Isolierung von erwachsenen menschlichen Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenen Kortex mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung

Zusammenfassung

Wir haben eine Methode entwickelt, die menschliche Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenem Gewebe anreichert und isoliert, um sie in nachgelagerten molekularen Analysen zu verwenden.

Zusammenfassung

Die Komplexität menschlicher Astrozyten ist im primären menschlichen Gewebe nach wie vor schlecht definiert und erfordert bessere Werkzeuge für ihre Isolierung und molekulare Charakterisierung. Die fluoreszenzaktivierte Nuclei Sorting (FANS) kann verwendet werden, um menschliche neuronale Kernpopulationen (NeuN +) erfolgreich aus gefrorenem Archivgewebe zu isolieren und zu untersuchen und so Probleme im Zusammenhang mit der Handhabung von frischem Gewebe zu vermeiden. Es fehlen jedoch Bemühungen, Astroglia in ähnlicher Weise vom nicht-neuronalen (NeuN-) Element zu isolieren. Eine kürzlich entwickelte und validierte Immunotagging-Strategie verwendet drei Transkriptionsfaktor-Antikörper, um gleichzeitig angereicherte neuronale (NeuN +), Astrozyten- (gepaart Boxprotein 6 (PAX6) + NeuN-) und Oligodendrozyten-Vorläufer- (OLIG2 + NeuN-) Kernpopulationen aus nicht erkranktem, frischem (nicht fixiertem) postmortalem humanem temporalem Neokortexgewebe zu isolieren.

Diese Technik erwies sich als nützlich für die Charakterisierung von zelltypspezifischen Transkriptomveränderungen im primären pathologischen Epilepsie-Neokortex. Transkriptomische Analysen bestätigten, dass PAX6+NeuN-sortierte Populationen robust für Pan-Astrozytenmarker angereichert sind und Astrozyten sowohl unter ruhenden als auch unter reaktiven Bedingungen einfangen. Dieses Papier beschreibt die FANS-Methodik zur Isolierung von Astrozyten-angereicherten Kernpopulationen aus frisch gefrorenen menschlichen Kortex, einschließlich der Gewebedissoziation in Einzelkernsussuspension (sn); Immuntagging von Kernen mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern gegen NeuN und PAX6; FANS Gating-Strategien und Qualitätskontrollmetriken zur Optimierung der Sensitivität und Spezifität während der Sortierung und zur Bestätigung der Astrozytenanreicherung; und empfohlene Beschaffung für die nachgelagerte Transkriptom- und Chromatin-Zugänglichkeitssequenzierung in Massen- oder SN-Auflösung. Dieses Protokoll gilt für nicht-nekrotische, frisch gefrorene, menschliche kortikale Proben mit verschiedenen Pathologien und empfohlener postmortaler Gewebeentnahme innerhalb von 24 h.

Einleitung

Die molekulare Komplexität menschlicher Astrozyten ist im Primärgewebe nach wie vor schlecht definiert und erfordert bessere Werkzeuge für ihre Isolierung und Charakterisierung bei hoher Auflösung, sowohl im Gesundheits- als auch im Krankheitsbereich. Die Trennung intakter menschlicher Neuronen und Gliazellen von ihrer Nische hat sich aufgrund des begrenzten Zugangs zu frischen Hirngewebeproben, der stark miteinander verbundenen Natur von Glia- und neuronalen Prozessen und der unvermeidlichen zellulären Aktivierung während der Verarbeitung als schwierig erwiesen, die alle die molekulare Charakterisierung dieser Zelltypen ex vivo^{einschränken ....}

Protokoll

HINWEIS: Das Programm zum Schutz menschlicher Probanden an der Icahn School of Medicine at Mount Sinai (ISMMS) und sein Institutional Review Board (IRB) gewährleisten die ethische Durchführung der Forschung und die Einhaltung von Bundes-, Landes- und institutionellen Vorschriften. In dieser Studie wurden alle verwendeten Post-mortem-Proben de-identifiziert, mit entsprechender Zustimmung durch das Biorepository erhalten und von der Bezeichnung "Humanforschung" durch das IRB des ISMMS (HS#14-01007) ausgenommen.

1. Puffervorbereitung

HINWEIS: Wenn Sie eine nachgeschaltete RNA-Sequenzierung d....

Ergebnisse

Die Kerne wurden aus frischem (nicht fixiertem) schockgefrorenem temporalem Neokortexgewebe mit einer postmortalen Entnahmezeit von 12 h entnommen. Nach der Dissoziation des Gewebes in die Kernsuspension wurden die Proben mit Antikörpern gegen NeuN, PAX6 und OLIG2 inkubiert und nach dem in Abbildung 1 und Abbildung 2 gezeigten Gating sortiert. Kerne wurden aus NeuN+, PAX6+NeuN- und OLIG2+NeuN- sortierten Populationen gesammelt (Abbildung 1E<.......

Diskussion

Das experimentelle Design nach dem skizzierten Protokoll sollte unter Berücksichtigung mehrerer biologischer und technischer Faktoren abgeschlossen werden. Beginnende Gewebeproben sind frisch gefroren, ohne fixiert worden zu sein, und haben vorzugsweise ein kurzes postmortales Entnahmeintervall, um die Kernerholung zu maximieren. Erfahrungsgemäß ermöglicht ein PMI von bis zu 24 h eine adäquate Kernerholung; Ein PMI von 12 h oder weniger ist jedoch vorzuziehen, um die Erholung intakter Kerne zu optimieren. Zusätzliche Fak.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10x PBS pH 7,2	Invitrogen	70013073
ANTI-NEUN ANTIKÖRPER KLON A60	Millipore	MAB377A5MI	Maus Anti-NeuN, konjugiert an eine fluoreszierende Verbindung AF555 (Anregung, 553 nm; Emission, 568 nm)
ANTI-OLIG2 ANTIKÖRPER Klon 211	Millipore	MABN50A4MI	Maus-Anti-OLIG2, konjugiert an eine fluoreszierende Verbindung AF488 (Anregung, 499 nm; Emission, 520 nm)
Rind Serumalbumin	Fisher	BP9704-100
Bright-Line-Zählkammer	Hausser Scientific	3110V
Calciumchlorid wasserfrei	Fisher	C614-3
Zellsiebe, 40 & Mikro; M	SP Scienceware	136800040
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)	Invitrogen	D1306
DL-Dithiothreitol	Sigma	43815-1G
DNA Library Kit	Illumina, Nextera	FC-121– 1030
DNAse I	Worthington	LS002139
Dounce Tissue Grinder	WHEATON	357542
FACS Sorter	BD Biosciences		BD FACSAria III
Magnesiumacetat Tetrahydrat	Fisher	M13-500
PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS	Novus	NBP234705J
RNA Clean & Konzentrator	Zymo Research	R1013
RNaseZap RNase Dekontaminationslösung	Invitrogen	AM9780
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian	Clontech		Laboratories 635005 Fragmentierungszeit von 2,5 Minuten, wie empfohlen für niedrige RIN-RNA-Werte.
Saccharose, kristallzertifiziert, ACS, 500 mg	Fisher	S5500
SW 41 Ti Schwingschaufelrotor	Beckman-Schar	331362
Tris-HCl, 1M Lösung, pH 8,0, molekularbiologische Qualität, hochreines	Thermo Scientific	J22638AE
TritonX-100	Fisher	BP151-500	nichtionisches Tensid in Lysepuffer
TRIzol LS Reagenz	Invitrogen	10296028
TRIzol Reagenz	Invitrogen	15596026	Reagenz zur Isolierung von RNA
Trypanblau Lösung, 0,4%	Gibco	15250061
Ultrazentrifuge	Beckman Coulter Optima XE-100	A94516
Ultrazentrifugenröhrchen PP 9/16 X 3-1/2	Beckman Coulter	331372
UltraPure Destilliertes Wasser ( RNAse-, DNAse-frei)	Invitrogen	10977023	als destilliertes Wasser bezeichnet
Ultrapure EDTA	Life Technologies	15576-028