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Biology

मात्रात्मक तरीके कोशिकाओं में प्रोटीन आर्जिनिन मिथाइलट्रांसफेरेज 1-9 गतिविधि का अध्ययन करने के लिए

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62418
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Structural Genomics Consortium, University of Toronto, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto

Summary

ये प्रोटोकॉल कोशिकाओं में प्रोटीन आर्जिनाइन मिथाइलट्रांसफेरेज (पीआरएमटी) परिवार के व्यक्तिगत सदस्यों की एंजाइमेटिक गतिविधि का आकलन करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति प्रदान करते हैं। अंतर्जात और बहिर्जात बायोमार्कर का उपयोग करके पीआरएमटी गतिविधि का आकलन करने, एंटीबॉडी को पहचानने वाले मिथाइल-आर्जिनिन और अवरोधक उपकरण यौगिकों का वर्णन किया गया है।

Abstract

प्रोटीन मिथाइलट्रांसफेरेस (पीआरएमटीएस) सब्सट्रेट प्रोटीन के आर्जिनिन अवशेषों के लिए एक मिथाइल समूह के हस्तांतरण को उत्प्रेरित करता है। पीआरएमटी परिवार में नौ सदस्य होते हैं जो एकमेथिलेट या सममित/विषम रूप से डिमेथिलेट आर्जिनिन अवशेषों को एकामेथिलेट कर सकते हैं । विभिन्न प्रोटीन के विभिन्न प्रकार के आर्जिनिन मिथाइलेशन को पहचानने वाले कई एंटीबॉडी उपलब्ध हैं; इस प्रकार, पीआरएमटी गतिविधि बायोमार्कर परख के विकास के लिए उपकरण प्रदान करना। पीआरएमटी एंटीबॉडी-आधारित परख ओवरलैपिंग सब्सट्रेट्स और आकृति-आधारित एंटीबॉडी विशिष्टताओं के कारण चुनौतीपूर्ण हैं। इन मुद्दों और प्रयोगात्मक सेटअप अलग पीआरएमटी द्वारा योगदान arginine मिथाइलेशन की जांच करने के लिए चर्चा कर रहे हैं । प्रतिनिधि सब्सट्रेट्स के सावधानीपूर्वक चयन के माध्यम से जो नौ पीआरएमटी में से आठ के लिए बायोमार्कर हैं, पीआरएमटी गतिविधि परख का एक पैनल डिजाइन किया गया था। यहां, कोशिकाओं में पीआरएमटी परिवार के व्यक्तिगत सदस्यों की एंजाइमेटिक गतिविधि को मापने वाले सेलुलर परख के लिए प्रोटोकॉल की सूचना दी जाती है। वर्णित तरीकों का लाभ सेल संस्कृति और फ्लोरोसेंट पश्चिमी दाग क्षमताओं के साथ किसी भी प्रयोगशाला में उनका सीधा प्रदर्शन है। सब्सट्रेट विशिष्टता और चुनी गई एंटीबॉडी विश्वसनीयता को नॉकडाउन और अतिव्यक्तता दृष्टिकोणों के साथ पूरी तरह से मान्य किया गया था। परख बायोमार्कर और एंटीबॉडी के विस्तृत दिशानिर्देशों के अलावा, पीआरएमटीएस के लिए अवरोधक उपकरण यौगिक संग्रह के उपयोग के बारे में जानकारी भी प्रदान की गई है।

Introduction

आर्जिनिन मिथाइलेशन एक महत्वपूर्ण पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है जो प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन को नियंत्रित करता है, इस प्रकार विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे प्री-एमआरएनए स्प्लिसिंग, डीएनए क्षति, ट्रांसक्रिप्शन रिस्पांस, और विकास कारक-मध्यस्थता ट्रांसडक्शन1,2में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। आर्जिनिन को प्रोटीन आर्जिनिन मिथाइलट्रांसफेरेस (पीआरएमटीएस) द्वारा मेथिलेटेड किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप मोनोमिथाइल आर्जिनिन (आरएमई 1), विषम डाइमेथाइलरजिनिन (आरएमई2ए), या सममित डिमेथाइलरिन (आरम2एस)3। मिथाइलेशन प्रकार के आधार पर, पीआरएमटी को तीन समूहों में वर्गीकृत किया जाता है: टाइप I (PRMT1, 2, 3, 4, 6, और 8), जो मोनो-और असममित डाइमेथाइलेशन को उत्प्रेरित करता है; टाइप II (पीआरएमटी5 और पीआरएमटी9), जो मोनो और सममित डाइमिथाइलेशन को उत्प्रेरित करता है; और टाइप III (PRMT7), जो केवल मोनोमेथिलेट आर्जिनिन3कर सकते हैं।

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आर्जिनिन मिथाइलेशन-विशिष्ट एंटीबॉडी की बढ़ती संख्या के कारण, पीआरएमटी गतिविधि को पश्चिमी ब्लॉटिंग का उपयोग करके मापा जा सकता है। फ्लोरोसेंट आधारित पश्चिमी दाग एक अधिक गतिशील रेंज और रैखिकता, उच्च संवेदनशीलता, और मल्टीप्लेक्सिंग4के लिए अनुमति देने के कारण केमिल्यूमिनेसेंट डिटेक्शन पर पसंदीदा तकनीक है। प्रोटीन मिथाइलेशन के स्तर को निर्धारित करने के लिए, कुल प्रोटीन स्तर के लिए मिथाइलेशन सिग्नल को सामान्य बनाने की आवश्यकता होती है। विभिन्न मेजबान प्रजातियों (जैसे, माउस और खरगोश) में उठाए गए कुल और मिथाइलेटेड प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी का चयन करके, विभिन्न फ्लोरोफोरस के साथ लेबल किए गए माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है और दोनों एंटीबॉडी के लिए संकेत एक ही नमूना बैंड में निर्धारित किया जा सकता है। मिथाइल-आर्जिनिन एंटीबॉडी को मोनोमेथिलेटेड, विषम रूप से, या सममित रूप से डिमेथाइलेटेड प्रोटीन की पहचान करने और चित्रित करने के लिए विकसित किया गया था जहां मिथाइल-आर्जिनिन एक विशिष्ट संदर्भ में पाया जाता है। चूंकि उनके सब्सट्रेट्स5के भीतर अधिकांश पीआरएमटी मेथिलेट ग्लाइसिन-और आर्जिनिन-रिच रूपांकनों के बाद, क्रमशः एकामिथाइल या असममित, सममित डिमेथिल-आर्जिनिन-ग्लाइसिन दोहराने वाले पेप्टाइड्स के लिए कई एंटीबॉडी उठाए गए थे। अन्य मिथाइल-आर्जिनिन एंटीबॉडी एक पेप्टाइड पुस्तकालय के खिलाफ उत्पन्न हुए थे जिसमें सममित, सममित डाइमिथाइल और मोनोमिथाइल आर्जिनिन एक दोहराने के संदर्भ में थे जिससे इन विशेष संदर्भों में मिथाइल-आर्जिनिन का पता लगाने में मदद मिली6। एंटीबॉडी की बढ़ती संख्या भी है जो एक प्रोटीन पर विशिष्ट आर्जिनिन मार्क को पहचानती है जो मिथाइलेशन जैसे हिस्टोन एच4आर3एमईए या BAF155-R1064me2a का चयनात्मक पता लगाने में सक्षम है।

कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीआरएमटी अवरोधक हैं, जिन्हें पीआरएमटी सेलुलर परख के लिए उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, उन सभी को चयनशीलता और ऑफ-टारगेट प्रभावों के लिए अच्छी तरह से विशेषता नहीं है और कुछ का उपयोग सावधानी के साथ किया जाना चाहिए। संरचनात्मक जीनोमिक कंसोर्टियम, अकादमिक प्रयोगशालाओं और फार्मा भागीदारों के सहयोग से, अच्छी तरह से विशेषता शक्तिशाली, चयनात्मक, और सेल पारगम्य पीआरएमटी अवरोधकों (रासायनिक जांच) है कि वैज्ञानिक समुदाय द्वारा कोई प्रतिबंध के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित किया है । इन अवरोधकों के बारे में जानकारी https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics और https://www.chemicalprobes.org/ पर पाया जा सकता है। रासायनिक जांच इन विट्रो आईसी50 या केडी < 100 एनएम के साथ छोटे अणु अवरोधक होते हैं, एक ही परिवार में प्रोटीन पर 30 गुना अधिक चयनता, और 1 माइक्रोन पर महत्वपूर्ण सेलुलर गतिविधि होती है। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक रासायनिक जांच में एक करीबी रासायनिक एनालॉग होता है जो इच्छित लक्ष्य7,8,9,10,11, 12के खिलाफ निष्क्रिय है।

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य फ्लोरोसेंट पश्चिमी दाग विधि का उपयोग करके व्यक्तिगत पीआरएमटी परिवार के सदस्यों की सेलुलर गतिविधि को मापना है। यहां मान्य परख बायोमार्कर, एंटीबॉडी, और शक्तिशाली सेल-सक्रिय अवरोधकों के साथ-साथ सफल परख कार्यान्वयन के लिए मूल्यवान रणनीतियों के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान की जाती है।

Protocol

1. सेल पुलिया और चढ़ाना

नोट: अनुशंसित मीडिया के साथ संस्कृति कोशिकाएं और माइकोप्लाज्मा संदूषण के लिए नियमित रूप से परीक्षण करें। HEK293T, MCF7, और C2C12 कोशिकाओं को उदाहरण के रूप में चुना गया था क्योंकि इन सेल लाइनों का सफलतापूर्वक पीआरएमटी परख में उपयोग किया गया था।

  1. डीएमईएम में संस्कृति HEK293T, MCF7, और C2C12 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), पेनिसिलिन (100 यू एमएल−1)और स्ट्रेप्टोमामाइसिन (100 माइक्रोग्राम एमएल−1)में 10 सेमी ऊतक-संस्कृति उपचारित (टीसी व्यंजन) के साथ पूरक है।
  2. PRMT8 परख के लिए, परख शुरू होने से पहले 3 दिनों के लिए doxycycline (2 μg/mL) युक्त मीडिया में PRMT1 inucable नॉकडाउन HEK293T कोशिकाओं को विकसित करें ।
  3. कोशिकाओं को प्लेट करने के लिए, प्लेट से मीडिया को हटा दें और त्यागें।
  4. कोशिकाओं को धोने और समाधान को त्यागने के लिए पीबीएस (सीए+2 और एमजी+2 आयनों के बिना) की 10 एमएल जोड़ें।
  5. ट्रिपसिन-ईडीटीए (0.25%) का 1 एमसीएल जोड़ें, कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर समाधान को त्याग दें। जब तक कोशिकाएं गोल न हो जाएं और प्लेट से अलग न हो जाएं। यदि आवश्यक हो तो कोशिकाओं को अलग करने में मदद करने के लिए प्लेट को टैप करें। C2C12 जैसी कठिन-से-ट्रिप्सिनाइज कोशिकाओं के लिए, प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: लंबी अवधि (>10 मिनट) के लिए ट्रिप्सिन समाधान के लिए सेल एक्सपोजर से बचें क्योंकि यह सेल व्यवहार्यता को कम करेगा।
  6. प्लेट में प्रीवार्म्ड मीडिया के 1 एमएल जोड़ें, और धीरे-धीरे कोशिकाओं को तोड़ने के लिए ऊपर और नीचे सेल झुरमुट। कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और मीडिया के 3-5 एमएल जोड़ें।
  7. सेल नंबर मापने के लिए, ट्राइपैन ब्लू के 10 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं के 10 माइक्रोन मिलाएं और 10 माइक्रोल को हीमोसाइटोमीटर में स्थानांतरित करें या किसी अन्य सेल काउंटिंग विधि का उपयोग करें।
  8. कोशिकाओं को अनुशंसित कोशिका घनत्व के लिए पतला करें और 500 माइक्रोन/वेल को 24-वेल टीसी प्लेटों(तालिका 1)में डाल दें। अंतर्जात परख के लिए (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7, और PRMT9), चरण 3.1 के लिए कदम।

2. सेल ट्रांसफैक्शन

  1. बहिर्जात परख के लिए (PRMT3, PRMT6, PRMT8) डीएनए की अनुशंसित राशि (तालिका 2) के साथ HEK293T कोशिकाओं को पार करना। HEK293T कोशिकाओं को पार करना आसान है इसलिए निर्माता के निर्देश का पालन करते हुए किसी भी ट्रांसफेक्शन रीएजेंट का उपयोग किया जा सकता है।

3. यौगिक उपचार

नोट: संस्कृति मीडिया में 0.1% अंतिम डाइमेथाइल सल्फॉक्साइड (डीएमएसओ) एकाग्रता से अधिक न करें। प्रत्येक कुएं में एक ही डीएमएसओ एकाग्रता रखें। चयनात्मक पीआरएमटी अवरोधक (रासायनिक जांच) और उनके बारीकी से संबंधित निष्क्रिय एनालॉग तालिका 3में पाए जा सकते हैं।

  1. अंतर्जात परख (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7, और PRMT9) के लिए, कोशिकाओं से मीडिया को हटा दें और अकेले यौगिक या DMSO (नियंत्रण) के साथ मीडिया के ५०० μL के साथ बदलें ।
    नोट: आर मिथाइलेशन के स्तर में 80% से अधिक की कमी का निरीक्षण करने में आमतौर पर 2 दिन लगते हैं।
  2. बहिर्जात परख (PRMT3, PRMT6, PRMT8) के लिए, ट्रांसफैक्शन के बाद मीडिया 4 घंटे को हटा दें, अकेले यौगिक या डीएमएसओ (नियंत्रण) के साथ मीडिया के 500 माइक्रोन जोड़ें, और 20-24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।

4. सेल lysate तैयारी

  1. सभी मीडिया को कुओं से हटा दें, अवशिष्ट मीडिया को हटाने के लिए पीबीएस के 100 माइक्रोन से धोएं, और लाइसिस बफर के 60 माइक्रोन जोड़ें (20 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8, 150 एमएमएम एनएसीएल, 1 एमएमएम एथिलेंडियामाइन्टेस्ट्रेक्टेटिक एसिड (ईडीटीए), 10 एमएमएम एमजीसीएल2,0.5% ट्राइटन एक्स-100, 12.5 यू एमएल −1 बेंजोनेज, पूर्ण ईडीए-फ्री प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल) प्रत्येक अच्छी तरह से।
    1. आर टी में 1 मिनट से भी कम समय के लिए इनक्यूबेट, कोशिकाओं पर लाइसिस बफर वितरित करने के लिए थाली कमाल । फिर 20% w/v सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) के 3 माइक्रोन को अंतिम 1% एकाग्रता में जोड़ें, और धीरे-धीरे हिलाकर मिलाएं। माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में lysate को स्थानांतरित करें और इसे बर्फ पर रखें।
      नोट: उपयोग से पहले बेंजोनाज़ और प्रोटीन अवरोधक कॉकटेल ताजा जोड़ें। बेंजोनाज़ के अलावा तेजी से हाइड्रोलाइज न्यूक्लिक एसिड जो कोशिका lysate चिपचिपाहट को कम कर देता है।
  2. बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग कर नमूनों की प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें या किसी अन्य विधि का उपयोग करें जो समाधान में 1% एसडीएस को सहन करता है।
    1. लाइसिस बफर में बीएसए के लाइसेट और प्रोटीन मानकों (0, 1, 2, 4, और 8 μg/mL) के 2 μL जोड़ें ९६-अच्छी तरह से स्पष्ट प्लेट के कुओं में ।
    2. 50:1 अनुपात में अभिकर्मक बी के साथ अभिकर्मक ए मिलाएं और प्रति अच्छी तरह से 200 माइक्रोन जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट और अवशोषण पढ़ें।
  3. नमूनों में बराबर होने के लिए लाइसिस बफर के साथ प्रोटीन एकाग्रता को समायोजित करें।
  4. 4x लोडिंग बफर के 20 माइक्रोल को सेल lysate के 60 माइक्रोन में जोड़ें और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी। गर्मी के बाद, lysates -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

5. पश्चिमी दाग विश्लेषण

  1. हिस्टोन प्रोटीन के विश्लेषण के लिए कुल सेल lysate के 5-20 माइक्रोन लोड और अन्य प्रोटीन के लिए 20-100 माइक्रोन एक 4-12% बीआईएस-Tris प्रोटीन जेल में।
  2. एमओपीएस एसडीएस में जेल चलाने वाले बफर (50 एमएम एमओपीएस, 50 एमएम ट्रिस बेस, 0.1% एसडीएस डब्ल्यू/वी, 1 एमएम ईडीए, पीएच 7.7) में लगभग 2 घंटे के लिए 100 वी पर या जब तक डाई फ्रंट जेल के नीचे तक नहीं पहुंचता है।
  3. यदि गीला हस्तांतरण प्रदर्शन करते हैं, तो बर्फ-ठंडे ट्रिस-ग्लाइसिन ट्रांसफर बफर (25 एमएमएम ट्रिस, 192 एमएमएम ग्लाइसिन, 20% v/v मेथनॉल, और 0.05% w/v SDS) में स्थानांतरण सैंडविच को इकट्ठा करें।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्पंज, फिल्टर पेपर, पीवीडीएफ झिल्ली और जेल रखें। विधानसभा से पहले 30 एस के लिए स्थानांतरण बफर में मेथनॉल और समतुल्य जेल में भिगोकर पीवीडीएफ झिल्ली को सक्रिय करें।
      नोट: अनुशंसित पीवीडीएफ पश्चिमी ब्लॉटिंग झिल्ली का उपयोग करें क्योंकि इसमें कम आणविक वजन प्रोटीन के लिए कम ऑटोफ्लोरेसेंस और उपयुक्तता है, जैसे कि हिस्टोर्स(सामग्री की तालिका)।
  4. बर्फ पर 1.5 घंटे के लिए 70 वी पर ट्रिस-ग्लाइसिन ट्रांसफर बफर में जेल से पीवीडीएफ झिल्ली में प्रोटीन स्थानांतरित करें।
  5. ब्लॉकिंग बफर में 30 मिनट के लिए झिल्ली ब्लॉक (फॉस्फेट-बफर खारा, पीबीएस में 5% w/v दूध)। वॉश बफर के साथ कुल्ला (PBST: पीबीएस में ०.१% v/v ट्वीन-20), और गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) समाधान (पीबीएसटी में 5% बीएसए) में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट 4 डिग्री सेल्सियस(टेबल 3)पर रात भर ।
    नोट: लंबे भंडारण के लिए, बीएसए समाधान को फ़िल्टर-स्टरलाइज करें, 0.02% डब्ल्यू/वी सोडियम एजाइड जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  6. पीबीएएसटी के साथ झिल्ली 3 x 5 मिनट धोएं। फिर बकरी-विरोधी खरगोश (IR800) और गधे विरोधी माउस (IR680) एंटीबॉडी के साथ अनुशंसित अवरुद्ध बफर(सामग्री की तालिका, तालिका 3)आरटी में 30 मिनट के लिए और PBST के साथ 3 x 5 मिनट धोने में ।
  7. 800 और 700 एनएम पर फ्लोरोसेंट वेस्टर्न ब्लॉट इमेजर पर सिग्नल पढ़ें। अधिमानतः उस उपकरण का उपयोग करें जो उच्च संवेदनशीलता और गतिशील रेंज, उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ एक ही छवि में स्पष्ट रूप से मजबूत और बेहोश बैंड की अनुमति देता है, एक चेतावनी जब एक छवि संतृप्ति तक पहुंच जाता है और साथ ही एक ही नमूना बैंड में दो फ्लोरोसेंट रंगों का मल्टीप्लेक्सिंग होता है।
  8. फ्लोरोसेंट वेस्टर्न इमेजिंग के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए बैंड तीव्रता निर्धारित करें।

Representative Results

व्यक्तिगत पीआरएमटी के सेलुलर परख के लिए पश्चिमी दाग परिणामों के उदाहरण नीचे प्रस्तुत किए गए हैं। परखें विवरण तालिका 4में भी संक्षेप में प्रस्तुत किए गए हैं ।

PRMT1 परख
PRMT1 कोशिकाओं में हिस्टोन 4 आर्जिनिन 3 असममित डाइमिथाइलेशन (H4R3me2a) कोशिकाओं में मुख्य योगदानकर्ता है13। PRMT1 गतिविधि के नुकसान पर, वैश्विक Rme1 और Rme2s स्तर काफी13वृद्धि हुई है । जैसा कि चित्रा 1A और 1Bमें दिखाया गया है, Rme1, Rme2a, Rme2s, साथ ही H4R3me2a में वैश्विक परिवर्तनों की निगरानी के लिए कई एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है। वैश्विक Rme2a और H4R3me2a स्तरों में एक महत्वपूर्ण कमी और Rme1 और Rme2s में वृद्धि PRMT1 नॉकडाउन(चित्रा 1A,बी)के 3 दिनों के बाद देखा जा सकता है । सेल लाइनें बेसल H4R3me2a सिग्नल में भिन्न होती हैं, इसलिए, पीआरएमटी 1 गतिविधि के नुकसान की निगरानी की सुविधा के लिए, उच्च बेसल मिथाइलेशन स्तरों के साथ एमसीएफ7 जैसी सेल लाइनों का उपयोग किया जासकता है (चित्रा 1 सी)। पीआरएमटी1 अवरोध के प्रभाव का पालन करने के लिए इष्टतम समय, उदाहरण के लिए टाइप I पीआरएमटी अवरोधक MS0238के साथ उपचार पर, 2 दिन(चित्रा 1D,1E)है। लंबे समय तक उपचार कम सेल व्यवहार्यता और विकास में परिणाम है।

PRMT3 परख
PRMT3 सेलुलर परख के लिए, कोई चयनात्मक बायोमार्कर प्रोटीन जो मिथाइलेशन परिवर्तन PRMT3 नॉकडाउन या अतिव्यक्तता पर पश्चिमी दाग में पता लगाया जा सकता है । PRMT3 को विट्रो14में विषम रूप से डिमेथिलेट एच4आर 3 को दिखाया गया था, हालांकि, यह निशान मुख्य रूप से PRMT1 द्वारा जमा किया गया है, और इसलिए अतिउप्रेसित पीआरएमटी 3 के साथ एक बहिर्जात परख डिजाइन की गई थी। इन विट्रो निष्कर्षों के अनुरूप, जंगली-प्रकार के PRMT3 का अतिव्यवसंन लेकिन इसके उत्प्रेरक उत्परिवर्ती (E338Q) के कारण H4R3me2a स्तर(चित्रा 2A)में वृद्धि हुई। HEK293T कोशिकाओं का उपयोग किया गया था क्योंकि उनके पास इस निशान(चित्रा 1C)का कम बेसल मिथाइलेशन है। परख को आगे PRMT3 चयनात्मक अवरोधक SGC7077के साथ मान्य किया गया था, जो PRMT3-निर्भर H4R3 असममित मिथाइलेशन(चित्रा 2B)को रोकता था।

PRMT4 परख
PRMT4 विषम dimethylates BAF155 arginine १०६४१५में । चूंकि एंटीबॉडी का पता लगाने BAF165-R1064me2a व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, कोशिकाओं में PRMT4 गतिविधि R1064me2a निशान के स्तर में परिवर्तन का पता लगाने के द्वारा पश्चिमी दाग द्वारा निगरानी की जा सकती है । PRMT4 प्रोटीन या PRMT4 चयनात्मक अवरोधक, टीपी-06410के साथ उत्प्रेरक गतिविधि के अवरोध की हानि, BAF165-R1064me2a स्तर(चित्रा 3)में कमी के परिणामस्वरूप । 2 दिन का उपचार आमतौर पर अधिकांश मिथाइलेशन सिग्नल को हटाने के लिए पर्याप्त होता है।

PRMT5 परख
PRMT5 प्रोटीन आर्जिनिन सममित डाइमिथाइलेशन के बहुमत के लिए जिम्मेदार है। यह पहले बताया गया है कि एसएमबीबी सहित विभिन्न एसएमएन जटिल प्रोटीन, PRMT5 सब्सट्रेट्स16हैं । एसएमबीबी के प्रोटीन के सममित आर्जिनिन डाइमिथाइलेशन या सममित डाइमिथाइलेशन के वैश्विक स्तर में परिवर्तन को देखकर PRMT5 गतिविधि की निगरानी की जा सकती है। PRMT5का नॉकआउट, लेकिन नहीं PRMT1, 3, 4, 6, और 7 वैश्विक Rme2s स्तर(चित्रा 4A)में कमी में परिणाम है । अधिकांश सेल लाइनों में, 2-3 दिनों के लिए PRMT5 चयनात्मक अवरोधक LLY-28311 और GSK591 के साथ कोशिकाओं के उपचार ने अधिकांश SmBB'Rme2s सिग्नल(चित्रा 4B)को दबा दिया। अधिकांश कोशिकाएं PRMT5 अवरोध के प्रति संवेदनशील होती हैं, जिसके परिणामस्वरूप लंबे समय तक अवरोधक जोखिम के साथ सेल प्रसार और सेल मृत्यु में कमी आती है।

PRMT6 परख
यह सूचित किया गया है कि PRMT6 कोशिकाओं17में हिस्टोन एच 3 आर्जिनिन 2 असममित डाइमिथाइलेशन (H3R2me2a) का मुख्य योगदानकर्ता है। HEK293T कोशिकाओं में, 3 दिनों के लिए PRMT6 नॉकडाउन H3R2me2a स्तरों में एक महत्वपूर्ण कमी का निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त नहीं था । हालांकि, जंगली प्रकार PRMT6 के अतिव्यवद्रण लेकिन इसके उत्प्रेरक उत्परिवर्ती (V86K/D88A) H3R2me2a के स्तर को बढ़ाता है, साथ ही H3R8me2a और H4R3me2a(चित्रा 5A)। विभिन्न शक्ति और चयनात्मकता के साथ पीआरएमटी 6 गतिविधि को बाधित करने वाले कई अवरोधक हैं: चयनात्मक, एलोस्टेरिक पीआरएमटी6 अवरोधक एसजीसी 687018,पीआरएमटी प्रकार आई अवरोधक एमएस0238,और पीआरएमटी4/6 अवरोधक एमएस0499। इन सभी ने PRMT6 निर्भर H3R2(चित्रा 5B),साथ ही H4R3 और H3R8 असममित डाइमेथाइलेशन (डेटा नहीं दिखाया गया) को बाधित किया।

PRMT7 परख
PRMT7 मोनोमेथाइलेट आर्जिनिन 469 क्रमशः एचएसपी 70 (एचएसपीए8 और एचएसपीए1/6, दोनों के संविलियन और प्रेरक रूपों में)12। हालांकि कोई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी नहीं है, जो HSP70-R469me1 स्तरों का पता लगाते हैं, निशान पैन मोनोमेथाइल एंटीबॉडी के साथ पता लगाया जा सकता है । PRMT7 प्रोटीन या PRMT7 चयनात्मक अवरोधक, SGC302712के साथ उत्प्रेरक गतिविधि के अवरोध की हानि, HSP70-R469me1(चित्रा 6A,बी)के स्तर में कमी आई है । एसजीसी 3027 एक सेल-पारगम्य प्रोड्रग है, जिसे कोशिकाओं में पुनः प्रवेश द्वारा PRMT7 चयनात्मक अवरोधक एसजीसी 8158 में परिवर्तित किया जाता है, इसलिए सेल लाइनों के बीच सेलुलर शक्ति भिन्न हो सकती है। कई कैंसर सेल लाइनें उच्च स्तर पर कठिन HSP70 आइसोफॉर्म व्यक्त करती हैं, और मिथाइलेशन परमाणु मूल के अतिव्यापी अविशिष्ट बैंड(चित्रा 6C)के कारण पता लगाना मुश्किल हो सकता है। इसलिए, PRMT7 सेलुलर परख के लिए, सेल लाइनें जो ज्यादातर HSPA8 जैसे C2C12 को व्यक्त करती हैं, या चूंकि एचएसपी 70 मुख्य रूप से साइटोप्लाज्म में स्थानीयकरण करता है, इसलिए पसंदीदा सेल लाइनों के साइटोप्लाज्मिक अंश में एचएसपी 70-आर469मे1 स्तर निर्धारित करें।

PRMT8 परख
PRMT8 एक ऊतक प्रतिबंधित अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ ही PRMT है-मोटे तौर पर मस्तिष्क19में व्यक्त की । यह 80% अनुक्रम समानता साझा करता है और पीआरएमटी19के समान सब्सट्रेट वरीयता है। यह मुख्य रूप से एन-टर्मिनस में पीआरएमटी1 से अलग है, जहां प्लाज्मा झिल्ली20के साथ पीआरएमटी8 के सहयोग में myristoylation परिणाम है। यह बताया गया है कि PRMT8 एक साथ PRMT1 मिथाइलेट्स आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन ईडब्ल्यूएस21के साथ । चूंकि पीआरएमटी8 गतिविधि गैर-न्यूरोनल सेल लाइनों में कम है और ईडब्ल्यूएस को पीआरएमटी1 द्वारा मेथिलेटेड भी किया जा सकता है, एक परख जिसमें पीएमआरटी 8 को PRMT1 नॉकडाउन कोशिकाओं में ईडब्ल्यूएस के साथ सह-अधिविध किया गया है। चूंकि PRMT1 एक आवश्यक जीन है और इसके दीर्घकालिक नुकसान के परिणाम कोशिका मृत्यु में, एक कठिन प्रणाली जिसमें PRMT1 PRMT8 परख में उपयोग से पहले 3 दिनों के लिए नीचे खटखटाया है(चित्रा 7A)का उपयोग किया गया था । जंगली प्रकार की पीआरएमटी8 की सह-अभिव्यक्ति, लेकिन उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय उत्परिवर्ती (E185Q) नहीं, ईडब्ल्यूएस के साथ ईडब्ल्यूएस असममित डाइमेथाइलेशन(चित्रा 7B)के स्तर में वृद्धि हुई। कई असममित डिमेथाइलार्जिन एंटीबॉडी का परीक्षण किया गया था और मिथाइलेशन केवल Asym25 एंटीबॉडी के साथ पाया गया था। परख को आगे एक पीआरएमटी प्रकार I चयनात्मक रासायनिक जांच, MS0238के साथ मान्य किया गया था, जिसने एक्सोजेनस ईडब्ल्यूएस(चित्र 7 बी)के पीआरएमटी8-निर्भर असममित डाइमेथिलेशन में कमी आई। हालांकि MS023 इन विट्रो परख में PRMT8 बाधा में बहुत शक्तिशाली है, कोशिकाओं में MS023 की उच्च सांद्रता मिथाइलेशन अवरोध21देखने के लिए आवश्यक हैं ।

PRMT9 परख
पीआरएमटी9 को आर्जिन 50822में सममित रूप से डिमेथिलेट SAP145 दिखाया गया था। दुर्भाग्य से, कोई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी निशान पहचान सकते हैं । PRMT9 परख के लिए, एंटीबॉडी है कि कृपया डॉ Yanzhong यांग (होप के सिटी के बेकमैन अनुसंधान संस्थान) द्वारा उपहार में दिया गया था इस्तेमाल किया गया । जब अतिउपचार, जंगली प्रकार लेकिन R508K उत्परिवर्ती SAP145 नहीं PRMT9(चित्रा 8A)द्वारा मिथाइलेटेड है । परख को अंतर्जात SAP145-R508me2s के स्तर की निगरानी के लिए डिज़ाइन किया गया था और इसे कंपाउंड एक्स, एक प्रोटोटाइप पीआरएमटी 9 अवरोधक (प्रगति में काम, अभी तक प्रकाशित नहीं) के साथ मान्य किया गया था, जो नैनोमोलर शक्ति के साथ विट्रो में PRMT9 को रोकता है। यौगिक एक्स एक खुराक पर निर्भर तरीके से SAP145-R508me2s स्तर कम(चित्रा 8B)।

Figure 1
चित्रा 1। PRMT1 सेलुलर परख। (A) PRMT1 नॉकडाउन के परिणामस्वरूप वैश्विक असममित आर्जिनिन डाइमेथाइलेशन (Rme2a) की कमी और सममित आर्जिनिन डाइमेथाइलेशन (Rme2s) और मोनोमेथाइलेशन (Rme1) के स्तर में वृद्धि हुई है । PRMT1 नॉकडाउन दक्षता पैनल बी में प्रस्तुत की गई है(बी)PRMT1 नॉकडाउन हिस्टोन H4R3 (H4R3me2a) के असममित डाइमेथिलेशन को कम करता है। (ग)बेसल एच4आर3एमईए का स्तर विभिन्न सेल लाइनों में भिन्न होता है । (घ)प्रकार मैं PRMT अवरोधक MS023 एक खुराक पर निर्भर तरीके से H4R3me2a स्तर कम हो जाती है । MCF7 कोशिकाओं को 2 दिनों के लिए MS023 के साथ इलाज किया गया । (ई)ग्राफ H4R3me2a सिग्नल तीव्रता के nonlinear फिट का प्रतिनिधित्व करता है कुल histone H4 को सामान्यीकृत । MS023 IC50 = 8.3 एनएम (n =1) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। PRMT3 सेलुलर परख। (क)वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यूटी) का अतिउपद्रण लेकिन पीआरएमटी3 का E338Q उत्प्रेरक उत्परिवर्ती एच 4R3me2a स्तर एचके293टी कोशिकाओं में बढ़ जाता है । कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए फ्लैग-टैग किए गए पीआरएमटी3 से संक्रमित किया गया था (बी)PRMT3 चयनात्मक अवरोधक, SGC707, एक्टोपिक PRMT3 निर्भर H4R3 असममित demethylation कम हो जाती है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। PRMT4 सेलुलर परख। (A) PRMT4 नॉकडाउन के परिणामस्वरूप BAF155-R1064 असममित आर्जिनिन डाइमिथिलेशन (HEK293T कोशिकाओं) की कमी होती है । (B)PRMT4 चयनात्मक अवरोधक, टीपी-064, BAF155-R1064Rme2a स्तर कम हो जाती है। HEK293T कोशिकाओं को 2 दिनों के लिए यौगिक के साथ इलाज किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4। PRMT5 सेलुलर परख। (A) PRMT5 नॉकडाउन के परिणामस्वरूप वैश्विक सममित आर्जिनिन डाइमिथाइलेशन स्तर (एमसीएफ7 कोशिकाओं) की कमी होती है। (B)PRMT5 चयनात्मक अवरोधक GSK591 और LLY-283, कम SmBB ' सममित arginine dimethylation (हरा), जबकि SmBB के कुल स्तर अपरिवर्तित (लाल) रहते हैं । MCF7 कोशिकाओं को 2 दिनों के लिए यौगिकों के साथ इलाज किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5। PRMT6 सेलुलर परख। (क)वाइल्ड टाइप (डब्ल्यूटी) का ओवरएक्सप्रेशन लेकिन V86K/D88A उत्प्रेरक उत्परिवर्ती PRMT6 H4R3me2a, H3R2me2a, और H3R8me2a स्तर HEK293T कोशिकाओं में बढ़ जाती है । कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए फ्लैग-टैग किए गए पीआरएमटी6(बी)PRMT6 चयनात्मक अवरोधक (SGC6870), पीआरएमटी टाइप I अवरोधक (MS023), और PRMT4/6 अवरोधक (MS049) कम PRMT6 निर्भर H3R2me2a स्तरों से संक्रमित थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6। PRMT7 सेलुलर परख। (A) PRMT7 नॉकआउट परिणाम HSP70-R469 मोनोमिथाइलेशन (HCT116 कोशिकाओं) की कमी में । (B)PRMT7 चयनात्मक अवरोधक, SGC3027, C2C12 कोशिकाओं में HSP70-R469 मोनोमेथाइलेशन को कम करता है । कोशिकाओं को 2 दिनों के लिए यौगिक के साथ इलाज किया गया । (C)परमाणु मूल के अतिव्यापी अविशिष्ट बैंड के कारण पैन मोनोमिथाइल आर्जिनिन एंटीबॉडी (आरएमई1) के साथ कठिन एचएसपी70-आर469 मिथाइलेशन ऑफ अकुशल एचएसपी 70 (एचएसपीए1/6) का पता लगाना मुश्किल हो सकता है । साइटोप्लाज्मिक अंश में एचएसपी 70 मिथाइलेशन के स्तर को मापने की सिफारिश की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7। PRMT8 सेलुलर परख। (A)जब पीआरएमटी1 गतिविधि नॉकआउट से बाधित होती है तो ईडब्ल्यूएस के PRMT8 मिथाइलेशन का पता लगाया जा सकता है । HEK293T कोशिकाओं को एक कठिन PRMT1 नॉकडाउन वेक्टर के साथ स्थानांतरित किया गया था। डॉक्सीसाइक्लिन ट्रीटमेंट के 3 दिन बाद पीआरएमटी1 का स्तर काफी कम हो गया। (ख)जब PRMT1 नीचे खटखटाया है, बहिर्जात ईडब्ल्यूएस विषम रूप से अतिउत्तबद्ध जंगली प्रकार PRMT8 द्वारा मंद है, लेकिन PRMT8 के उत्प्रेरक उत्परिवर्ती (E185Q) उत्प्रेरक नहीं है । मिथाइलेशन को पीआरएमटी प्रकार के उच्च एकाग्रता से कम किया जाता है, मैं अवरोधक (MS023)। HEK293T PRMT1KD कोशिकाओं को सह-ध्वज टैग PRMT8 जंगली प्रकार या उत्प्रेरक उत्परिवर्ती और GFP टैग EWS और 20 घंटे के लिए MS023 के साथ इलाज के साथ संक्रमित थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8। PRMT9 सेलुलर परख। (A)वाइल्ड टाइप लेकिन R508K उत्परिवर्ती SAP145 को पीआरएमटी9 द्वारा मिथाइलेटेड नहीं किया जाता है। HEK293T कोशिकाओं को 1 दिन के लिए GFP-टैग SAP145 से संक्रमित किया गया था । (ख)प्रोटोटाइप PRMT9 अवरोधक (यौगिक एक्स) एक खुराक पर निर्भर तरीके से SAP145 के PRMT9 निर्भर R508 सममित डिमंपी डिमंथिलेशन कम हो जाती है । HEK293T कोशिकाओं को 2 दिनों के लिए यौगिक के साथ इलाज किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पीआरएमटी कोशिकाएँ प्रति मिलीलीटर घनत्व
पीआरएमटी1 एमसीएफ7 1 x 105
पीआरएमटी3 HEK293T 2 x 105
पीआरएमटी4 HEK293T 1 x 105
पीआरएमटी5 एमसीएफ7 1 x 105
पीआरएमटी6 HEK293T 2 x 105
पीआरएमटी7 C2C12 1 x 105
पीआरएमटी8 HEK293T (PRMT1 KD)* 2 x 105
पीआरएमटी9 HEK293T 2 x 105
* PRMT8 परख के लिए चढ़ाना से पहले डॉक्सीसाइक्लिन (2 μg/mL) के साथ कोशिकाओं का इलाज

तालिका 1. पीआरएमटी परख के लिए अनुशंसित सेल प्रकार और घनत्व।

पीआरएमटी μg डीएनए/24-अच्छी तरह से ऐडजीन # अतिरिक्त नोट्स
पीआरएमटी3 0.5 फ्लैग-पीआरएमटी3 164695
या 0.5 फ्लैग-पीआरएमटी 3 (E338Q) 164696
पीआरएमटी6 0.5 फ्लैग-पीआरएमटी6 164697
या 0.5 फ्लैग-पीआरएमटी6 (V86K/D88A) 164698
पीआरएमटी8 0.05 ईडब्ल्यूएस-जीएफपी 164701
0.45 PRMT8-झंडा 164699
या 0.45 PRMT8 (E185Q) -झंडा 164700
पीआरएमटी9 0.05 SAP145-GFP ना डॉ यांझोंग यांग, बेकमैन रिसर्च इंस्टीट्यूट ऑफ सिटी ऑफ होप से उपहार
या 0.05 SAP145-R508K-GFP
0.45 खाली वेक्टर

तालिका 2. ट्रांसफेक्शन प्रयोग के लिए अनुशंसित डीएनए एकाग्रता।

पीआरएमटी रोग-प्रतिकारक रासायनिक जांच (सेल गतिविधि IC50) नकारात्मक नियंत्रण
पीआरएमटी1 H4R3me2a (1:2000) MS023 -PRMT प्रकार मैं एमएस094
Rme1 (1:1000) (PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 एनएम, क्रमशः)
Rme2s (1:2000)
Rme2a (1:2000)
Rme2a (ASYM24, 1:3000)
Rme2a (ASYM25, 1:2000)
H4 (1:2000)
बी-ऐक्टिन (1:500)
पीआरएमटी3 H4 (1:2000) SGC707 (IC50 = 91 एनएम) XY-1
H4R3me2a (1:2000)
फ्लैग (1:5000)
पीआरएमटी4 BAF155 (1:200) टीपी-064 (IC50 = 43 एनएम) टीपी064एन
BAF155-R1064me2a (1:3000) स्की-73 (IC50 = 540 एनएम)* स्की-73N *
पीआरएमटी5 विरोधी SmBB ' (1:100) LLY-283 (IC50 = 30 एनएम) एलएली-284
Rme2s (#13222, 1:2000) GSK591 (IC50 = 56 एनएम) एसजीसी2096
पीआरएमटी6 H4R3me2a (1:2000) SGC6870 (IC50 = 0.9 माइक्रोन) एसजीसी6870एन
H4 (1:2000) MS023 -PRMT प्रकार मैं एमएस094
H3R2me2a ( 1:2000) (PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 एनएम, क्रमशः)
H3R8me2a (1:2000) MS049 (PRMT 4, 6 IC50 = 970, 1400 एनएम, क्रमशः) एमएस049एन
H3 ( 1:5000)
फ्लैग ( 1:5000)
पीआरएमटी7 Rme1 (1:1000) SGC3027 (IC50 = 1300 एनएम) * SGC3027N *
Hsp/Hsc70 (1:2000)*
पीआरएमटी8 जीएफपी (1:3000) MS023 (50 माइक्रोन) एमएस094
Rme2a (ASYM25,1:2000)
फ्लैग (1:5000)
पीआरएमटी9 SAP145 (1:1000)
SAP145-R508me2s-डॉ Yanzhong यांग, बेकमैन रिसर्च इंस्टीट्यूट ऑफ सिटी ऑफ होप (1:1000) (PIMID: 25737013) से तरह का उपहार
माध्यमिक एंटीबॉडी बकरी विरोधी खरगोश IgG-IR800 (1:5000)
गधा विरोधी माउस IgG-IR680 (1:5000)
*- एंटीबॉडी एचएसपीए 8, एचएसपीए 1 और एचएसपीए 6 को पहचानता है (अतिउपर्णित जीएफपी-टैग किए गए प्रोटीन के साथ परीक्षण किया गया), * प्रोड्रग - IC50 विभिन्न सेल लाइनों के बीच भिन्न हो सकता है

तालिका 3. अनुशंसित एंटीबॉडी और पीआरएमटी रासायनिक जांच/नकारात्मक नियंत्रण उपकरण यौगिक।

पीआरएमटी बायोमार्कर परख रीडआउट परख सत्यापन अनुशंसित सेल लाइन रेफरी।
पीआरएमटी1 H4R3me2a, Rme1, Rme2s, Rme2a H4R3me2a स्तर कुल H4 वैश्विक Rme1, Rme2a या Rme2s स्तर बी-actin को सामान्यीकृत करने के लिए सामान्यीकृत । PRMT1 के नॉकआउट बेसल H4R3me2a और वैश्विक Rme2a स्तर में कमी आई और कोशिकाओं में वैश्विक Rme1 और Rme2s स्तर में वृद्धि हुई (चित्र 1A, बी) । PRMT प्रकार मैं रासायनिक जांच MS023 एक खुराक पर निर्भर तरीके से H4R3me2a के स्तर में कमी आई (चित्र 1 डी) । कोशिकाओं बेसल H4R3me2a स्तर (चित्र 1C) में अलग है । MCF7 कोशिकाओं में उच्च बेसल H4R3me2a स्तर होता है जो इसे PRMT1 गतिविधि में कमी की निगरानी के लिए बेहतर बनाता है। 8
पीआरएमटी3 H4R3me2a एच4आर3एमईए मिथाइलेशन का स्तर एक्सजेनस फ्लैग-टैग किए गए पीआरएमटी3 डब्ल्यूटीई या उत्प्रेरक E338Q उत्परिवर्ती (पृष्ठभूमि) के कुल हिस्टोन एच 4 को सामान्यीकृत किया गया जंगली प्रकार PRMT3 की अतिव्यक्ति लेकिन इसके उत्प्रेरक उत्परिवर्ती (E338Q) H4R3me2a (चित्र 2A) में वृद्धि हुई है । PRMT3 चयनात्मक अवरोधक SGC707 H4R3me2a स्तरों में PRMT3 निर्भर वृद्धि में कमी आई (चित्र 2B) HEK293T कोशिकाओं में कम बेसल H4R3me2a स्तर (चित्र 1C) होता है, जो बहिर्जात पीआरएमटी3 गतिविधि की निगरानी के लिए बेहतर है 7
पीआरएमटी4 BAF155-R1064me2a BAF155-R1064me2a स्तर कुल BAF155 को सामान्यीकृत PRMT4 नॉकडाउन BAF155 (चित्र 3A) के असममित डिमेथाइलेशन में कमी आई । PRMT4 चयनात्मक रासायनिक जांच (टीपी-064) के साथ 2 दिन उपचार BAF155 (चित्र 3 बी) के असममित डाइमेथिलेशन में कमी आई। किसी भी सेल लाइन 10
पीआरएमटी5 SmBB'-Rme2s SmBB'-Rme2s पैन Rme2s एंटीबॉडी (सीएसटी) के साथ पाया स्तर कुल SmBB के लिए सामान्यीकृत ' PRMT5 के नॉकआउट के परिणामस्वरूप एसएमबीबी के सममित डाइमेथाइलेशन स्तर (चित्र 4 ए) में कमी आई। PRMT5 चयनात्मक रासायनिक जांच, GSK591 और LLY285 के साथ 2 दिन उपचार, SmBB'-Rme2s स्तर (चित्र 4B) में कमी आई । किसी भी सेल लाइन 11
पीआरएमटी6 H4R3me2a
H3R2me2a
H3R8me2a		 H4R3me2a, H3R2me2a या H3R8me2a मिथाइलेशन का स्तर बहिर्जात ध्वज-टैग किए गए PRMT6 WT द्वारा बढ़ाया जाता है, लेकिन उत्प्रेरक V86K, D88A उत्परिवर्ती (पृष्ठभूमि) क्रमशः कुल हाईस्टोन एच 4 या एच 3 में सामान्यीकृत नहीं होता है जंगली प्रकार PRMT6 के अतिव्यवद्रण लेकिन इसके उत्प्रेरक उत्परिवर्ती (V86K, D88A) H3R2me2a, H3R8me2a और H4R3me2a स्तर (चित्र 5A) में वृद्धि हुई । एलोस्टेरिक पीआरएमटी6 अवरोधक (एसजीसी 6870), पीआरएमटी प्रकार आई अवरोधक MS023, PRMT4/6 अवरोधक MS049 ने H3R2me2a स्तरों (चित्र 5B) में PRMT6 निर्भर वृद्धि में कमी आई। HEK293T कोशिकाओं में कम बेसल H4R3me2a, H3R2me2a और H3R8me2a स्तर है, जो बहिर्जात PRMT6 गतिविधि की निगरानी के लिए बेहतर है 8,9
पीआरएमटी7 HSP70-R469me1 HSP70-Rme1 मिथाइलेशन स्तर कुल HSP70 को सामान्यीकृत PRMT7 नॉकआउट या नॉकडाउन कम HSP70 मोनोमिथाइलेशन (चित्र 6A) । PRMT7 चयनात्मक रासायनिक जांच के साथ 2 दिन उपचार SGC3027 एक खुराक पर निर्भर तरीके से PRMT7 निर्भर HSP70 मोनोमिथाइलेशन में कमी आई (चित्र 6B) । C2C12, HT180
कई कैंसर सेल लाइनें एचएसपी 70 का एक अकथनीय रूप व्यक्त करती हैं जिसका मिथाइलेशन सिग्नल परमाणु मूल (अंजीर 6 सी) के एक अविशिष्ट प्रोटीन के साथ ओवरलैप होता है। इस मामले में, हम साइटोप्लाज्मिक अंश में एचएसपी 70 मिथाइलेशन के स्तर का विश्लेषण करने की सलाह देते हैं।		 12
पीआरएमटी8 ईडब्ल्यूएस-आरमे2ए बहिर्जात जीएफपी-टैग ईडब्ल्यूएस मिथाइलेशन स्तर एक्सजेनोसियस फ्लैग-टैग किए गए पीआरएमटी8 डब्ल्यूटीई या ई185क्यू उत्प्रेरक उत्परिवर्ती (पृष्ठभूमि), PRMT1 KO कोशिकाओं में कुल जीएफपी संकेत को सामान्यीकृत किया गया है। जंगली प्रकार PRMT8 का अतिव्यवसंय लेकिन उत्प्रेरक नहीं E185Q उत्परिवर्ती मेथिलेटेड एक्टोपिक ईडब्ल्यूएस केवल PRMT1 केडी कोशिकाओं (चित्र 7 ए) में। पीआरएमटी प्रकार I रासायनिक जांच MS023 ने PRMT8 (चित्र 8B) द्वारा एक्सोजेनस ईडब्ल्यूएस के असममित डाइमेथिलेशन को बाधित किया। HEK293T PRMT1 KD (Inducable) ।
PRMT1 नॉकडाउन सेल मौत में परिणाम इसलिए हम एक कठिन प्रणाली का उपयोग करने की सलाह देते हैं।		 8
पीआरएमटी9 SAP145-R508me2s PRMT9 निर्भर SAP145 सममित डिमेथाइलेशन पर R508 सामान्यीकृत SAP145 नुकसान PRMT9 लेकिन नहीं PRMT5 SAP145 के सममित डाइमेथिलेशन में कमी करने के लिए सीसा । GFP टैग SAP145 WT लेकिन नहीं SAP145mut (R508K) PRMT9 (चित्र 8A) द्वारा मिथाइलेटेड था । कोपॉंड एक्स के साथ 2-दिन का उपचार, प्रोटोटाइप PRMT9 अवरोधक, खुराक-निर्भर तरीके से अंजीर 8B में SAP145-R508me2s के स्तर में कमी आई है।) किसी भी सेल लाइन 21

तालिका 4. PRMT परख सारांश।

Discussion

यहां, पीआरएमटी परिवार के सदस्यों के लिए विस्तृत सेलुलर परख प्रोटोकॉल वर्णित हैं कि फ्लोरोसेंट पश्चिमी ब्लॉटिंग विधियों का उपयोग करें। अद्वितीय सब्सट्रेट्स जिसके लिए आर्जिनिन मिथाइलेशन में परिवर्तन को व्यक्तिगत पीआरएमटी हानि या उत्प्रेरक अवरोध पर आसानी से पता लगाया जा सकता है और परिवार के अन्य सदस्यों द्वारा मुआवजा नहीं दिया जा सकता है। कुछ प्रोटीन को मल्टीपल पीआरएमटी21, 23द्वारा मेथिलेटेड कियाजाताहै, जो सब्सट्रेट विशिष्टता में ओवरलैप का सुझाव देता है, जहां कुछ पीआरएमटी किसी दिए गए प्रोटीन सब्सट्रेट24,25, 26,27में केवल थोड़ी मात्रा में सेलुलर मार्क का योगदान करते हैं, उदाहरण के लिए, पीआरएमटी8 और पीआरएमटी1 दोनों ईडब्ल्यूएस के मिथाइलेशन में योगदान देते हैं। इसलिए, प्रत्येक परख में नॉकडाउन और/या अतिव्यक्तता प्रयोगों के साथ सब्सट्रेट्स और एंटीबॉडी की पूरी तरह से सत्यापन और अच्छी तरह से विशेषता वाले चयनात्मक अवरोधकों के साथ आगे सत्यापन की आवश्यकता होती है । पीआरएमटी विशिष्ट सब्सट्रेट्स की पहचान की गई थी जिसके लिए कम सेल व्यवहार्यता और प्रसार के जटिल प्रभावों से बचने के लिए 2-3 दिनों के भीतर मिथाइलेशन मार्क परिवर्तनों का पता लगाया जा सकता है जो अप्रत्यक्ष रूप से मिथाइल-आर्जिनिन मार्क स्तर को प्रभावित कर सकते हैं । हालांकि पीआरएमटी 1, 4, 5, 7 और 9 के लिए अद्वितीय सब्सट्रेट्स ढूंढना संभव था; PRMT3, 6, और 8 के लिए समारोह दृष्टिकोण का लाभ नियोजित किया जाना था । विभिन्न सेलुलर लक्ष्यों के लिए कई आर्जिनिन मिथाइल-विशिष्ट एंटीबॉडी का परीक्षण किया गया था, लेकिन कोई भी PRMT3 और PRMT6 नॉकडाउन के 3 दिनों के भीतर महत्वपूर्ण परिवर्तनों का पता लगाने में सक्षम नहीं था; इसलिए, बायोमार्कर परख को उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय म्यूटेंट के साथ एक साथ एक्टोपिकल रूप से व्यक्त एंजाइमों का उपयोग करके विकसित किया गया था, जो बेसलाइन सब्सट्रेट मिथाइलेशन के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता था। PRMT8 एक करीबी PRMT1 समरूप है और इसी तरह की सब्सट्रेट वरीयताओं को साझा करता है। एक PRMT8 चयनात्मक बायोमार्कर की पहचान नहीं की जा सकती है, पीआरएमटी 1 नॉकडाउन कोशिकाओं में एक परख विकसित की गई थी, जहां PRMT8 को ईडब्ल्यूएस के साथ सह-व्यक्त किया गया था। PRMT1 एच4आर 3 असममित मिथाइलेशन के लिए जिम्मेदार एक प्रमुख एंजाइम भी है, इसलिए, PRMT3 और PRMT6 सेलुलर परख के लिए एक बायोमार्कर के रूप में H4R3me2a का उपयोग करने के लिए, कम बेसल H4R3me2a स्तर वाली कोशिकाओं को चुना गया था और साथ ही उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय म्यूटेंट का उपयोग पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में किया गया था। यद्यपि अंतर्जात परख को प्राथमिकता दी जाती है, लेकिन कई चुनिंदा पीआरएमटी अवरोधकों7,8,9की सेलुलर शक्ति का परीक्षण करने के लिए बहिर्जात परख अमूल्य साबित होती है। पीआरएमटी जीव विज्ञान के बढ़ते ज्ञान के साथ, हम PRMT3, PRMT6, और PRMT8 के लिए अधिक विशिष्ट बायोमार्कर प्रोटीन खोजने के द्वारा परख में सुधार की उम्मीद करते हैं।

पीआरएमटी परख प्रदर्शन के लिए मान्य एंटीबॉडी और उचित नियंत्रण का उपयोग महत्वपूर्ण है। यहां अनुशंसित सभी एंटीबॉडी को नॉकडाउन और अतिव्यक्तता प्रयोगों द्वारा अच्छी तरह से मान्य किया गया है, हालांकि, बैच-टू-बैच अंतर, विशेष रूप से पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के मामले में, अभी भी उनके प्रदर्शन को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, परख विश्वसनीयता की पुष्टि करने के लिए आनुवंशिक तरीकों और रासायनिक जांच का उपयोग उनके बारीकी से संबंधित नकारात्मक नियंत्रणों के साथ करना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, पीआरएमटी परख के लिए, जिसमें प्रोटीन ओवरएक्सप्रेशन की आवश्यकता होती है, बेसल मिथाइलेशन स्तर निर्धारित करने के लिए जंगली प्रकार के प्रोटीन के साथ उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय म्यूटेंट का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।

कोशिकाओं में पीआरएमटी की गतिविधि की प्रोफाइलिंग के लिए मात्रात्मक परख का यह संग्रह वैज्ञानिक समुदाय के लिए मोटे तौर पर उपयोगी हो सकता है क्योंकि इसे न्यूनतम उपकरणों और सीमित तकनीकी विशेषज्ञता के साथ तेजी से और आसानी से लागू किया जा सकता है, जिसमें केवल बुनियादी सेल culturing और फ्लोरोसेंट पश्चिमी ब्लॉटिंग तकनीक शामिल हैं। पीआरएमटीएस के लिए अनुशंसित एंटीबॉडी और रासायनिक जांच का उपयोग गतिविधि-आधारित प्रोटीन प्रोफाइलिंग (एबीपीपी) के लिए भी किया जा सकता है ताकि किसी दिए गए एबीपीपी जांच की उपयुक्तता स्थापित की जा सके, लक्ष्य सगाई की निगरानी की जा सके और प्रतिस्पर्धी ABPP प्रारूप का उपयोग करके ऑफ-टारगेट प्रभावों का आकलन किया जा सके । यहां चर्चा किए गए परख विकास दृष्टिकोणों को प्रोटीन lysine-मिथाइलट्रांसफेरेस और एसिटाइलट्रांसफेरेस जैसे अन्य एंजाइम परिवारों के लिए भी एक्सपेरिमेंट किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या अन्य परस्पर विरोधी हित नहीं हैं ।

Acknowledgments

स्ट्रक्चरल जीनोमिक्स कंसोर्टियम एक पंजीकृत चैरिटी है (नहीं: 1097737) जो AbbVie, बायर एजी से धन प्राप्त करता है, बोहरिंगर इंगलहेम, जेनेटेक, जीनोम कनाडा के माध्यम से ओंटारियो जीनोमिक्स इंस्टीट्यूट [ओजीआई-196], इनोवेटिव मेडिसिन्स इनिशिएटिव 2 ज्वाइंट अंडरटेकिंग [ईउबोपेन ग्रांट 875510], जानसेन, मर्क केगाए (कनाडा और अमेरिका में उर्फ ईएमडी), फाइजर, लेडा और वेलकम ट्रस्ट [106169/14/Z]।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm TC dishes Greiner bio-one 664160
24-well TC plates Greiner bio-one 662160
4–12% Bis-Tris Protein Gels ThermoFisher Scientiffic NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX
Amersham Hybond P PVDF membrane Millipore-Sigma 10600021
anti-Asym 24 Millipore-Sigma 07-414
anti-Asym 25 Millipore-Sigma 09-814
anti-B-actin Santa Cruz Biotechnologies sc-47778
anti-BAF155 Santa Cruz Biotechnologies sc-32763
anti-BAF155-R1064me2a Millipore-Sigma ABE1339
anti-FLAG (#, 1:5000) Millipore-Sigma F4799
anti-GFP Clontech 632381
anti-H3 Abcam ab10799
anti-H3R2me2a Millipore-Sigma 04-848
anti-H3R8me2a Rockland 600-401-I67
anti-H4 Abcam ab174628
anti-H4R3me2a Active Motif 39705
anti-Hsp/Hsc70 Enzo ADI-SPA-820
anti-PRMT1 Millipore-Sigma 07-404
anti-PRMT3 Abcam ab191562
anti-PRMT4 Bethyl #A300-421A
anti-PRMT5 Abcam ab109451
anti-PRMT6 Abcam ab47244
anti-PRMT7 Abcam ab179822
anti-Rme1 CST 8015
anti-Rme2a CST 13522
anti-Rme2s CST 13222
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000) 09-814
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000) Abcam ab56800
anti-SAP145-R508me2s kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope
anti-SmBB’ Santa Cruz Biotechnologies sc-130670
benzonase PRODUCED IN-HOUSE
BSA Millipore-Sigma A7906
C2C12 gift from Dr. Stephane Richard, McGill University
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Millipore-Sigma 11873580001
DMEM Wisent 319-005-CL
DMSO Bioshop DMS666.100
donkey anti-mouse IgG-IR680 Licor 926-68072
doxycycline Millipore-Sigma D9891
EDTA Bioshop EDT111.500
FBS Wisent 80150
glycine Bioshop GLN002.5
goat-anti-rabbit IgG-IR800 Licor 926-32211
HEK293T gift from Dr. Sam Benchimol, York University
Image Studio Software ver 5.2 Licor
Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) ThermoFisher Scientiffic NP0007
MCF7 ATCC® HTB-22™
NaCl Bioshop SOD001.1
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer ThermoFisher Scientiffic NP0001
Odyssey Blocking Buffer (dilute 4 x with PBST) Licor 927-40000 Intercept (PBS) Blocking Buffer can also be used # 927-70001
Odyssey CLX Imaging System Licor model number 9140
PBS (tissue culture) Wisent 311-010-CL
PBS (western blot) Bioshop PBS405.4
penstrep Wisent 450-201-EL
Pierce™ BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientiffic 23225
SDS Bioshop SDS001.1
skim milk powder Bioshop SKI400.500
TC20 automated cell counter Biorad 1450102
Tripsin-EDTA (0.25%) Wisent 325-043-EL
Tris Bioshop TRS003.5
Tritton X-100 Bioshop TRX506
trypan blue GIBCO 15250-061
Tween-20 Bioshop TWN510.500

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References

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जीव विज्ञान अंक 174
मात्रात्मक तरीके कोशिकाओं में प्रोटीन आर्जिनिन मिथाइलट्रांसफेरेज 1-9 गतिविधि का अध्ययन करने के लिए
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Szewczyk, M. M., Vu, V.,… More

Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Quantitative Methods to Study Protein Arginine Methyltransferase 1-9 Activity in Cells. J. Vis. Exp. (174), e62418, doi:10.3791/62418 (2021).

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