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Methodenartikel

Automatisierte Erkennung und Analyse von Exozytose

3.3K Aufrufe

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DOI:

10.3791/62400

⸱

11. September 2021

 , 
1UNC Neuroscience Center, Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir haben eine automatisierte Computer-Vision-Software entwickelt, um exozytäre Ereignisse zu erkennen, die durch pH-sensitive Fluoreszenzsonden gekennzeichnet sind. Hier demonstrieren wir die Verwendung einer grafischen Benutzeroberfläche und RStudio, um Fusionsereignisse zu erkennen, räumlich-zeitliche Parameter der Fusion zu analysieren und anzuzeigen und Ereignisse in verschiedene Fusionsmodi zu klassifizieren.

Zusammenfassung

Die Zeitraffer-TIRF-Mikroskopie von pH-sensitivem GFP (pHluorin), das an Vesikel-SNARE-Proteine gebunden ist, ist eine effektive Methode, um exozytäre Ereignisse einzelner Vesikel in Zellkulturen sichtbar zu machen. Um eine unvoreingenommene, effiziente Identifizierung und Analyse solcher Ereignisse durchzuführen, wurde ein Computer-Vision-basierter Ansatz entwickelt und in MATLAB implementiert. Die Analysepipeline besteht aus einem Zellsegmentierungs- und exozyttischen Ereignisidentifikationsalgorithmus. Der Computer-Vision-Ansatz umfasst Werkzeuge zur Untersuchung mehrerer Parameter einzelner Ereignisse, einschließlich der Halbwertszeit des Fluoreszenzzerfalls und des Peak-ΔF / F sowie der Ganzzellanalyse der Häufigkeit der Exozytose. Diese und andere Parameter der Fusion werden in einem Klassifikationsansatz verwendet, um verschiedene Fusionsmodi zu unterscheiden. Hier führt eine neu erstellte GUI die Analysepipeline von Anfang bis Ende durch. Eine weitere Anpassung von Ripleys K-Funktion in R Studio wird verwendet, um zwischen geclusterten, dispergierten oder zufälligen Auftreten von Fusionsereignissen in Raum und Zeit zu unterscheiden.

Einleitung

VAMP-pHluorin-Konstrukte oder Transferrinrezeptor (TfR)-pHuji-Konstrukte sind ausgezeichnete Marker für exozytäre Ereignisse, da diese pH-sensitiven Fluorophore im sauren Vesikellumen abgeschreckt werden und unmittelbar nach der Fusionsporenöffnung zwischen Vesikel und Plasmamembran fluoreszieren1. Nach der Öffnung der Fusionsporen zerfällt die Fluoreszenz exponentiell, mit einer gewissen Heterogenität, die Informationen über das Fusionsereignis preisgibt. Hier wird eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) beschrieben, die exozytäre Ereignisse automatisch erkennt und analysiert. Diese Anwendung ermöglicht es dem Benutzer, exozytäre Ereignisse, die durch pH-empfindliche Marker2 aufgedeckt werden, automatisch zu erkennen und aus jedem Ereignis Merkmale zu generieren, die für Klassifizierungszwecke verwendet werden können3 (Abbildung 1A). Zusätzlich wird die Analyse des exozyttischen Ereignisclusterings mit Ripleys K-Funktion beschrieben.

Die automatisierte Klassifizierung exozytischer Ereignisse in verschiedene exozytäre Modi wurde kürzlich berichtet3. Zwei Modi der Exozytose, die Vollvesikelfusion (FVF) und die Kiss-and-Run-Fusion (KNR) Exozytose, wurden zuvor beschrieben4,5,6,7. Während der FVF erweitert sich die Fusionspore und das Vesikel wird in die Plasmamembran eingebaut. Während des KNR öffnet sich die Fusionspore vorübergehend und verschließt dann4, 5,8,9,10. Vier Modi der Exozytose wurden in sich entwickelnden Neuronen identifiziert, zwei verwandt mit FVF und zwei mit KNR. Diese Arbeit zeigt, dass sowohl FVF als auch KNR weiter unterteilt werden können in Fusionsereignisse, die unmittelbar zum Fluoreszenzzerfall (FVFi und KNRi) nach Fusionsporenöffnung übergehen, oder exozytäre Ereignisse, die eine Verzögerung nach der Fusionsporenöffnung aufweisen, bevor der Fluoreszenzzerfall beginnt (FVFd und KNRd) (Abbildung 1B). Der Klassifikator identifiziert den Modus der Exozytose für jedes Fusionsereignis. Hier wurde diese Analyse in eine GUI integriert, die in MATLAB in Windows- und Mac-basierten Betriebssystemen installiert werden kann. Alle Analysedateien finden Sie unter https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing oder
https://github.com/GuptonLab.

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Protokoll

1. Wählen Sie Datensätze und Verzeichnis

  1. Um Datensätze für die Analyse auszuwählen, klicken Sie auf die Schaltfläche Datensätze suchen (Abbildung 2A, rotes Feld 1), um zu dem Ordner zu navigieren, in dem Daten abgelegt werden (z. B. RawData-Ordner). Datendateien füllen die Datendateien automatisch als Liste auf. Der Ordner kann sich über mehr als ein Dataset befinden.
  2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Verzeichnis auswählen und wählen Sie das Verzeichnis (z. B. Test) aus, in dem die analysierten Dateien abgelegt werden sollen (Abbildung 2A, rotes Feld 2). Eine Reihe von Ordnern und fertigen Analysedateien sowie temporäre Zwischenbilder werden in diesem Verzeichnis erstellt, wenn die Schaltfläche Analyse gedrückt wird. Wenn kein Verzeichnis ausgewählt wird, werden Fehler erzeugt.

2. Pixelgröße und Framerate einstellen

  1. Geben Sie die entsprechende Bildrate und Pixelgröße der Bilder in das entsprechende Feld "Framerate" oder "Pixelgröße" ein (Abbildung 2A, grünes Feld). Wenn keine Werte angegeben werden (sie sind auf die Standardeinstellung "0" gesetzt), durchsucht das Programm die mit der Datei verknüpften Metadaten nach Framerate und Pixelgröße. Wenn diese Werte nicht gefunden werden können, verwendet das Programm standardmäßig pro Pixel für die Messung und pro Bild für Zeitpunkte.
    HINWEIS: Im angegebenen Beispiel beträgt die Framerate 100 und die Pixelgröße 0,08.

3. Masken auswählen oder erstellen

  1. Verwenden Sie die Schaltfläche Masken-Maker, um automatisch Zellenmasken für die Daten in der Datei-Dataset-Liste zu erstellen (Abbildung 2A, blaues Feld). Wenn Sie die Schaltfläche Mask Maker verwenden, wird ein neuer Ordner im ausgewählten Verzeichnis mit dem Namen MaskFiles erstellt. Die "Run-Anzeige" wird während des Laufens gelb und kehrt nach Abschluss zu Grün zurück.
    HINWEIS: Eine Maske für jede Datei in der Liste Datendateien wird aus den ersten 10 Frames der Bilddatei (oder aus allen Frames, wenn sich weniger als 10 in der Bilddatei befinden) erstellt und im Ordner MaskFiles mit dem richtigen Benennungsschema (siehe unten) abgelegt.
  2. Stellen Sie sicher, dass die Maskendateien automatisch die Liste Maskendateien füllen. Der Benutzer kann direkt mit der Analyse fortfahren.
    HINWEIS: Überprüfen Sie Maskendateien immer visuell und bestätigen Sie, dass sie den gesamten interessierenden Bereich erfassen. Der erste Frame der Datendatei und die Maskendatei werden auf der Benutzeroberfläche angezeigt, wenn diese Option ausgewählt ist. (Abbildung 2B). Der Mask Maker kann bei geringem Signal-zu-Rauschen Fehler verursachen, daher ist die Validierung der Eignung von Maskendateien für die Qualitätskontrolle von entscheidender Bedeutung.
  3. Als Alternative zur Verwendung von Mask Maker, wenn das Signal zum Rauschen von Bildern nicht ausreicht, erstellen Sie Masken manuell in ImageJ.
    1. Öffnen Sie zunächst die RAW-Bilddatei in ImageJ (Abbildung 3A).
    2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Polygonauswahl, und klicken Sie auf , um eine Maske um die Zelle zu zeichnen. Wenn Sie fertig sind, doppelklicken Sie auf den letzten Punkt, um das Polygon zu vervollständigen.
    3. Wenn Sie fertig sind, navigieren Sie zu bearbeiten | Auswahl | Maske erstellen (Abbildung 3B). Basierend auf der Polygonzeichnung wird eine neue invertierte Maske erstellt. Speichern Sie Masken in einem bestimmten MaskFiles-Ordner im ausgewählten Verzeichnis. Das Benennungsschema der Maskendatei muss mit den entsprechenden einzelnen Datendateien übereinstimmen, gefolgt von "_mask_file". Wenn eine Datendatei beispielsweise den Namen "VAMP2_488_WT_1.tif" hat, muss die entsprechende Maskendatei den Namen "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" tragen.
    4. Verwenden Sie die Schaltfläche Maskendateien suchen, um zum ausgewählten Ordner mit hinterlegten benutzerdefinierten Maskendateien zu navigieren. Die Masken füllen die Maskendateien als Liste.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass Sie für jede Datendatei eine Maske haben, bevor Sie die Analyse ausführen.

4. Analyse und Merkmalsextraktion

  1. Nachdem das Verzeichnis ausgewählt und die Listen Datendateien und Maskendateien aufgefüllt wurden, klicken Sie auf die Schaltfläche Analyse (Abbildung 4A). Wenn die Klassifizierung exozytischer Ereignisse erforderlich ist, fahren Sie mit Schritt 5 fort.
    HINWEIS: Mit dem Klick auf die Schaltfläche Analyse wird eine Reihe automatisierter Aufgaben ausgeführt, um die Daten zu analysieren. Es werden einzelne Ordner im ausgewählten Verzeichnis erstellt, um die analysierten Daten zu hinterlegen. Während des Betriebs wechselt die "Laufanzeige" von grün nach gelb (Abbildung 4A, rotes Feld). Nachdem die Analyse abgeschlossen ist, ändert sich diese wieder auf Grün.
  2. Suchen Sie einen DataFiles-Ordner (Abbildung 4B) mit dem vollständigen Satz von Analysedateien (sowie Feature-Extraktionsdateien, die später in der Klassifizierung verwendet werden sollen), die nach jeder Datendatei benannt sind (Abbildung 4C).
    HINWEIS: Eine Beschreibung dieser Analysedateien finden Sie unten im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.

5. Klassifizierung exozytischer Ereignisse

  1. Um die gleichzeitige Klassifizierung exozytischer Ereignisse mit automatischer Erkennung durchzuführen, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Klassifizierung, bevor Sie auf die Schaltfläche Analyse klicken. Weisen Sie für jedes exozytäre Ereignis für jede Klasse einen Wahrscheinlichkeitswert zwischen 0-1 zu. Ein exozytäres Ereignis gilt als eine der vier Klassen, wenn die Wahrscheinlichkeitsbewertung für diese Klasse > 0,5 beträgt.
    HINWEIS: Sobald die Analyse abgeschlossen ist, wird ein neuer Datendateiordner im ausgewählten Verzeichnis angezeigt. Der Ordner enthält Analysedateien, die jeder Bilddatei entsprechen.

6. Raumzeitliche Analyse der Exozytose mit Ripleys K-Werten

    7. RStudio einrichten

    1. Öffnen Sie Rstudio und öffnen Sie ripleys_k_analysis. R-Datei.
    2. Installieren Sie das Paket "spatstat" in RStudio, indem Sie zu Tools | Installieren Sie Pakete und geben Sie "spatstat" ein, gefolgt von einem Klick auf Installieren.
      HINWEIS: Dies muss nur einmal pro Rstudio-Installation durchgeführt werden.
    3. Führen Sie die Bibliothek spatstat zu Beginn jeder Sitzung aus.
    4. Achten Sie in diesem Fall auf zwei Hauptvariablen: "neuron_mask" und "neuron_datapoints". Neuron Mask verweist auf den Satz von Maskendateien, die ausgeführt werden sollen, d. H. Soma-Maskendateien."
      HINWEIS: Führen Sie alle Soma-Maskendateien zusammen aus, getrennt von Neurite-Maskendateien und umgekehrt.
    5. Lesen Sie in der .csv der Maskendateien für jedes der zu analysierenden Neuronen.
    6. Führen Sie mehrere Dateien gleichzeitig aus, indem Sie zusätzliche neuron_mask_n+1 kopieren. Auf diese Weise kann Ripleys Analyse mithilfe des in Abschnitt 8 beschriebenen Skripts aggregiert werden.
    7. Überprüfen Sie nun die zweite Variable, "neuron_datapoints".
    8. Lesen Sie in der." X_fluorescent_traces.csv" Datei, die vom Analyseprogramm generiert wird (von enthält alle extracted_R Datei) mit den x,y,t-Positionen der exozyten Ereignisse sowie die neuritenspezifische Datei der x,y-Positionen für das 2D-Netzwerk. Dies geht in die Position "neuron_datapoints".
    9. Wählen Sie in RStudio Code | aus | ausführen Führen Sie alle aus. Dadurch werden mehrere Diagramme generiert, darunter die gruppierten Ripley-K-Werte sowie Dichtediagramme.
    10. Speichern Von Plots unter Exportieren von | Bild speichern unter | Wählen Sie das entsprechende Bildformat und Verzeichnis aus, geben Sie den entsprechenden Dateinamen ein, und klicken Sie dann auf Speichern.
      HINWEIS: Die Plotfunktion für die Heatmaps wird im Skript mit "plot(density(soma_data,0.4))" aufgerufen. Die Zahl "0,4" steht hier für die Glättung der Dichtefunktion. Es kann geändert werden, um Benutzerdaten auf sinnvolle Weise anzupassen, aber wenn Vergleiche zwischen verschiedenen Heatmaps durchgeführt werden sollen, muss die Anzahl zwischen ihnen gleich sein.
    11. Exportieren oder Speichern von Bildern aus Rstudio. Wenn eine Heatmap weiter bearbeitet werden muss, wählen Sie einen geeigneten Dateityp (SVG oder EPS).

    8. Ripleys Analyse

    HINWEIS: Die Ripleys_k_analysis. R-Datei generierte auch automatisch Ripleys k-Wert-Plots. Durch das Ausführen des gesamten Skripts werden automatisch die unten genannten Funktionen ausgeführt, aber es ist im Detail enthalten, wenn man jeden Teil des Skripts einzeln ausführen oder Änderungen an der Analyse vornehmen möchte.

    1. Führen Sie zunächst die Hüllkurvenfunktion für jede Zelle aus. Diese Funktion simulierte die vollständige räumliche Zufälligkeit (CSR), um den Ripley-K-Wert des exozyten Ereignispunktmusters zu testen.
      Data_envelope_1 = Umschlag(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
      Data_envelope_2 = Umschlag(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
    2. Als Nächstes bündeln Sie diese Umschläge und erstellen eine Schätzung der CSR für die Gruppe:
      Pool_csr = pool(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
      Führen Sie als Nächstes die Ripley's K-Funktion für alle Datenpunkte aus.
      Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, Verhältnis = TRUE)
      Data_ripleys_k_2 = Turm(soma_data_2, Verhältnis = TRUE)
    3. Wenn Sie fertig sind, bündeln Sie die Ripley's K-Werte und bootstrappen Sie ihre Konfidenzintervalle mit dem folgenden Befehl:
      Datenpool = Pool(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)
    4. Bootstrappen mit dem folgenden Befehl:
      Final_Ripleys_K = varblock(fun = Kest, Data_pool)
    5. Zeichnen Sie die Daten auf.
    6. Wenn ein hartstatischer Unterschied erforderlich ist, ist der Studentisierte Permutationstest im spatstat-Paket enthalten, um auf einen Unterschied zwischen Gruppen von Punktmustern zu testen:
      Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ Gruppe, nperm = np).

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    Ergebnisse

    Hier wurde die GUI (Abbildung 2A) verwendet, um exozytäre Ereignisse von drei VAMP2-pHluorin exprimierenden Neuronen bei 3 DIV mittels TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) zu analysieren. E15.5 kortikale Neuronen wurden isoliert, gefolgt von einer Transfektion mit VAMP2-pHluorin und einer Beschichtung unter Verwendung der Protokolle, wie in Winkle et al., 2016 und Viesselmann et al., 201111,12beschrieben. Die Met...

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    Diskussion

    Bitte beachten Sie bei der Verwendung der exozytischen Erkennungs- und Analysesoftware, dass das Programm nur verlustfreie Komprimierung .tif Dateien als Eingabe akzeptiert. Die .tif Bilddateien können 8-Bit-, 16-Bit- oder 32-Bit-Graustufenbilder (Einzelkanal) sein. Andere Bildformate müssen vor der Eingabe in einen dieser Typen konvertiert werden. Als Referenz werden hier Beispiele als 16-Bit-Graustufenbilder verwendet.

    Im Rahmen des automatisierten Erkennungsprozesses werden die Zeitraffer-B...

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    Offenlegungen

    Die Autoren erklären nichts zu enthüllen.

    Danksagungen

    Wir danken Dustin Revell und Reginald Edwards für das Testen von Code und GUI. Die Finanzierung wurde von den National Institutes of Health zur Verfügung gestellt, die diese Forschung unterstützten: einschließlich R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) und F31NS103586 (FLU).

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    Materialien

    Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
    NameUnternehmenKatalognummerKommentare
    MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
    RR Core Teamhttps://www.r-project.org/
    RstudioRstudio, PBChttps://rstudio.com/

    Referenzen

    1. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
    2. Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
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    Nachdrucke und Genehmigungen

    Tags

    ExozytoseanalyseTIRF-MikroskopiepHluorin-ImagingVesikelfusionKlassifizierung exozytotischer EreignisseZellsegmentierungRipley-K-AnalyseFluoreszenzabfallneuronale Exozytose
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