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Methodenartikel

Isolierung von erwachsenen menschlichen Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenen Kortex mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung

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DOI:

10.3791/62405

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16. April 2021

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1Department of Pathology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Neuroscience and Friedman Brain Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Institutes of Brian Science, Fudan University, 4Department of Psychiatry, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir haben eine Methode entwickelt, die menschliche Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenem Gewebe anreichert und isoliert, um sie in nachgelagerten molekularen Analysen zu verwenden.

Zusammenfassung

Die Komplexität menschlicher Astrozyten ist im primären menschlichen Gewebe nach wie vor schlecht definiert und erfordert bessere Werkzeuge für ihre Isolierung und molekulare Charakterisierung. Die fluoreszenzaktivierte Nuclei Sorting (FANS) kann verwendet werden, um menschliche neuronale Kernpopulationen (NeuN +) erfolgreich aus gefrorenem Archivgewebe zu isolieren und zu untersuchen und so Probleme im Zusammenhang mit der Handhabung von frischem Gewebe zu vermeiden. Es fehlen jedoch Bemühungen, Astroglia in ähnlicher Weise vom nicht-neuronalen (NeuN-) Element zu isolieren. Eine kürzlich entwickelte und validierte Immunotagging-Strategie verwendet drei Transkriptionsfaktor-Antikörper, um gleichzeitig angereicherte neuronale (NeuN +), Astrozyten- (gepaart Boxprotein 6 (PAX6) + NeuN-) und Oligodendrozyten-Vorläufer- (OLIG2 + NeuN-) Kernpopulationen aus nicht erkranktem, frischem (nicht fixiertem) postmortalem humanem temporalem Neokortexgewebe zu isolieren.

Diese Technik erwies sich als nützlich für die Charakterisierung von zelltypspezifischen Transkriptomveränderungen im primären pathologischen Epilepsie-Neokortex. Transkriptomische Analysen bestätigten, dass PAX6+NeuN-sortierte Populationen robust für Pan-Astrozytenmarker angereichert sind und Astrozyten sowohl unter ruhenden als auch unter reaktiven Bedingungen einfangen. Dieses Papier beschreibt die FANS-Methodik zur Isolierung von Astrozyten-angereicherten Kernpopulationen aus frisch gefrorenen menschlichen Kortex, einschließlich der Gewebedissoziation in Einzelkernsussuspension (sn); Immuntagging von Kernen mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern gegen NeuN und PAX6; FANS Gating-Strategien und Qualitätskontrollmetriken zur Optimierung der Sensitivität und Spezifität während der Sortierung und zur Bestätigung der Astrozytenanreicherung; und empfohlene Beschaffung für die nachgelagerte Transkriptom- und Chromatin-Zugänglichkeitssequenzierung in Massen- oder SN-Auflösung. Dieses Protokoll gilt für nicht-nekrotische, frisch gefrorene, menschliche kortikale Proben mit verschiedenen Pathologien und empfohlener postmortaler Gewebeentnahme innerhalb von 24 h.

Einleitung

Die molekulare Komplexität menschlicher Astrozyten ist im Primärgewebe nach wie vor schlecht definiert und erfordert bessere Werkzeuge für ihre Isolierung und Charakterisierung bei hoher Auflösung, sowohl im Gesundheits- als auch im Krankheitsbereich. Die Trennung intakter menschlicher Neuronen und Gliazellen von ihrer Nische hat sich aufgrund des begrenzten Zugangs zu frischen Hirngewebeproben, der stark miteinander verbundenen Natur von Glia- und neuronalen Prozessen und der unvermeidlichen zellulären Aktivierung während der Verarbeitung als schwierig erwiesen, die alle die molekulare Charakterisierung dieser Zelltypen ex vivoeinschränken 1 . Die fluoreszenzaktivierte Kernsortierung (FANS) hat sich als Alternative zur Lebendzellsortierung herauskristallisiert und ermöglicht die Dissoziation und Immuntagsierung von Kernpopulationen aus gefrorenem Gewebe. In den letzten zehn Jahren wurde FANS häufig zur Isolierung und molekularen Charakterisierung menschlicher neuronaler (NeuN +) Kernpopulationen in einer Vielzahl von Gehirnproben und anatomischen Regioneneingesetzt 1,2,3,4.

Ähnliche Methoden zur Isolierung spezifischer Gliakern-Subpopulationen aus dem menschlichen Kortex waren jedoch begrenzt, was zu einem relativen Mangel an Raffinesse beim Verständnis der Astrozytenkomplexität sowohl in normalem als auch in erkranktem Gewebe führte. Zu diesem Zweck wurde ein zuvor veröffentlichtes Protokoll zur Isolierung menschlicher neuronaler Populationen mit FANS4 angepasst und eine Methode zur Anreicherung für Astrozyten (und für oligodendrogliale Vorläufer) unter Verwendung einer Dreifach-Antikörper-Kombination validiert, wobei Astrozyten sowohl unter ruhenden als auch unter reaktiven Bedingungen erfasstwurden 5. Um speziell für Astrozyten in der NeuN-Fraktion anzureichern, wurden Antikörper gegen einen von zwei Transkriptionsfaktoren verwendet, von denen bekannt ist, dass sie über Astrozytenpopulationen hinweg unterschiedlich exprimiert werden, PAX6 oder SRY-Box-Transkriptionsfaktor 9 (SOX9) 6,7. PAX6 wird während der frühen fetalen Entwicklung in radialen gliaähnlichen Vorläufern in Keimzonen hoch exprimiert und trägt sowohl zur Neurogenese und Gliogenese 8,9,10,11 als auch zur retinalen neuronalen Spezifikation 12 bei. Beim Erwachsenen ist PAX6 in ruhenden menschlichen Astrozyten6 differentiell überexprimiert und zeigt eine Proteinkoexpression mit glialfibrillärem saurem Protein (GFAP) in humanen Epilepsiegewebeastrozyten13.

Dieses Protokoll beschreibt die gleichzeitige Isolierung neokortikaler neuronaler und astrozytenangereicherter Kernpopulationen durch FANS. Frisches (nicht fixiertes) schockgefrorenes (d.h. frisch gefrorenes) postmortales Gewebe, das aus dem erwachsenen Kortex entnommen wird, wird zunächst mechanisch und chemisch dissoziiert. Nach der Lyse und Ultrazentrifugation in einem Saccharosegradienten werden die zytoplasmatischen und extrazellulären Komponenten verworfen, während die Kerne erhalten bleiben. Die Kerne werden dann mit fluoreszierend konjugierten Kernantikörpern markiert, die den gewünschten Ziellinien entsprechen, und mit FANS sortiert. Nach diesem Ansatz wird die Anreicherung von Astrozyten in den gesammelten PAX6+NeuN-Populationen demonstriert, validiert sowohl durch ein gezieltes qPCR-Panel als auch durch nachgeschaltete nukleare RNA-Sequenzierung.

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Protokoll

HINWEIS: Das Programm zum Schutz menschlicher Probanden an der Icahn School of Medicine at Mount Sinai (ISMMS) und sein Institutional Review Board (IRB) gewährleisten die ethische Durchführung der Forschung und die Einhaltung von Bundes-, Landes- und institutionellen Vorschriften. In dieser Studie wurden alle verwendeten Post-mortem-Proben de-identifiziert, mit entsprechender Zustimmung durch das Biorepository erhalten und von der Bezeichnung "Humanforschung" durch das IRB des ISMMS (HS#14-01007) ausgenommen.

1. Puffervorbereitung

HINWEIS: Wenn Sie eine nachgeschaltete RNA-Sequenzierung durchführen, behandeln Sie alle Arbeitsbereiche und Werkzeuge gründlich mit RNase Decontamination Solution, um den mRNA-Abbau zu verhindern.

  1. Bereiten Sie den Lysepuffer vor.
    1. In destilliertem H2 O bis zu50 ml wird Folgendes gelöst: 5,47 g Saccharose (0,32 M endg.), 250 μL 1 MCaCl2 (5 mM endg.), 150 μL 1 M mg(CH3COO)2 (3 mM endg.), 10 μL 500 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (0,1 mM endg.), 500 μL 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM endg.), 50 μL Triton X-100 (0,1% endgültig) und 17 μL 3 M Dithiothreitol (DTT, 1 mM final, frisch hinzufügen) (siehe Materialtabelle).
  2. Saccharosepuffer vorbereiten
    1. Folgendes wird in destilliertemH2Obis zu 50 ml gelöst: 30,78 g Saccharose (1,8 M endg.), 150 μL 1 M Mg(CH 3 COO)2 (3mM endg.), 500 μL 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM endg.), 17 μL 3 M DTT (1 mM final, frisch hinzufügen).

2. Gefrorene Gewebedissoziation in Einzelkernsuspension

  1. Fügen Sie 4 ml eiskalten Lysepuffer zu einem 7 ml Glasgewebedouncer (Grinder) hinzu und halten Sie es auf Eis. Sezieren Sie etwa 200-400 mg frisch gefrorenen menschlichen Erwachsenenkortex, douncen Sie ungefähr 50x und übertragen Sie das Gewebehomogenat auf ein 12 ml Ultrazentrifugen-Polypropylenröhrchen.
  2. Mit einer 5-ml-Pipette 6,5 ml eiskalten Saccharosepuffer auf den Boden des Ultrazentrifugenröhrchens geben, wobei darauf zu achten ist, dass die Schicht zwischen Saccharose und dem Gewebehomogenat nicht gestört wird.
    HINWEIS: Wenn Sie zusätzliche Proben verarbeiten, balancieren Sie die Röhrchen sorgfältig nach Gewicht aus, indem Sie der leichteren Probe zusätzlichen Lysepuffer hinzufügen. Ein präzises Auswuchten der Ultrazentrifugenröhrchen ist unerlässlich, um Schäden am Rotor zu vermeiden und die Rotation mit der richtigen Geschwindigkeit sicherzustellen.

3. Ultrazentrifugation

  1. Ultrazentrifugieren Sie das Lysat bei 24.400 U/min (101.814 × g) für 1 h bei 4 °C. Den Überstand und die Ablagerungen vorsichtig abspritzen, ohne das Pellet zu stören.
    HINWEIS: Ein Pellet ist möglicherweise nicht sichtbar, wenn es mit weniger als 200 mg Gewebe beginnt.
  2. 600 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (Ca 2+, Mg2+ frei) in das Kernpellet geben und vor dem Resuspendieren 10 min auf Eis inkubieren.
  3. 50 Mal auf und ab pipettieren, um das Kernpellet auf Eis zu resuspendieren.
  4. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die intakten Kerne unter einem Mikroskop sichtbar zu machen und sicherzustellen, dass die Konzentration der Resuspension über 105 Kerne / ml liegt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren (kombinieren Sie 10 μL der resuspendierten Kerne mit 10 μL Trypanblau).

4. Antikörper-Inkubation

  1. Um die Probe für FANS zu immuntaggen, fügen Sie 500 μL des resuspendierten Probenpellets, 490 μL 1x PBS (Ca 2+, Mg2+ frei), 10 μL 10% BSA (0,1% endgültig), 1 μL Maus-Anti-NeuN-Antikörper, konjugiert an AF555 (NeuN-AF555, 1:1000 Endkonzentration), und 1 μL Maus-Anti-PAX6-Antikörper, konjugiert an Allophycocyanin (PAX6-APC, 1:1000 Endkonzentration), hinzu.
    HINWEIS: Alternative Antikörper, die mit anderen Fluorophoren konjugiert sind, können hinzugefügt werden (siehe Diskussion). Hier wurde Maus-Anti-OLIG2 konjugiert mit AF488 (1:1000 Konzentration) mit günstigen Ergebnissen verwendet.
  2. Führen Sie 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-only und einfarbige Kontrollen durch, um Gating-Parameter einzurichten, wobei bei Bedarf eine kleine Menge der Probe verwendet wird.
    1. Um eine AF555-Einzelfarbkontrolle durchzuführen, fügen Sie 20 μL des resuspendierten Probenpellets, 970 μL 1x PBS (Ca 2+, Mg 2+ frei), 10 μL 10% BSA (0,1% endgültig) und 1 μL NeuN-AF555 Antikörper (1:1000 Konzentration) hinzu.
    2. Um eine APC-Einzelfarbkontrolle durchzuführen, fügen Sie 20 μL des resuspendierten Probenpellets, 970 μL 1X PBS (Ca 2+, Mg2+ frei), 10 μL 10% BSA (0,1% endgültig) und 1 μL PAX6-APC-Antikörper (1:1000 Konzentration) hinzu.
    3. Um eine reine DAPI-Kontrolle durchzuführen, fügen Sie 20 μL des resuspendierten Probenpellets, 970 μL 1X PBS (Ca 2+, Mg2+ frei) und 10 μL 10% BSA (0,1% endgültig) hinzu (DAPI wird später hinzugefügt, siehe 4.4).
      HINWEIS: Wenn mehr als zwei Antikörper verwendet werden, wird zusätzlich zu den einfarbigen Kontrollen eine Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrolle (FMO) empfohlen.
  3. Die Proben und die Kontrollen werden mit Rotation im Dunkeln für 1 h bei 4 °C inkubiert.
  4. Fügen Sie allen Stichproben und Kontrollen DAPI bei 1:1000 hinzu, und fahren Sie mit der Sortierung fort.

5. Fluoreszenzaktivierte Kernsortierung (FANS)

HINWEIS: Es wird empfohlen, eine institutionelle Durchflusszytometrieeinrichtung mit Unterstützung von geschultem Personal zu verwenden, es sei denn, Sie beherrschen bereits die Durchflusszytometrie / Sortiertechniken.

  1. Tor wie unten gezeigt.
    1. Zuerst und für jede Probe, Gate durch Vorwärtsstreuung (FSC-A) vs. Seitenstreuung (SSC-A), um Partikel im geeigneten Größenbereich für Kerne einzuschließen, wodurch rote Blutkörperchen und Ablagerungen ausgeschlossen werden (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Eine sehr saubere Kernaufbereitung kann zwischen einem kleineren Trümmerhaufen und einem Kerncluster unterscheiden.
    2. Als nächstes und für jede Stichprobe Gate durch FSC-A vs. FSC-W (oder FSC-A vs. FSC-H) und SSC-A vs. SSC-W (oder SSC-A vs. SSC-H), um nur Singulett-Kerne einzuschließen (Abbildung 1B).
    3. Als nächstes und für jede Stichprobe, Gate durch DAPI, um intakte Kern-Singlets (DAPI-hohe Gated Population) einzubeziehen, ohne Trümmer (DAPI-niedrig, links von der Gated Population) und Dubletten (rechts von Gated Population) (Abbildung 1C).
    4. Legen Sie weitere Gatings basierend auf Fluoreszenzkontrollen fest, die visuell als unterschiedliche Cluster auf FACS-Plots bestimmt werden.
      1. Führen Sie eine reine DAPI-Kontrolle durch, um die Hintergrundfärbung von Populationen in Abwesenheit von Antikörpern zu bestimmen (Abbildung 1D und Abbildung 2A).
      2. Führen Sie die Nur-NeuN-AF555-Steuerung aus, um den Grenzwert für die NeuN+-Färbung im Kanal für AF555 zu bestimmen (Abbildung 2B).
      3. Führen Sie die Nur-PAX6-APC-Steuerung aus, um den Grenzwert für die PAX6+-Färbung im APC-Kanal zu bestimmen (Abbildung 2C).
      4. Führen Sie zusätzliche einfarbige Kontrollen aus, wenn Sie mehr Antikörper verwenden (Abbildung 2D, E).
        HINWEIS: Bei Verwendung von mehr als zwei Antikörpern wird eine FMO-Kontrolle empfohlen, um Verschiebungen in den Populationen zu visualisieren.
    5. Sobald alle Steuerelemente ausgeführt wurden, ziehen Sie die Tore für NeuN+- und PAX6+-Sammlungen über die festgelegten Schwellenwerte.
      1. Gate die NeuN+-Population, um Neuronen zu sammeln (Abbildung 1E und Abbildung 2F).
      2. Gate die PAX6+-Population aus der NeuN-Population, um Astrozyten zu sammeln (Abbildung 1E, F und Abbildung 2F).
      3. Gate und collect zusätzliche Gliapopulationen (wie Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, wie hier durch OLIG2+ gezeigt) aus der NeuN-PAX6-Population (Abbildung 1F).
        HINWEIS: Falls die Bestimmung geeigneter Gating-Cutoffs mit der Durchflusszytometrie-Software aufgrund undeutlicher Populationen schwierig ist, kann es hilfreich sein, die Anzahl der zu visualisierenden Ereignisse zu ändern (entweder die Anzahl der Ereignisse auf dem FANS-Diagramm zu erhöhen oder zu reduzieren).
  2. Sammeln Sie Proben entsprechend auf der Grundlage der beabsichtigten nachgelagerten Analyse.

6. Sammlung von FANS-Populationen für nachgelagerte molekulare Analysen

  1. Für die Bulk-RNA-Sequenzierung werden 50.000-500.000 Kerne in PBS gesammelt (siehe auch Abschnitt 7.1).
    1. 2 ml Saccharoselösung, 50 μL 1 MCaCl2 und 30 μL 1 M Mg(CH3COO)2 zugeben und mit PBS bis zu 10 ml füllen.
    2. Invertieren und 15 min auf Eis inkubieren, dann bei 900 × g für 10-15 min bei 4 °C zentrifugieren.
    3. Den Überstand abspritzen, in 1 ml RNA-extrahierendem Reagenz resuspendieren, wirbeln, auf Trockeneis gefrieren und bei -80 °C lagern.
    4. Alternativ können Sie die Proben direkt in 200 μL des RNA-extrahierenden Reagenzes entnehmen. Fügen Sie das RNA-extrahierende Reagenz nach dem Sortieren bis zu 1 ml hinzu, wobei ein Verhältnis von 1: 1 des Reagenzes zur sortierten Probe beibehalten wird. Wirbeln, auf Trockeneis gefrieren und bei -80 °C lagern.
  2. Für den Bulk-Assay auf Transposase-zugängliches Chromatin mittels Sequenzierung (ATAC-seq) werden 50.000-75.000 Kerne in PBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt, das mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) beschichtet ist. Kerne auf Trockeneis/-80 °C einfrieren oder sofort zur ATAC-Aufbereitung verwenden.
  3. Für sn RNA-seq oder ATAC-seq werden Kerne in 0,04% BSA in PBS gesammelt (siehe auch Abschnitt 7.2).

7. Tipps zur Vorbereitung der Bibliothek

  1. Vorbereitung der Bulk-Nu-RNA-Sequenzierungsbibliothek
    1. Nach dem Sammeln in RNA-Extraktionsreagenz führen Sie eine Standard-Phenol/Chloroform-RNA-Extraktion durch, indem Sie Phenol/Chloroform hinzufügen und RNA aus der oberen wässrigen Schicht mit Ethanol ausfällen, gefolgt von einem DNase-Aufschluss auf Tube (15 min).
    2. Führen Sie eine RNA-Reinigung durch und konzentrieren Sie sich in einem Endvolumen von 15 μL Wasser.
      HINWEIS: Mit dieser Methode beträgt die repräsentative Erholung aus 300 mg adulter Kortexprobe ~ 300.000 NeuN + -Kerne (15-20 ng / μL Gesamt-RNA nach Aufreinigung und Konzentration) und ~ 250.000 PAX6 + -Kerne (10-12 ng / μL Gesamt-RNA nach Aufreinigung und Konzentration). Diese repräsentative Ausbeute kann je nach Probenqualität, Gating-Stringenz und RNA-Rückgewinnung stark variieren.
    3. Durchführung einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) vor der Sequenzierung, um die Anreicherung von Astrozyten basierend auf einer hohen differentiellen Expression von kanonischen Astrozytenmarkern (GFAP, SOX9), 10-Formyltetrahydrofolat-Dehydrogenase (ALDH1L1)) und der Erschöpfung neuronaler und anderer Zelllinienmarker zu bestätigen (Abbildung 1G).
      HINWEIS: Die Erfassung der doppelnegativen Population (NeuN-PAX6-) ermöglicht eine genauere, mehrstufige qPCR-Qualitätskontrollanalyse für die relative Anreicherung von Astrozyten (Abbildung 2H).
    4. Generieren Sie RNA-seq-Bibliotheken mit einem Kit, das für niedrige RNA-Integritätszahlwerte empfohlen wird, wie von postmortalen Proben erwartet.
  2. Vorbereitung der Einzelkern-Sequenzierungsbibliothek
    1. Führen Sie eine SN-Sequenzierung über einen institutionellen Sequenzierungskern durch.
    2. Für die nanofluidikbasierte Verarbeitung und Sequenzierung verwenden Sie die empfohlene Konzentration von 1 × 10 6 Zellen/ml in mindestens 60 μL 1x PBS + 0,04% BSA für die Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) und 3 × 106 Zellen/ml in mindestens 20 μL 1x PBS + 0,04% BSA für Single-Nucleus Assay für Transposase-Accessible Chromatin mittels Sequenzierung (snATAC-seq).

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Ergebnisse

Die Kerne wurden aus frischem (nicht fixiertem) schockgefrorenem temporalem Neokortexgewebe mit einer postmortalen Entnahmezeit von 12 h entnommen. Nach der Dissoziation des Gewebes in die Kernsuspension wurden die Proben mit Antikörpern gegen NeuN, PAX6 und OLIG2 inkubiert und nach dem in Abbildung 1 und Abbildung 2 gezeigten Gating sortiert. Kerne wurden aus NeuN+, PAX6+NeuN- und OLIG2+NeuN- sortierten Populationen gesammelt (Abbildung 1E<...

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Diskussion

Das experimentelle Design nach dem skizzierten Protokoll sollte unter Berücksichtigung mehrerer biologischer und technischer Faktoren abgeschlossen werden. Beginnende Gewebeproben sind frisch gefroren, ohne fixiert worden zu sein, und haben vorzugsweise ein kurzes postmortales Entnahmeintervall, um die Kernerholung zu maximieren. Erfahrungsgemäß ermöglicht ein PMI von bis zu 24 h eine adäquate Kernerholung; Ein PMI von 12 h oder weniger ist jedoch vorzuziehen, um die Erholung intakter Kerne zu optimieren. Zusätzliche Fak...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken den Mitgliedern der Pathologie und Neurochirurgie an der Icahn School of Medicine am Mount Sinai für ihre Hilfe bei der Beschaffung von de-identifiziertem Hirngewebe und der Durchflusszytometrie CORE von ISMMS für die fachkundige Beratung. Die Studie wurde teilweise von NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (zu N.M.T.) und R61DA048207 (zu S.A.) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10x PBS pH 7,2Invitrogen70013073
ANTI-NEUN ANTIKÖRPER KLON A60MilliporeMAB377A5MIMaus Anti-NeuN, konjugiert an eine fluoreszierende Verbindung AF555 (Anregung, 553 nm; Emission, 568 nm)
ANTI-OLIG2 ANTIKÖRPER Klon 211MilliporeMABN50A4MIMaus-Anti-OLIG2, konjugiert an eine fluoreszierende Verbindung AF488 (Anregung, 499 nm; Emission, 520 nm)
Rind SerumalbuminFisherBP9704-100
Bright-Line-ZählkammerHausser Scientific3110V
Calciumchlorid wasserfreiFisherC614-3
Zellsiebe, 40 & Mikro; MSP Scienceware136800040
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)InvitrogenD1306
DL-DithiothreitolSigma43815-1G
DNA Library KitIllumina, NexteraFC-121– 1030
DNAse IWorthingtonLS002139
Dounce Tissue GrinderWHEATON357542
FACS SorterBD BiosciencesBD FACSAria III
Magnesiumacetat TetrahydratFisherM13-500
PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTSNovusNBP234705J
RNA Clean & KonzentratorZymo ResearchR1013
RNaseZap RNase DekontaminationslösungInvitrogenAM9780
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input MammalianClontechLaboratories 635005 Fragmentierungszeit von 2,5 Minuten, wie empfohlen für niedrige RIN-RNA-Werte.
Saccharose, kristallzertifiziert, ACS, 500 mgFisherS5500
SW 41 Ti SchwingschaufelrotorBeckman-Schar331362
Tris-HCl, 1M Lösung, pH 8,0, molekularbiologische Qualität, hochreinesThermo ScientificJ22638AE
TritonX-100FisherBP151-500nichtionisches Tensid in Lysepuffer
TRIzol LS ReagenzInvitrogen10296028
TRIzol ReagenzInvitrogen15596026Reagenz zur Isolierung von RNA
Trypanblau Lösung, 0,4%Gibco15250061
UltrazentrifugeBeckman Coulter Optima XE-100A94516
Ultrazentrifugenröhrchen PP 9/16 X 3-1/2Beckman Coulter331372
UltraPure Destilliertes Wasser ( RNAse-, DNAse-frei)Invitrogen10977023als destilliertes Wasser bezeichnet
Ultrapure EDTALife Technologies15576-028

Referenzen

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