temperaturen zu halten, wird durch leitfähige Kühlung angegangen, da die Verwendung von Kaltgasstromgeräten mit offenem Durchfluss nicht mit einer Vakuumumgebung kompatibel ist. Daher werden wärmeleitfähige Materialien wie Kupfer benötigt, um die Probe mit einem Pulsrohr-Kryokühler zu verbinden. Die SPINE-Standardstifte aus Edelstahl, die in der gesamten MX verwendet werden, sowie alle anderen handelsüblichen Probenhalterungen sind aufgrund ihrer schlechten Wärmeleitfähigkeit nicht für langwellige MX im Vakuum geeignet.

Die Probenhalter (SHs) für MX im Vakuum müssen ein wesentlicher Bestandteil des Wärmeabfuhr-Wärmeweges sein (Abbildung 3A). Als solche bestehen sie aus einem wärmeleitfähigen Kupferkörper und einem Stift und verfügen über zwei wichtige Merkmale: eine starke Magnetbasis, um eine ausreichende thermische Verbindung zum Kalten Goniometerkopf zu gewährleisten, und eine Probenhalterung aus Polyimid, um die Röntgenabsorption und -streuung zu ^minimieren20. Es wurden Anstrengungen unternommen, um sicherzustellen, dass die Benutzererfahrung bei der Kristallernte und Flash-Kühlung fast identisch mit der mit Standard-MX-Praktiken verbunden ist. Da die dedizierten I23-SHs nicht direkt mit anderen Synchrotron-Beamlines kompatibel sind, wird ein Edelstahladapter für die Kompatibilität mit den kristallgewinnenden Magnetstäben und vorhandenen Goniometer-Schnittstellen an anderen MX-Beamlines verwendet (Abbildung 3B). Der Adapter ist auch wichtig, um die Automatisierungsfunktionen anderer Diamond MX-Beamlines zu nutzen, die auf ALS-Robotergreiferköpfen21 und Unipuck-Basislayouts22 basieren, wenn Probenvariationen eine schnelle Vorabsiebung zur Auswahl der besten Gebeugungskristalle erfordern. Das Probenvorbereitungs- und Ladeprotokoll kann in zwei Stufen unterteilt werden:

Stufe 1: Ernte von Kristallen und Schockgefrieren durch Benutzer in ihren eigenen Labors

Nach Der Beurteilung der Eignung des Projekts für die I23-Datenerfassung werden Probenhalter mit Schleifen, die den Kristallgrößen entsprechen (mit Adaptern vormontiert), zur Kristallgewinnung an die Benutzerlabore geschickt. Um Schäden zu vermeiden, sollten SHs und Adapter nicht getrennt werden und sind als eine Einheit zu verwenden, um Kristalle mit entsprechend großen Schleifen mit Standard-Kristallernte-Magnetstäben zu fischen. Wie bei MX üblich, wird diese Aufgabe manuell unter dem Mikroskop durchgeführt und Kristalle werden sofort in einem Schaumentwar mit flüssigem Stickstoff ^gekühlt23. Aufgrund eines Missverhältnisses der magnetischen Kräfte sind die SHs derzeit nicht mit Unipucks kompatibel. Die Lagerung und der Versand erfolgen über Combipucks (siehe Materialtabelle), die den Anwendern auf Anfrage zusammen mit den kompatiblen Dry Shipper-Einsätzen zur Verfügung stehen (Abbildung 3C). Diese Pucks teilen sich die gleiche Grundplatte mit den weit verbreiteten Unipucks und ermöglichen ein schnelles Pre-Screening von Proben an anderen Diamond MX-Beamlines. Die Ausleihe dieser Geräte an Benutzer ist derzeit die beste Vereinbarung, bis die maßgeschneiderten Probenhalter im Handel erhältlich sind. Der Transport zur Beamline erfordert die Standard-Trockenverlader, die in der MX-Community eingesetzt werden.

Stufe 2: Transfer von kryogekühlten Proben in die Vakuumendstation

Sobald die Proben auf der Beamline ankommen, werden sie für den Transfer in die Vakuumendstation vorbereitet. Dies beinhaltet die Entfernung von SHs aus Combipucks und die Trennung von Adaptern. Die Einführung biologischer Proben in das Vakuum wird routinemäßig auf dem Gebiet der Kryo-Elektronenmikroskopie durchgeführt. Einige der etablierten Konzepte wurden für den I23-Probentransfer adaptiert. Kurz gesagt, SHs werden unter flüssigem Stickstoff auf Transferblöcke übertragen (Abbildung 3D). Diese Blöcke haben eine ausgezeichnete Wärmeleitfähigkeit und eine signifikante thermische Masse, die verhindert, dass die Kristalle im Vakuum die Glasübergangstemperatur erreichen. Bis zu vier Blöcke mit einer Kapazität von jeweils vier Proben werden unter flüssigem Stickstoff in einen Block puck geladen (Abbildung 3H), der entweder für den Transfer von Proben in das Cryogenic Transfer System (CTS) oder für die Lagerung in flüssigen Stickstoff-Dewars zwischen den Experimenten verwendet wird.

Das an der Diamond Light Source entwickelte Kryotransfersystem besteht aus zwei Unterbaugruppen, der Probenstation und dem Shuttle (Abbildung 4A). Die Probenstation besteht aus einem Flüssigstickstoffbad zur Zwischenlagerung von Proteinkristallen und verfügt über spezifische Merkmale, um die Sicherheit zu gewährleisten und ein benutzerfreundliches Erlebnis zu ermöglichen (Abbildung 5). Das CTS wird von einer speicherprogrammierbaren Steuerung über eine benutzerfreundliche Touchscreen-Oberfläche gesteuert. Die Probenstation verfügt über eingebaute Leuchtdioden für eine bessere Visualisierung und eine Reihe von Heizungen, die in einem geschlossenen Regelkreis gesteuert werden, um die Trocknung des Flüssigstickstoffbades nach dem Transfer der Proben zu automatisieren. Es verfügt auch über eine Vielzahl von Sensoren, um die Sicherheit und das effiziente Funktionieren des Systems zu gewährleisten. Die Probenstation verfügt über maßgeschneiderte Hardware, um eine zuverlässige elektrische Schnittstelle für die Interaktion mit dem Shuttle für Operationen bereitzustellen, z. B. das Pumpen in grobes Vakuum für den Probentransfer sowie die Überwachung des Gehalts an flüssigem Stickstoff und der Temperatur im Inneren des Shuttles.

Das Shuttle (Abbildung 6) ist ein tragbares Gerät, das verwendet wird, um einen Transferblock aus dem Flüssigstickstoffbad der Probenstation aufzunehmen und ihn in einer kryogenen und Vakuumumgebung zur Endstation zu übertragen. Es enthält einen Flüssigstickstoff-Dewar, um die Proben während des Transfers kalt zu halten, eine Flüssigkeitsstandüberwachung im Dewar und eine Vielzahl von Sensoren für die Betriebs- und Benutzersicherheit. Der Transferarm ist mit einem Magnetantrieb ausgestattet und verfügt über bearbeitete Nuten, die den Benutzer beim sicheren Be- und Entladen von Transferblöcken in die Endstation unterstützen. Der Transfer vom Shuttle zum Vakuumbehälter erfolgt über eine Luftschleuse. Die Luftschleuse ist eine Schnittstelle für das Shuttle auf der Endstation, die verwendet wird, um den Zwischenraum zwischen dem Shuttle und der Endstation zu evakuieren, bevor die Shuttle- und Endstationsvakuumventile geöffnet werden. Die Pump- und Entlüftungsabläufe sind vollautomatisch und können über einen großen Touchscreen mit benutzerfreundlicher Oberfläche bedient werden (Abbildung 4C). Das aktuelle Protokoll wird verwendet, um einen Thaumatin-Kristall zur Datenerfassung an die Vakuumendstation zu übertragen.

Protocol

1. Kristallernte

HINWEIS: Verwenden Sie nach Möglichkeit eine geeignete persönliche Schutzausrüstung: Schutzbrille und Handschuhe.

1. Nachdem die SHs in Combipucks im Benutzerlabor angekommen sind (Abbildung 3C), trennen Sie den Deckel von der Basis des Combipucks, so dass die SHs an der Basis befestigt bleiben und die Fläschchen im Deckel gehalten werden.
2. Tauchen Sie den Deckel mit Fläschchen in flüssigen Stickstoff. Befestigen Sie einen SH +-Adapter (Abbildung 3B, rechts) an einem Magnetstab und ernten Sie Kristalle wie gewohnt.
3. Jede Probe blitzartig direkt in den Combipuck abkühlen lassen und dabei die Probenposition notieren. Um den Puck zu schließen, verwenden Sie einen Puckstab, um die Basis am Deckel zu befestigen.
4. Übertragen Sie den Combipuck von flüssigem Stickstoff auf den Trockenversender oder den Flüssigstickstoffspeicher. Versenden Sie den Trockenversender an Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html).

2. Probentransfer ins Vakuum

1. Laden von SH von combipuck in den Transferblock
   1. Legen Sie die Basis des Blockpucks (Abbildung 3H), der bereits mit leeren Transferblöcken (Abbildung 3D) bestückt ist, in einem Schaumbehälter auf seine Stützbasis im Inneren des flüssigen Stickstoffs (Abbildung 3J-b).
      HINWEIS: Die Ausrichtung der Transferblöcke ist wichtig für die Genauigkeit des Probentransfers im Vakuumgefäß. Daher sollten die Blöcke auf der Blockpuckbasis platziert werden, um sicherzustellen, dass sich der in Abbildung 3D mit einem Pfeil markierte Pin auf der linken Seite des Blocks befindet.
   2. Legen Sie den Durchstechflaschenpuck in den mit flüssigem Stickstoff gefüllten Schaumstoffbehälter, und stellen Sie sicher, dass die Basis des Pucks am magnetischen Halter im Schaumstoffbehälter befestigt ist (Abbildung 3J-a).
   3. Kühlen Sie alle notwendigen Werkzeuge in flüssigem Stickstoff vor. Verwenden Sie das in Abbildung 3G auf der hohen Einstellung H gezeigte Puck-Separator-Werkzeug, um den Deckel von der Basis zu trennen, so dass die Basis am Magnethalter befestigt bleibt und die SHs im flüssigen Stickstoff freigelegt werden.
   4. Um jeden SH von seinem Adapter zu entfernen, verwenden Sie den Trennstab (Abbildung 3F), um den SH von der Combipuck-Basis aufzunehmen, und platzieren Sie ihn an der entsprechenden Position des Übertragungsblocks in der horizontalen Position des Karussells in Abbildung 3J-b.
      1. Platzieren Sie den Trennstab so weit wie möglich über dem SH + Adapter und stellen Sie sicher, dass der Stab vertikal ist, um ein Berühren der Probe zu vermeiden.
      2. Bewegen Sie den kleinen Hebel am Trennstab mit dem Daumen nach unten, bis er klickt, um den SH im Inneren zu befestigen und den SH vom Adapter zu ziehen.
      3. Senken Sie den Separator über die gewünschte Blockposition und stellen Sie sicher, dass einer der drei Zinken in das zentrale Loch des Blocks passt.
      4. Lassen Sie den SH los, indem Sie den Hebel wieder nach oben bewegen. Wiederholen Sie diese Schritte für jeden SH.
   5. Um Proben in den nächsten Probenblock zu laden, verwenden Sie das Karussell-Schlüsselwerkzeug (Abbildung 3E), um einen leeren Block in die horizontale Position zu drehen.
   6. Befestigen Sie das in Abbildung 3G dargestellte Puck-Trennwerkzeug mit der niedrigen Einstellung L am Deckel des Blockpucks, indem Sie es im Uhrzeigersinn schrauben.
   7. Sobald alle SHs übertragen sind, legen Sie zum Schließen des Blockpucks den Deckel in flüssigen Stickstoff und warten Sie, bis sich die Temperatur ausgeglichen hat, und setzen Sie dann den Deckel über die Basis wie in Abbildung 3I. Heben Sie das Separatorwerkzeug vorsichtig an, um sich vom Karussell zu lösen.
   8. In diesem Stadium kann der Block puck zum CTS (Abbildung 4B) oder zu einem Flüssigstickstoffspeicher übertragen werden.
2. Verladung von Transferblöcken in den Vakuumbehälter
   1. Stellen Sie sicher, dass der Shuttle sicher an der Station befestigt ist. Öffnen Sie die Stickstoffgas- und Luftventile und stellen Sie sicher, dass Gase fließen. Schalten Sie das CTS ein.
   2. Wenn keine Warnmeldungen auf dem Display angezeigt werden, kühlen Sie sowohl das Bad als auch das Shuttle mit flüssigem Stickstoff ab. Legen Sie den mitgelieferten Trichter in den Füllanschluss des Shuttles und gießen Sie langsam flüssigen Stickstoff in den Trichter, während Sie den Füllstand auf dem Bildschirm überwachen. Stoppen Sie, wenn die Anzeige von Rot nach Blau wechselt.
      HINWEIS: Das Shuttle ist einsatzbereit, wenn die Temperatur des auf dem Touchscreen angezeigten Kaltsitzes unter 100 K liegt. Das Bad der Probenstation kann gleichzeitig mit dem richtigen Trichter auf das an der Wand des Bades oder zu 100% auf der Flüssigstickstoffstandsanzeige markierte Niveau gefüllt werden. Flüssigstickstoffstände und Temperatursensoren sollten während des gesamten Betriebs ständig überwacht werden. mehrere Aufladungen sind erforderlich.
   3. Sobald die Temperatur des Shuttle-Kaltsitzes unter 100 K liegt und sich der Flüssigstickstoffgehalt am Shuttle und am Bad stabilisiert, übertragen Sie einen Blockpuck aus flüssigem Stickstoff mit dem angebrachten Puck-Separator-Werkzeug in das CTS-Bad. Entfernen Sie den Deckel des Blockpucks und schließen Sie den Deckel des CTS-Bades.
   4. Um einen Block in das Shuttle einzuführen, öffnen Sie das CTS-Ventil, falls nicht bereits geöffnet, indem Sie die Taste Open Shuttle Valve auf dem Display drücken. Entriegeln Sie den Shuttle-Griff, indem Sie ihn um 90 ° im Uhrzeigersinn drehen, und bewegen Sie ihn in Richtung Bad, so dass die geführte Spur am Griff den richtigen Weg zum Bad erzwingt. Sobald die Blockabdeckung im Bad sichtbar ist, lassen Sie die Abdeckung abkühlen. Nachdem das Sprudeln von flüssigem Stickstoff um die Abdeckung aufgehört hat, gehen Sie zum Transferblock.
   5. Um den Transferblock am Shuttle zu befestigen, drehen Sie den Griff um 180° im Uhrzeigersinn.
   6. Ziehen Sie den Griff in die ursprüngliche hintere Position zurück und verriegeln Sie ihn dann durch Drehen um 90 ° gegen den Uhrzeigersinn.
   7. Drücken Sie Close Shuttle Valve & Pump auf dem Bildschirm, um die Shuttle-Evakuierung zu starten.
   8. Sobald die Meldung Shuttle ready to take take auf dem Touchscreen angezeigt wird, drücken Sie den Hebel unter dem Shuttle und heben Sie ihn vorsichtig mit dem Griff oben an.
   9. Tragen Sie das Shuttle in aufrechter Position zur Luftschleuse der Vakuumendstation.
   10. Befestigen Sie das Shuttle an der Luftschleuse der Vakuumendstation.
       HINWEIS: Einmal sicher angebracht, bestätigt der Touchscreen an der Endstation den Status des Shuttles und der Verriegelung.
   11. Wählen Sie eine leere Blockposition innerhalb des Behälters, indem Sie die entsprechende Taste auf dem Touchscreen drücken und das Probenhotel in die richtige Ladeposition bringen.
   12. Sobald das Beispielhotel in Position ist, wird die Schaltfläche Öffnen aktiv. Drücken Sie diese Taste, um die Vakuumverriegelungssequenz zu starten.
       HINWEIS: Die Pumpe startet und der Fortschritt wird auf dem Monitor angezeigt. Dies kann bis zu zwei Minuten dauern.
   13. Nachdem die Sequenz abgeschlossen ist, ändert sich der Status in Airlock geöffnet, Übertragung wird ausgeführt. Drehen Sie den Griff um 90 ° im Uhrzeigersinn, um die Stange zu entriegeln, und drücken Sie die Stange vorsichtig in das Gefäß, so dass die geführte Spur wieder den richtigen Weg in Richtung der Position des Probenhotels erzwingt. Verwenden Sie den auf dem Bildschirm angezeigten Video-Feed zur Orientierung, setzen Sie den Block langsam in das Hotel ein und stellen Sie sicher, dass das Blockpositionslicht auf dem Touch-Display aktiviert ist. Nach der Aktivierung drehen Sie den Griff um 180 ° gegen den Uhrzeigersinn, um den Block freizugeben, und ziehen Sie die Stange aus dem Gefäß. Nach dem vollständigen Einfahren drehen Sie den Griff um 90 ° gegen den Uhrzeigersinn, um die Stange zu verriegeln.
   14. Sobald die Stange gesperrt ist, wird die Schaltfläche Schließen aktiv. Drücken Sie diese, um das Vakuumventil der Endstation zu schließen, und entlüften Sie den Raum zwischen dem Shuttle und dem Behälter auf atmosphärischen Druck und warten Sie bis zu 20 s auf die Fertigstellung.
   15. Warten Sie, bis die Anzeige den Status OKAY anzeigt, um shuttle zu entfernen, sobald die Sequenz abgeschlossen ist. Entfernen Sie an diesem Punkt das Shuttle und kehren Sie zum CTS zurück, um den Vorgang für den nächsten Block zu wiederholen.
   16. Um den nächsten Block für den Transfer vorzubereiten, drehen Sie den Blockpuck im Bad. Drücken Sie den eingebauten Rotationsschlüssel auf der Oberseite des Acryldeckels nach unten in das Schloss in der Mitte des Blockpucks. Halten Sie ihn gedrückt, drehen Sie den Schlüssel , um den gewünschten Block in der Aufnahmeposition zu positionieren.
   17. Sobald alle Blöcke übertragen wurden, stellen Sie sicher, dass das Shuttle-Ventil geöffnet ist, während es auf dem CTS montiert ist. Drücken Sie die Bake-Taste auf dem Touchscreen, wählen Sie sowohl Bad als auch Shuttle aus und drücken Sie dann bake.
       HINWEIS: Dies erwärmt sowohl das Shuttle als auch das Bad, um den flüssigen Stickstoff abzukochen und anschließend angesammeltes Eis / Kondenswasser vor dem nächsten Gebrauch zu verdampfen. Sobald der Backvorgang begonnen hat, können Gas und Luft abgeschaltet werden.

Results

Ein Thaumatinkristall wurde unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls in die Vakuumendstation eingeführt. Beugungsdaten wurden bei einer Wellenlänge von 2,7552 Å (E = 4500 eV) als 3600 Bilder mit einem Rotationsschritt von 0,1° und 0,1 s Belichtung pro Bild gesammelt. Die Strahlgröße wurde auf 150 μm x 150 μm eingestellt und auf 10% Transmission reduziert, mit einer entsprechenden Flussmessung von 7,1 x ¹⁰⁹ Photonen/s. Die Wahl von λ = 2,7552 Å basiert auf einem Kompromiss zwischen der Zunahme anomaler Signal- und Probenabsorptionseffekte und der Abnahme der Auflösung auf längere Wellenlängen. Obwohl nicht in der Nähe der theoretischen Absorptionskante von Schwefel (λ= 5,0095 Å), beträgt der imaginäre Beitrag zum Streufaktor von Schwefel f" bei dieser Wellenlänge 1,57 e^- , ein Faktor von 1,6-2,1 größer im Vergleich zu Wellenlängen zwischen 1,7 und 2 Å. Die daraus resultierenden stärkeren anomalen Signale ermöglichen ein erfolgreiches S-SAD-Phasing für anspruchsvollere Projekte.

An der Beamline I2324,25,26,27 wurden bereits eine Vielzahl schwieriger Phasing-Experimente durchgeführt, wobei Daten bei dieser Wellenlänge gesammelt wurden. Während das Phasing durch S-SAD mit viel kürzeren Wellenlängen möglich ist, erfordert dies oft den Aufbau eines anomalen Signals durch Zusammenführen von Daten aus vielen isomorphen Kristallen, um Multiplizitätswerte über ¹⁰⁰²⁸ zu erreichen. Aufgrund des verbesserten anomalen Signals bei längeren Wellenlängen benötigten die meisten Phasing-Projekte, die auf I23 gelöst wurden, nur Daten von einem Kristall. Ein repräsentatives Beugungsbild ist in Abbildung 7 links dargestellt. Die Datenverarbeitung mit Xia2-3dii29 ergab hervorragende Zusammenführungsstatistiken, wie in Tabelle 1 dargestellt. Abbildung 7, rechts, zeigt einen Teil eines repräsentativen Beugungsbildes aus dem Thaumatin-Datensatz und veranschaulicht den niedrigen Hintergrund, der die Bragg-Reflexionen umgibt, was zu den großen I/σ(I)-Werten beiträgt, die typischerweise im Vakuum-Setup beobachtet werden, um sicherzustellen, dass nur von der Probe gestreute Röntgenstrahlen den Detektor erreichen.

Die maximal erreichbare Auflösung von 1,8 Å ist auf die Detektorgeometrie und die gewählte Wellenlänge der Röntgenstrahlung zurückzuführen. Der Datensatz lieferte ein sehr starkes anomales Signal, das sich in der mittleren Steigung des anomalen normalen Wahrscheinlichkeitsparameters von 2,677 widerspiegelte und die Strukturlösung durch die automatische Phasenpipeline CRANK2 erleichterte. Die hohe Qualität der resultierenden Elektronendichtekarte ermöglichte eine erfolgreiche automatische Modellbildung durch das ^{Buccaneer30-Modul} innerhalb von ^CRANK231 mit korrekter Platzierung für 100% der Aminosäuresequenz von Thaumatin. Die mit ^ANODE11 berechnete Fourier-Karte mit phasenanomaler Differenz zeigt 16 sehr wohlgeordnete Schwefelatome und ein Schwefelatom aus Cys159 mit zwei alternativen Konformationen, wie die 18 signifikanten Höhen der Peaks an den Positionen der anomalen Streuer in Tabelle 2 bestätigen. Die 16 Cysteinreste in Thaumatin bilden 8 Disulfidbrücken, die alle in der 2Fo-Fc-Karte deutlich sichtbar sind (Abbildung 8).

Abbildung 1: Hochauflösende Beugungsdaten aus langwelligen MX-Experimenten. (A) Diagramm der f"-Werte gegen die Energie, das die Absorptionskanten der leichten Elemente angibt, die auf der Beamline I23 zugänglich sind. (B) Maximale Auflösung, die an den Ecken des P12M-Detektors gegen Energie erreichbar ist. Abkürzung: MX = makromolekulare Kristallographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Horizontaler Querschnitt durch das Vakuumgefäß mit allen Komponenten der Endstation. Abkürzung: OAV = On-Axis Viewing System. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Werkzeuge zur Probenhandhabung. (A) I23 Probenhalter. (B) MX-Spine-Standard-Pin (links) neben einem I23-Probenhalter mit Adapter (rechts). (C) Combipuck Deckel und Boden mit I23 Probenhaltern (blau). Block PuckDeckel und Base mit zwei Transferblöcken (Gold). Auf der Rückseite ist ein Dry Shipper Cane sichtbar, der sowohl mit Combipucks als auch mit Block Pucks kompatibel ist. (D) Transferblock mit vier I23-Probenhaltern. (E) Schlüsselwerkzeug für die Rotation der Blockpuckbasis. (F) Trennstab. (G) Puck-Trennwerkzeug mit zwei Pfeilen, die die hohen und niedrigen Einstellungen anzeigen. (H) Block Puck Base mit vier leeren Cu Blocks. (I) Deckel für den Blockpuck. (J) Schaumstoffbehälter mit allen notwendigen Werkzeugen zum Übertragen von Probenhaltern von Combipuck-Basen auf Kupferblöcke. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Kryogenes Transfersystem. (A) CTS-Probenstation mit angeschlossenem Shuttle und den zum Befüllen verwendeten Trichtern. (B) Ein Blockpuck mit zwei Transferblöcken, die im CTS positioniert sind. (C) Touchscreen der CTS-Steuerungssoftware. Abkürzung: CTS = Cryogenic Transfer System. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Probenstation des kryogenen Transfersystems. Abkürzungen: LEDs = Leuchtdioden; LN2 = flüssiger Stickstoff. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Shuttle des kryogenen Transfersystems. Abkürzungen: LEDs = Leuchtdioden; LN2 = flüssiger Stickstoff. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Beugungsbilder. Links ein Beugungsbild aus dem Datensatz, der auf dem Thaumatin-Kristall gesammelt wurde. Rechts, ein Beugungspunkt, der von Hintergrundpixeln mit geringer Anzahl umgeben ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Strukturlösung von Thaumatin mit automatischer Pipeline CRANK2 (Standardeinstellungen, keine nachträgliche Verfeinerung). (A) Übersicht über Thaumatin mit 2Fo-Fc-Karte bei 1,6σ (blau) und phased anomaler Differenz Fourier-Karte bei 5σ berechnet in ANODE (grün). (B) Übersicht über Thaumatin, die nur die phasenweise anomale Differenz Fourier-Karte bei 5σ zeigt. (C) Nahaufnahme einer in Thaumatin vorhandenen Disulfidbrücke mit 2Fo-Fc-Karte bei 1,6σ (blau) und phasenweiser anomaler Differenz Fourier-Karte bei 5σ. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Name	Thaumatin
Datenerfassungswellenlänge (Å) (Energie (eV))	2.7552 (4500)
Anzahl der Bilder x Keilgröße (°)	3600 x 0,1
Raumgruppe	S. 41212
Einheitszellenkonstanten
(a = b, c) (Å)	57.8, 150.2
(α = β = γ) (°)	90
Auflösung (Å)	150.22–1.80 (1.84–1.80)
Vollständigkeit	96.3 (81.1)
Isa	36.48
Rmeas	0.042 (0.118)
Rpim	0.01 (0.049)
CC1/2	1 (0.989)
I/σ(I)	57.9 (14.7)
Multiplizität	15.0 (5.4)
Mittlere Steigung	2.677

Tabelle 1: Datenerhebungs- und Verarbeitungsstatistik für Thaumatin bei 2,755 Å Wellenlänge an der Beamline I23, DLS. Für Auflösung, Vollständigkeit, _Rmerge, _Rmeas, _Rpim, _CC1/2, I/σ(I) und Multiplizität sind hochauflösende Shells in Klammern dargestellt. Abkürzung: DLS = Diamond Light Source.

Nächstes Atom	Spitzenhöhe (Sigma)
CYS9	25.83
CYS56	25.03
MET112	24.54
CYS149	24.37
CYS126	24.21
CYS145	24.2
CYS134	23.6
CYS177	23.48
CYS204	23.43
CYS66	23.17
CYS164	22.54
CYS193	22.15
CYS158	21.51
CYS77	21.21
CYS121	20.8
CYS71	19.17
CYS159_1	12.27
CYS159_2	8.34

Tabelle 2: Anomale Differenz Fourier-Kartenspitzenhöhen, berechnet von ANODE unter Verwendung des phasenweisen und automatisch erstellten Modells von CRANK2.

Discussion

Das aktuelle Protokoll wurde entwickelt, um die Anforderungen an die Probenvorbereitung für langwellige MX-Experimente im Vakuum auf der Beamline I23 zu erfüllen. Es ist seit einem Jahr auf der Beamline im Einsatz und hat zum erfolgreichen Abschluss mehrerer Projekte beigetragen. Wie aus den hier vorgestellten Ergebnissen hervorgeht, ermöglicht das Protokoll einen sicheren und zuverlässigen Transfer der Proben zur Vakuumendstation unter Beibehaltung ihrer Beugungsqualität. Es ist ein wichtiger Aspekt für den Beamline-Betrieb und wird von einer persönlichen Anwenderschulung durch beamline-Mitarbeiter begleitet. Einige der Schritte sind es wert, als entscheidend für den erfolgreichen und sicheren Abschluss des Verfahrens hervorgehoben zu werden: Die Übertragung von Proben von Sammelbasen in Probenblöcke erfordert Genauigkeit und Aufmerksamkeit, um schädliche Proben zu vermeiden (siehe Schritt 2.1.4); Die Überwachung des Gehalts an flüssigem Stickstoff in allen Stufen ist wichtig, um zu verhindern, dass Proben der Luft ausgesetzt werden oder in engem Kontakt mit Teilen stehen, die nicht ordnungsgemäß gekühlt sind (2.1.3 und 2.2.2); warten, bis die Close-Sequenz (2.2.14) vollständig abgeschlossen ist, bevor das Shuttle von der Endstation (2.2.15) entfernt wird, um eine Verschlechterung des Endstationsvakuums zu vermeiden.

Die Konzeption des Protokolls wurde zusammen mit einer technischen Anstrengung eingeleitet, die darauf abzielte, speziell entwickelte Geräte für den Transfer von Proteinkristallen in die Vakuumumgebung zu entwickeln. Die Endprodukte dieses Projekts waren das CTS und die oben beschriebenen Probenhandhabungswerkzeuge. Das CTS ist eine deutliche Verbesserung gegenüber seinem Vorgänger, dem Leica EM VCT10014, und beseitigt mehrere Einschränkungen, wie das Fehlen von Probenabschirmung und Vakuumumgebung während des Transfers, Eisbildung im Flüssigstickstoffbad und das Fehlen einer intuitiven Benutzeroberfläche und Sicherheitsfunktionen. Weitere Merkmale des CTS, die die Benutzerfreundlichkeit verbessern, sind die Temperatur- und Flüssigstickstoffstandsüberwachung im Shuttle und in der Probenstation, ein Größeres Kapazitätsbad, das vier Blöcke gleichzeitig anstelle von einem aufnehmen kann, und ein selbstgeführter Mechanismus für den Shuttle-Betrieb. Das CTS ist vollständig in das Beamline-Steuerungssystem integriert, mit einer benutzerfreundlichen Touchscreen-Oberfläche und verbesserter Vakuum- und mechanischer Sicherheit bei der Anbindung an die Endstation.

Beamline I23 ist das erste langwellige MX-Synchrotroninstrument seiner Art und erforderte daher erhebliche Anstrengungen, um Proteinkristalle in eine Hochvakuumumgebung einzuführen und bei kryogenen Temperaturen zu speichern. Verbesserungen an den Probenvorbereitungswerkzeugen und -protokollen sowie die Bemühungen zur Rationalisierung der Prozesse sind im Gange. Im Rahmen der Benutzerunterstützung stehen beamline-Mitarbeiter jederzeit zur Verfügung, um bei der Fehlerbehebung zu helfen. Ein Beispiel für ein solches Szenario wären Probleme, die die Integrität des Vakuumsystems beeinträchtigen und zu Schwierigkeiten beim Anbringen oder Entfernen des Shuttles an / von der CTS- oder Endstationsluftschleuse führen. Verschiedene Teststufen werden wöchentlich und täglich durchgeführt, und die Benutzerschulung umfasst zusätzliche Prüfungen, um potenzielle Ausfälle zu vermeiden, wie z. B. die visuelle Inspektion der O-Ringe an den Schnittstellen, an denen das Shuttle befestigt ist. Während die Vakuumumgebung die Möglichkeit eröffnet, Beugungsexperimente in einem Wellenlängenbereich durchzuführen, der an anderen Beamlines nicht zugänglich ist, reduziert der zusätzliche Transferschritt den Gesamtprobendurchsatz.

Der manuelle Transfer mit nur vier Proben pro Transferblock und bis zu fünf Blöcken im Vakuumgefäß begrenzt die Gesamtkapazität auf 20 Proben. Daher sollten bei Projekten mit einer großen Probenvariabilität Proben an den Diamond-Hochdurchsatz-Beamlines vorgesiebt werden, und dann sollten nur die vielversprechendsten Proben für das anschließende optimierte langwellige Experiment übertragen werden. Während die Probenhalter und die Transferblöcke seit ihrer Einführung vor einigen Jahren unverändert sind, handelt es sich bei den hier vorgestellten Handhabungswerkzeugen um Neuentwicklungen. Die I23-Probenhalter sind aufgrund ihrer Rolle im Kühlkonzept für die Beamline unveränderlich. Daher zielte das Design der Probenhandhabungswerkzeuge darauf ab, eine Verbindung zwischen dieser neuen Art von Halter und kommerziell erhältlichen Standardwerkzeugen herzustellen, die die MX-Benutzergemeinschaft seit langem übernommen hatte, wie z. B. Combipucks, Kristallerntestäbe und das Transportsystem für Trockenversender. Ihr Design beinhaltete erhebliche Konsultationen mit der Benutzergemeinschaft und erforderte mehrere Iterationen. Die hier vorgestellten Geräte, Werkzeuge und Protokolle stellen ein einfaches und robustes System für den Transfer von Benutzerproben für Experimente an der Beamline I23 an der Diamond Light Source dar. Dieses Instrument für die langwellige makromolekulare Kristallographie im Vakuum eröffnet neue Möglichkeiten für die Strukturbiologie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12M-Detektor	Dectris, Schweiz		Einzelphotonen-zählender Röntgendetektor
CombiPuck	MiTeGen	Artikelnummer: M-CBP-P1	Kryopucks für die kryogene Lagerung und den Transport von I23-Probenhaltern und
Proben Magnetstab für die Kristallgewinnung	Molecular Dimensions	MD7-411	Wird für die Kristallernte
Dry Shipper (CX100)	Molecular Dimensions	MD7-21	Wird für die kryogene Lagerung und den Transport von I23-Probenhaltern und Proben verwendet
Trockener Shipper-Einsatz (CombiPuck>Transportstock)	MiTeGen		Wird für die kryogene Lagerung und den Transport von I23-Probenhaltern und Proben
verwendet Kapton-Polyimid			Probenhalterung aus Kapton-Polyimid
Perpsex-Deckel			aus Acryl mit eingebautem Drehschlüssel
Thaumatin-Pulver	Sigma-Aldrich	T7638	Wird zur Herstellung von Thaumatin-Kristallen durch Dampfdiffusion verwendet