Quantitative Methoden zur Untersuchung der Protein-Arginin-Methyltransferase-1-9-Aktivität in Zellen

Zusammenfassung

Diese Protokolle liefern die Methodik zur Beurteilung der enzymatischen Aktivität einzelner Mitglieder der Protein-Arginin-Methyltransferase-Familie (PRMT) in Zellen. Detaillierte Richtlinien zur Bewertung der PRMT-Aktivität unter Verwendung endogener und exogener Biomarker, Methyl-Arginin-erkennender Antikörper und Inhibitor-Werkzeugverbindungen werden beschrieben.

Zusammenfassung

Proteinmethyltransferasen (PRMTs) katalysieren den Transfer einer Methylgruppe auf Argininreste von Substratproteinen. Die PRMT-Familie besteht aus neun Mitgliedern, die Monomethylat- oder symmetrisch/asymmetrisch Dimethylat-Arginin-Rückstände können. Mehrere Antikörper, die verschiedene Arten von Argininmethylierung verschiedener Proteine erkennen, sind verfügbar; Auf diese Weise werden Werkzeuge für die Entwicklung von PRMT-Aktivitäts-Biomarker-Assays bereitgestellt. PRMT-Antikörper-basierte Assays sind aufgrund überlappender Substrate und motivbasierter Antikörperspezifitäten eine Herausforderung. Diese Fragen und der experimentelle Aufbau zur Untersuchung der Argininmethylierung, die von einzelnen PRMTs beigetragen wird, werden diskutiert. Durch die sorgfältige Auswahl der repräsentativen Substrate, die Biomarker für acht von neun PRMTs sind, wurde ein Panel von PRMT-Aktivitätstests entwickelt. Hier werden die Protokolle für zelluläre Assays berichtet, die die enzymatische Aktivität einzelner Mitglieder der PRMT-Familie in Zellen quantitativ messen. Der Vorteil der beschriebenen Methoden ist ihre einfache Leistung in jedem Labor mit Zellkultur und fluoreszierenden Western-Blot-Fähigkeiten. Die Substratspezifität und die gewählte Antikörperzuverlässigkeit wurden mit Knockdown- und Overexpression-Ansätzen vollständig validiert. Neben detaillierten Richtlinien der Assay-Biomarker und Antikörper werden auch Informationen über den Einsatz einer Inhibitor-Tool-Compound-Sammlung für PRMTs bereitgestellt.

Einleitung

Die Argininmethylierung ist eine wichtige posttranslationale Modifikation, die Protein-Protein- und Protein-RNA-Interaktionen reguliert und somit eine wichtige Rolle bei verschiedenen zellulären Prozessen wie Pre-mRNA-Spleißen, DNA-Schäden, Transkriptionsreaktion und Wachstumsfaktor-vermittelter Transduktion spielt^1,2. Arginin wird durch Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs) methyliert, was zu Monomethyl arginin (Rme1), asymmetrischem Dimethylarginin (Rme2a) oder symmetrischem Dimethylarginin (Rme2s)³führt. Basierend auf dem Methylierungstyp werden PRMTs in drei Gruppen eingeteilt: Typ I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 und 8), die die mono- und asymmetrische Dimethylierung katalysieren; Typ II (PRMT5 und PRMT9), die mono- und symmetrische Dimethylierung katalysieren; und Typ III (PRMT7), der nur Monomethylat Arginin^{3 kann.}

Aufgrund einer wachsenden Anzahl kommerziell erhältlicher Argininmethylierungs-spezifischer Antikörper kann die PRMT-Aktivität mittels Western Blotting gemessen werden. Fluoreszenzbasierter Western Blot ist die bevorzugte Technik gegenüber der chemilumineszenzierenden Detektion aufgrund eines größeren Dynamikbereichs und linearität, einer höheren Empfindlichkeit und der Möglichkeit des Multiplexings⁴. Um die Proteinmethylierungsgrade zu quantifizieren, ist eine Normalisierung des Methylierungssignals auf den Gesamtproteinspiegel erforderlich. Durch die Auswahl der Antikörper für Gesamt- und methyliertes Protein, das in verschiedenen Wirtsarten (z. B. Maus und Kaninchen) gezüchtet wird, können sekundäre Antikörper verwendet werden, die mit verschiedenen Fluorophoren markiert sind, und das Signal für beide Antikörper kann im selben Probenband bestimmt werden. Methyl-Arginin-Antikörper wurden entwickelt, um monomethylierte, asymmetrische oder symmetrisch dimethylierte Proteine zu identifizieren und zu charakterisieren, bei denen Methyl-Arginin in einem bestimmten Kontext vorkommt. Da die Mehrheit der PRMTs Methylatglycin- und Arginin-reiche Motive in ihren Substraten⁵ist, wurden mehrere Antikörper für die Peptide erhoben, die Monomethyl- oder asymmetrische, symmetrische Dimethyl-Arginin-Glycin-Wiederholungen wie D5A12, ASYM24 oder ASYM25 bzw. SYM11 enthalten. Andere Methyl-Arginin-Antikörper wurden gegen eine Peptidbibliothek erzeugt, die asymmetrische, symmetrische Dimethyl- und Monomethyl arginin in einem wiederholten Kontext enthält, was den Nachweis von Methyl-Arginin in diesen speziellen Kontexten erleichtert⁶. Es gibt auch eine zunehmende Anzahl von Antikörpern, die spezifische Arginin-Markierungen auf einem einzelnen Protein erkennen, die einen selektiven Nachweis der Methylierung ermöglichen, wie Histon H4R3me2a oder BAF155-R1064me2a.

Es gibt mehrere kommerziell erhältliche PRMT-Inhibitoren, die als Werkzeuge für PRMT-Zellassays verwendet werden können. Allerdings sind nicht alle von ihnen gründlich für Selektivität und Off-Target-Effekte charakterisiert und einige sollten mit Vorsicht verwendet werden. Das Structural Genomic Consortium hat in Zusammenarbeit mit akademischen Labors und Pharmapartnern gut charakterisierte potente, selektive und zelldurchlässige PRMT-Inhibitoren (chemische Sonden) entwickelt, die von der wissenschaftlichen Gemeinschaft ohne Einschränkungen verwendet werden können. Informationen zu diesen Inhibitoren finden Sie auf https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics und https://www.chemicalprobes.org/. Chemische Sonden sind niedermolekulare Inhibitoren mit in vitro IC₅₀ oder K_d < 100 nM, über 30-facher Selektivität gegenüber Proteinen derselben Familie und signifikanter zellulärer Aktivität bei 1 μM. Zusätzlich hat jede chemische Sonde ein nahes chemisches Analogon, das gegen das beabsichtigte Ziel^7,8,9 ,^10,11,12inaktiv ist.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die zelluläre Aktivität einzelner PRMT-Familienmitglieder mit der fluoreszierenden Western-Blot-Methode zu messen. Hier finden Sie detaillierte Informationen zu validierten Assay-Biomarkern, Antikörpern und potenten zellaktiven Inhibitoren sowie wertvolle Strategien für eine erfolgreiche Assay-Implementierung.

Protokoll

1. Zellkultivierung und -beschichtung

HINWEIS: Kulturzellen mit empfohlenen Medien und routinemäßige Tests auf Mykoplasmenkontamination. HeK293T-, MCF7- und C2C12-Zellen wurden als Beispiele ausgewählt, da diese Zelllinien erfolgreich in PRMT-Assays eingesetzt wurden.

1. Kultur HEK293T, MCF7 und C2C12 in DMEM ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), Penicillin (100 U ml⁻¹⁾und Streptomycin (100 μg ml⁻¹⁾in 10 cm Gewebekultur behandelten (TC) Gerichten.
2. Für den PRMT8-Assay züchten Sie PRMT1-induzierbare Knockdown-HEK293T-Zellen in Medien, die Doxycyclin (2 μg/ml) enthalten, 3 Tage vor Beginn des Assays.
3. Um die Zellen zu plattieren, entfernen und entsorgen Sie die Medien von der Platte.
4. Fügen Sie 10 ml PBS (ohne Ca⁺² und Mg⁺² Ionen) hinzu, um die Zellen zu waschen und die Lösung zu entsorgen.
5. Fügen Sie 1 ml Trypsin-EDTA (0,25%) hinzu, inkubieren Sie für 1 minute bei Raumtemperatur (RT) und entsorgen Sie die Lösung dann. Inkubieren, bis die Zellen rund werden und sich von der Platte lösen. Tippen Sie auf die Platte, um die Zellen bei Bedarf zu lösen. Bei schwer zu trypsinisierten Zellen wie C2C12 wird die Platte 1-2 min bei 37 °C inkubiert.
   HINWEIS: Vermeiden Sie eine Zellexposition gegenüber Trypsinlösung für längere Zeiträume (>10 min), da dies die Zelllebensfähigkeit verringert.
6. Fügen Sie 1 ml vorgewarmtes Medium auf die Platte hinzu und pipetieren Sie die Zellen vorsichtig nach oben und unten, um Zellklumpen aufzubrechen. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen und fügen Sie 3-5 ml Medien hinzu.
7. Um die Zellzahl zu messen, mischen Sie 10 μL Zellen mit 10 μL Trypanblau und übertragen Sie 10 μL auf das Hämozytometer oder verwenden Sie eine andere Zellzählmethode.
8. Die Zellen auf die empfohlene Zelldichte verdünnen und 500 μL/Well in 24-Well-TC-Platten geben (Tabelle 1). Für endogene Assays (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 und PRMT9) fahren Sie mit Schritt 3.1 fort.

2. Zelltransfektion

1. Für exogene Assays (PRMT3, PRMT6, PRMT8) transfizieren Sie HEK293T-Zellen mit der empfohlenen Menge an DNA (Tabelle 2). HEK293T-Zellen sind leicht zu transfizieren, so dass jedes Transfektionsreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet werden kann.

3. Compound-Behandlung

HINWEIS: Überschreiten Sie nicht die endgültige Konzentration von Dimethylsulfoxid (DMSO) von 0,1% in Nährmedien. Halten Sie die gleiche DMSO-Konzentration in jeder Vertiefung. Die selektiven PRMT-Inhibitoren (chemische Sonden) und ihre eng verwandten inaktiven Analoga finden sich in Tabelle 3.

1. Für endogene Assays (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 und PRMT9) entfernen Sie Medien aus Zellen und ersetzen Sie sie durch 500 μL Medien mit Verbindung oder DMSO allein (Kontrolle).
   HINWEIS: Es dauert normalerweise 2 Tage, um eine Abnahme der R-Methylierungswerte um über 80% zu beobachten.
2. Für exogene Assays (PRMT3, PRMT6, PRMT8) entfernen Sie die Medien 4 h nach der Transfektion, fügen Sie 500 μL Medien mit Verbindung oder DMSO allein hinzu (Kontrolle) und inkubieren Sie sie für 20-24 h.

4. Zelllysat-Zubereitung

1. Entfernen Sie alle Medien aus den Vertiefungen, waschen Sie sie mit 100 μL PBS, um Restmedien zu entfernen, und fügen Sie 60 μL Lysepuffer (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 10 mM MgCl_2,0,5% Triton X-100, 12,5 U ml−1 Benzonase, kompletter EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail) zu jeder Vertiefung hinzu.
   1. Inkubieren Sie für weniger als 1 Minute bei RT und schaukeln Sie die Platte, um den Lysepuffer über die Zellen zu verteilen. Dann 3 μL 20% w/v Natriumdodecylsulfat (SDS) zu einer Endkonzentration von 1 % hinzufügen und durch sanftes Schütteln mischen. Lysat in Mikrozentrifugenröhrchen überführen und auf Eis halten.
      HINWEIS: Fügen Sie Benzonase und Proteinhemmer-Cocktail frisch vor dem Gebrauch hinzu. Die Zugabe von Benzonase hydrolysiert schnell Nukleinsäuren, was die Zelllysatviskosität reduziert.
2. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der Proben mit dem BCA Protein Assay Kit oder verwenden Sie eine andere Methode, die 1% SDS in Lösung toleriert.
   1. Fügen Sie 2 μL Lysat- und Proteinstandards (0, 1, 2, 4 und 8 μg/ml BSA im Lysepuffer) in die Vertiefungen der 96-Well-Klarplatte hinzu.
   2. Mischen Sie Reagenz A mit Reagenz B im Verhältnis 50:1 und fügen Sie 200 μL pro Vertiefung hinzu. 20 min bei 37 °C inkubieren und die Absorption ablesen.
3. Stellen Sie die Proteinkonzentration mit dem Lysepuffer so ein, dass sie in den Proben gleich ist.
4. 20 μL 4x Loading Buffer zu 60 μL Zelllysat geben und bei 95 °C für 5 min erhitzen. Nach der Wärmedenaturierung können die Lysate bei -20 °C gelagert werden.

5. Western-Blot-Analyse

1. Laden Sie 5-20 μg Gesamtzelllysat für die Analyse von Histonproteinen und 20-100 μg für andere Proteine in ein 4-12% Bis-Tris Proteingel.
2. Führen Sie das Gel in MOPS SDS-Laufpuffer (50 mM MOPS, 50 mM Tris Base, 0,1% SDS w/v, 1 mM EDTA, pH 7,7) für ca. 2 h bei 100 V oder bis die Farbstofffront den Boden des Gels erreicht.
3. Wenn Sie einen Nasstransfer durchführen, montieren Sie das Transfersandwich in eiskaltem Tris-Glycin-Transferpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% v / v Methanol und 0,05% w / v SDS).
   1. Legen Sie Schwämme, Filterpapier, PVDF-Membran und Gel gemäß den Anweisungen des Herstellers ein. Aktivieren Sie die PVDF-Membran, indem Sie Methanol einweichen und das Gel vor der Montage 30 s lang im Transferpuffer ausgleichen.
      HINWEIS: Verwenden Sie die empfohlene PVDF-Western-Blotting-Membran, da sie eine geringe Autofluoreszenz und Eignung für Proteine mit niedrigem Molekulargewicht wie Histone aufweist (Materialtabelle).
4. Übertragen Sie Proteine aus dem Gel auf die PVDF-Membran in Tris-Glycin-Transferpuffer bei 70 V für 1,5 h auf Eis.
5. Blockmembran für 30 min im Blockierpuffer (5% mit Milch in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, PBS). Mit Waschpuffer (PBST: 0,1% v/v Tween-20 in PBS) abspülen und mit primären Antikörpern in Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung (5% BSA in PBST) über Nacht bei 4 °C inkubieren(Tabelle 3).
   HINWEIS: Für eine längere Lagerung, filtersterilisieren Sie BSA-Lösung, fügen Sie 0,02% w / v Natriumazid hinzu und halten Sie bei 4 ° C.
6. Membran 3 x 5 min mit PBST waschen. Dann mit Ziegen-Anti-Kaninchen (IR800) und Esel Anti-Maus (IR680) Antikörpern in empfohlenen Blockierungspuffern (Materialtabelle, Tabelle 3) für 30 min bei RT inkubieren und 3 x 5 min mit PBST waschen.
7. Lesen Sie das Signal auf einem fluoreszierenden Western Blot Imager bei 800 und 700 nm. Vorzugsweise verwenden Sie das Instrument, das es ermöglicht, starke und schwache Bänder klar in einem einzigen Bild mit hoher Empfindlichkeit und Dynamikumfang, hohem Signal-Rausch-Verhältnis, einer Warnung bei Erreichen einer Bildsättigung sowie dem Multiplexing von zwei fluoreszierenden Farben im selben Probenband abbilden zu können.
8. Bestimmen Sie die Banddicken für die Western-Blot-Analyse mit geeigneter Software für die fluoreszierende westliche Bildgebung.

Ergebnisse

Beispiele für Western-Blot-Ergebnisse für zelluläre Assays einzelner PRMTs sind unten dargestellt. Einzelheiten zu den Assays sind auch in Tabelle 4zusammengefasst.

PRMT1-Assay
PRMT1 ist der Hauptbeitrag zur asymmetrischen Dimethylierung von Histon-4-Arginin-3 (H4R3me2a) in Zellen¹³. Bei Verlust der PRMT1-Aktivität steigen die globalen Rme1- und Rme2s-Werte signifikant^{an 13}. Wie in Abbildung 1A und 1Bgezeigt, können mehrere Antikörper verwendet werden, um globale Veränderungen in Rme1, Rme2a, Rme2s sowie H4R3me2a zu überwachen. Eine signifikante Abnahme der globalen Rme2a- und H4R3me2a-Spiegel und ein Anstieg der Rme1- und Rme2s-Spiegel können nach 3 Tagen PRMT1-Knockdown beobachtet werden (Abbildung 1A, B). Zelllinien unterscheiden sich im basalen H4R3me2a-Signal, daher können zelllinien wie MCF7 mit hohen Basalmethylierungsgraden verwendet werden, um die Überwachung des Verlustes der PRMT1-Aktivität zu erleichtern (Abbildung 1C). Der optimale Zeitpunkt, um die Wirkung der PRMT1-Hemmung zu beobachten, z.B. bei Behandlung mit Typ I PRMT-Inhibitor MS023^8,beträgt 2 Tage (Abbildung 1D,1E). Eine längere Behandlung führt zu einer verminderten Zelllebensfähigkeit und einem reduzierten Wachstum.

PRMT3-Assay
Für den PRMT3-Zellassay konnten keine selektiven Biomarkerproteine nachgewiesen werden, deren Methylierungsänderungen im Western Blot bei PRMT3-Knockdown oder Überexpression nachgewiesen werden konnten. PRMT3 wurde gezeigt, um H4R3 in vitro¹⁴asymmetrisch zu dimethylieren, jedoch wird die Marke überwiegend durch PRMT1 abgeschieden, und daher wurde ein exogener Assay mit überexprimiertem PRMT3 entwickelt. In Übereinstimmung mit den In-vitro-Befunden führte die Überexpression von Wildtyp-PRMT3, aber nicht seiner katalytischen Mutante (E338Q) zu einem Anstieg der H4R3me2a-Spiegel (Abbildung 2A). HEK293T-Zellen wurden verwendet, da sie eine geringe Basalmethylierung dieser Marke aufweisen (Abbildung 1C). Der Assay wurde weiter mit dem PRMT3-selektiven Inhibitor SGC707⁷validiert, der die PRMT3-abhängige Asymmetrische H4R3-Methylierung hemmte (Abbildung 2B).

PRMT4-Assay
PRMT4 disymmetrisch dimethyliert BAF155 an Arginin 1064¹⁵. Da der Antikörper, der BAF165-R1064me2a nachweist, kommerziell erhältlich ist, kann die PRMT4-Aktivität in Zellen durch Western Blot überwacht werden, indem die Veränderungen der R1064me2a-Markierungswerte nachgewiesen werden. Der Verlust des PRMT4-Proteins oder die Hemmung der katalytischen Aktivität mit dem SELEKTIVEN PRMT4-Inhibitor TP-064¹⁰führt zu einer Abnahme der BAF165-R1064me2a-Spiegel (Abbildung 3). Eine 2-tägige Behandlung ist in der Regel ausreichend, um den größten Teil des Methylierungssignals zu entfernen.

PRMT5-Assay
PRMT5 ist für den Großteil der symmetrischen Dimethylierung des Proteins Arginin verantwortlich. Es wurde bereits berichtet, dass die verschiedenen SMN-Komplexproteine, einschließlich SmBB', PRMT5-Substrate^{sind 16}. Die PRMT5-Aktivität kann überwacht werden, indem Veränderungen der globalen Ebenen der symmetrischen Arginindimethylierung oder der symmetrischen Dimethylierung von SmBB-Proteinen untersucht werden. Der Knockdown von PRMT5, aber nicht PRMT1, 3, 4, 6 und 7 führt zu einer Abnahme der globalen Rme2s-Werte (Abbildung 4A). In den meisten Zelllinien unterdrückte die Behandlung von Zellen mit den PRMT5-selektiven Inhibitoren LLY-283¹¹ und GSK591 für 2-3 Tage den größten Teil des SmBB'Rme2s-Signals (Abbildung 4B). Die meisten Zellen reagieren empfindlich auf PRMT5-Hemmung, was bei längerer Inhibitor-Exposition zu einer Abnahme der Zellproliferation und des Zelltods führt.

PRMT6-Assay
Es wurde berichtet, dass PRMT6 den Hauptbeitrag zur asymmetrischen Dimethylierung von Histon H3 Arginin 2 (H3R2me2a) in Zellen^{17 leistet.} In HEK293T-Zellen reichte der PRMT6-Knockdown für 3 Tage nicht aus, um eine signifikante Abnahme der H3R2me2a-Spiegel zu beobachten. Die Überexpression von Wildtyp PRMT6, aber nicht seiner katalytischen Mutante (V86K/D88A), erhöht jedoch die Konzentrationen von H3R2me2a sowie H3R8me2a und H4R3me2a (Abbildung 5A). Es gibt mehrere Inhibitoren, die die PRMT6-Aktivität mit unterschiedlicher Potenz und Selektivität hemmen: selektiver, allosterischer PRMT6-Inhibitor SGC6870¹⁸, PRMT-Typ-I-Inhibitor MS023⁸und PRMT4/6-Inhibitor MS049⁹. All dies hemmte PRMT6-abhängiges H3R2 (Abbildung 5B) sowie H4R3- und H3R8-asymmetrische Dimethylierung (Daten nicht gezeigt).

PRMT7-Assay
PRMT7-Monomethylate Arginin 469 sowohl in konstitutiven als auch induzierbaren Formen von HSP70 (HSPA8 bzw. HSPA1/6)¹². Obwohl es keine handelsüblichen Antikörper gibt, die HSP70-R469me1-Spiegel nachweisen, kann die Markierung mit Pan-Monomethyl-Antikörpern nachgewiesen werden. Der Verlust des PRMT7-Proteins oder die Hemmung der katalytischen Aktivität mit dem SELEKTIVEN PRMT7-Inhibitor SGC3027¹²führt zu einem verringerten HSP70-R469me1-Spiegel (Abbildung 6A, B). SGC3027 ist ein zelldurchlässiges Prodrug, das in Zellen durch Reduktasen in den PRMT7-selektiven Inhibitor SGC8158 umgewandelt wird, daher kann die zelluläre Potenz zwischen den Zelllinien variieren. Mehrere Krebszelllinien exprimieren induzierbare HSP70-Isoformen in hohen Konzentrationen, und Methylierung kann aufgrund eines überlappenden unspezifischen Bandes nuklearen Ursprungs schwer zu erkennen sein (Abbildung 6C). Daher werden für den PRMT7-Zellassay Zelllinien empfohlen, die hauptsächlich HSPA8 wie C2C12 exprimieren, oder da HSP70 hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert ist, bestimmen HSP70-R469me1-Spiegel in der zytoplasmatischen Fraktion bevorzugter Zelllinien.

PRMT8-Assay
PRMT8 ist das einzige PRMT mit einem gewebebeschränkten Expressionsmuster - weitgehend im Gehirn exprimiert¹⁹. Es teilt 80% Sequenzähnlichkeit und hat eine ähnliche Substratpräferenz wie PRMT1¹⁹. Es unterscheidet sich von PRMT1 hauptsächlich am N-Terminus, wo die Myristoylierung zur Assoziation von PRMT8 mit der Plasmamembran^{20 führt.} Es wurde berichtet, dass PRMT8 zusammen mit PRMT1 das RNA-bindende Protein EWS²¹methyliert. Da die PRMT8-Aktivität in nicht-neuronalen Zelllinien gering ist und EWS auch durch PRMT1 methyliert werden kann, wurde ein Assay entwickelt, bei dem PMRT8 zusammen mit EWS in PRMT1-Knockdown-Zellen co-overexprimiert wird. Da PRMT1 ein essentielles Gen ist und sein langfristiger Verlust zum Zelltod führt, wurde ein induzierbares System verwendet, in dem PRMT1 3 Tage lang vor der Verwendung im PRMT8-Assay niedergeschlagen wird (Abbildung 7A). Die Co-Expression von Wildtyp-PRMT8, aber nicht katalytisch inaktiver Mutante (E185Q), führte zusammen mit EWS zu erhöhten Konzentrationen von asymmetrischer EWS-Dimethylierung (Abbildung 7B). Mehrere asymmetrische Dimethylarginin-Antikörper wurden getestet und die Methylierung wurde nur mit Asym25-Antikörper nachgewiesen. Der Assay wurde weiter mit einer selektiven chemischen PRMT-Sonde vom Typ I, MS023^8,validiert, die die PRMT8-abhängige asymmetrische Dimethylierung von exogenem EWS verringerte(Abbildung 7B). Obwohl MS023 bei der Hemmung von PRMT8 in In-vitro-Assays sehr wirksam ist, sind in Zellen hohe Konzentrationen von MS023 erforderlich, um eine Methylierungshemmung zu sehen²¹.

PRMT9-Assay
PRMT9 wurde gezeigt, um SAP145 symmetrisch an Arginin 508²²zu dimethylieren. Leider können keine handelsüblichen Antikörper die Markierung erkennen. Für den PRMT9-Assay wurden Antikörper verwendet, die freundlicherweise von Dr. Yanzhong Yang (Beckman Research Institute of City of Hope) geschenkt wurden. Bei Überexpressierung wird wildtyp, aber nicht R508K-Mutante SAP145 durch PRMT9 methyliert (Abbildung 8A). Der Assay wurde entwickelt, um die Konzentrationen von endogenem SAP145-R508me2s zu überwachen und wurde mit Compound X validiert, einem Prototyp eines PRMT9-Inhibitors (work in progress, noch nicht veröffentlicht), der PRMT9 in vitro mit nanomolarer Potenz stark hemmt. Verbindung X senkte die SAP145-R508me2s-Spiegel dosisabhängig (Abbildung 8B).

Abbildung 1. PRMT1 zellulärer Assay. (A) PRMT1-Knockdown führt zu einer Abnahme der globalen asymmetrischen Arginindimethylierung (Rme2a) und erhöhten Konzentrationen symmetrischer Arginindimethylierung (Rme2s) und Monomethylierung (Rme1). Die PRMT1-Knockdown-Effizienz wird in Panel B dargestellt. (B) PRMT1-Knockdown verringert die asymmetrische Dimethylierung von Histon H4R3 (H4R3me2a). (C) Die basalen H4R3me2a-Spiegel unterscheiden sich über verschiedene Zelllinien hinweg. (D) Typ I PRMT-Inhibitor MS023 senkt den H4R3me2a-Spiegel dosisabhängig. MCF7-Zellen wurden 2 Tage lang mit MS023 behandelt. (E) Die Grafik stellt die nichtlineare Anpassung der H4R3me2a-Signaltäten dar, normalisiert auf Gesamt histon H4. MS023 IC50 = 8,3 nM (n=1). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2. PRMT3 zellulärer Assay. (A) Die Überexpression der katalytischen Wildtyp-Mutante (WT), aber nicht der E338Q-Mutante von PRMT3 erhöht die H4R3me2a-Spiegel in HEK293T-Zellen. Die Zellen wurden 24 h lang mit FLAG-markiertem PRMT3 transfiziert. (B) PRMT3-selektiver Inhibitor, SGC707, verringert die ektopische PRMT3-abhängige Asymmetrische Demethylierung H4R3 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3. PRMT4 zellulärer Assay. (A) PRMT4-Knockdown führt zu einer Abnahme der asymmetrischen BAF155-R1064-Arginindimethylierung (HEK293T-Zellen). (B) PRMT4 selektiver Inhibitor, TP-064, senkt BAF155-R1064Rme2a Spiegel. HEK293T-Zellen wurden 2 Tage lang mit Compound behandelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4. PRMT5 zellulärer Assay. (A) PRMT5-Knockdown führt zu einer Abnahme der globalen symmetrischen Arginindimethylierungsspiegel (MCF7-Zellen). (B) PRMT5-selektive Inhibitoren GSK591 und LLY-283 verringern die symmetrische Arginindimethylierung von SmBB (grün), während die Gesamtwerte von SmBB' unverändert bleiben (rot). MCF7-Zellen wurden 2 Tage lang mit Verbindungen behandelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5. PRMT6 zellulärer Assay. (A) Die Überexpression von Wildtyp (WT), aber nicht V86K/D88A katalytisch mutiertem PRMT6 erhöht die H4R3me2a-, H3R2me2a- und H3R8me2a-Spiegel in HEK293T-Zellen. Die Zellen wurden mit FLAG-markiertem PRMT6 für 24 h transfiziert. (B) PRMT6 selektiver Inhibitor (SGC6870), PRMT Typ I Inhibitor (MS023) und PRMT4/6 Inhibitor (MS049) senken PRMT6 abhängige H3R2me2a Spiegel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6. PRMT7 zellulärer Assay. (A) PRMT7-Knockout führt zu einer Abnahme der HSP70-R469-Monomethylierung (HCT116-Zellen). (B) PRMT7 selektive Inhibitoren, SGC3027, verringert die HSP70-R469-Monomethylierung in C2C12-Zellen. Die Zellen wurden 2 Tage lang mit Verbindung behandelt. (C) Der Nachweis einer HSP70-R469-Methylierung von induzierbarem HSP70 (HSPA1/6) mit Panmonomethyl arginin-Antikörpern (Rme1) kann aufgrund eines überlappenden unspezifischen Banden nuklearen Ursprungs schwierig sein. Es wird empfohlen, die HSP70-Methylierungswerte in der zytoplasmatischen Fraktion zu messen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7. PRMT8 zellulärer Assay. (A) PRMT8-Methylierung von EWS kann nachgewiesen werden, wenn die PRMT1-Aktivität durch Knockdown gehemmt wird. HEK293T-Zellen wurden mit einem induzierbaren PRMT1-Knockdown-Vektor transduziert. Nach 3 Tagen Doxycyclin-Behandlung waren die PRMT1-Spiegel drastisch reduziert. (B) Wenn PRMT1 niedergeschlagen wird, wird exogenes EWS asymmetrisch durch überexprimierte Wildtyp-PRMT8, aber nicht durch katalytische Mutante (E185Q) von PRMT8 dimethyliert. Die Methylierung wird durch eine hohe Konzentration von PRMT-Typ-I-Inhibitor (MS023) verringert. HEK293T PRMT1KD-Zellen wurden mit FLAG-markierten PRMT8-Wildtyp- oder katalytischen Mutanten und GFP-markierten EWS kotransfiziert und 20 h lang mit MS023 behandelt.

Abbildung 8. PRMT9 zellulärer Assay. (A) Wildtyp, aber nicht R508K-Mutante SAP145 wird durch PRMT9 methyliert. HEK293T-Zellen wurden 1 Tag lang mit GFP-markiertem SAP145 transfiziert. (B) Der Prototyp des PRMT9-Inhibitors (Verbindung X) verringert die PRMT9-abhängige R508-symmetrische Dimethylierung von SAP145 dosisabhängig. HEK293T-Zellen wurden 2 Tage lang mit der Verbindung behandelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

PRMT	Zellen	Dichte pro ml
PRMT1	MCF7	1 x 105
PRMT3	HEK293T	2 x 105
PRMT4	HEK293T	1 x 105
PRMT5	MCF7	1 x 105
PRMT6	HEK293T	2 x 105
PRMT7	C2C12	1 x 105
PRMT8	HEK293T (PRMT1 KD)*	2 x 105
PRMT9	HEK293T	2 x 105
*Zellen 3 Tage vor der Beschichtung für den PRMT8-Assay mit Doxycyclin (2 μg/ml) behandeln

Tabelle 1. Zelltypen und Dichten, die für PRMT-Assays empfohlen werden.

PRMT	μg DNA/24-Well	Addgene #	Zusätzliche Hinweise
PRMT3	0,5 FLAG-PRMT3	164695
	oder 0,5 FLAG-PRMT3 (E338Q)	164696
PRMT6	0,5 FLAG-PRMT6	164697
	oder 0,5 FLAG-PRMT6 (V86K / D88A)	164698
PRMT8	0,05 EWS-GFP	164701
	0,45 PRMT8-FLAG	164699
	oder 0,45 PRMT8(E185Q)-FLAG	164700
PRMT9	0,05 SAP145-GFP	Na	Geschenk von Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope
	oder 0,05 SAP145-R508K-GFP
	0,45 leerer Vektor

Tabelle 2. Die für das Transfektionsexperiment empfohlene DNA-Konzentration.

PRMT	Antikörper	Chemische Sonde (Zellaktivität IC50)	Negativkontrolle
PRMT1	H4R3me2a (1:2000)	MS023 -PRMT Typ I	MS094
	Rme1 (1:1000)	(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 nM)
	Rme2s (1:2000)
	Rme2a (1:2000)
	Rme2a (ASYM24, 1:3000)
	Rme2a (ASYM25, 1:2000)
	H4 (1:2000)
	B-Aktin (1:500 )
PRMT3	H4 (1:2000)	SGC707 (IC50 = 91 nM)	XY-1
	H4R3me2a (1:2000)
	FLAGGE (1:5000)
PRMT4	BAF155 (1:200)	TP-064 (IC50 = 43 nM)	TP064N
	BAF155-R1064me2a (1:3000)	SKI-73 (IC50 = 540 nM)*	SKI-73N*
PRMT5	anti-SmBB' (1:100)	LLY-283 (IC50 = 30 nM)	LLY-284
	Rme2s (#13222, 1:2000)	GSK591 (IC50 = 56 nM)	SGC2096
PRMT6	H4R3me2a (1:2000)	SGC6870 (IC50 = 0,9 μM)	SGC6870N
	H4 (1:2000)	MS023 -PRMT Typ I	MS094
	H3R2me2a ( 1:2000)	(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 nM)
	H3R8me2a (1:2000)	MS049 (PRMT 4, 6 IC50 = 970, 1400 nM)	MS049N
	H3 ( 1:5000)
	FLAGGE ( 1:5000)
PRMT7	Rme1 (1:1000)	SGC3027 (IC50 = 1300 nM) *	SGC3027N*
	Hsp/Hsc70 (1:2000)*
PRMT8	GFP (1:3000)	MS023 (50 μM)	MS094
	Rme2a (ASYM25,1:2000)
	FLAGGE (1:5000)
PRMT9	SAP145 (1:1000)
	SAP145-R508me2s -freundliches Geschenk von Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope (1:1000) (PIMID: 25737013)
Sekundäre Antikörper	Ziege-Anti-Kaninchen IgG-IR800 (1:5000)
	Esel Anti-Maus IgG-IR680 (1:5000)
*- Antikörper erkennt HSPA8, HSPA1 und HSPA6 (getestet mit überexprimierten GFP-markierten Proteinen), *prodrug – der IC50 kann sich zwischen verschiedenen Zelllinien unterscheiden

Tabelle 3. Empfohlene Antikörper und PRMT chemische Sonde / NegativkontrollwerkzeugVerbindungen.

PRMT

Biomarker

Assay-Auslesung

Assay-Validierung

Empfohlene Zelllinie

Schiri.

PRMT1

H4R3me2a, Rme1, Rme2s, Rme2a

H4R3me2a-Spiegel normalisiert auf die globalen H4-Rme1-, Rme2a- oder Rme2s-Werte, normalisiert auf B-Aktin.

Der Knockdown von PRMT1 verringerte die basalen H4R3me2a- und globalen Rme2a-Spiegel und erhöhte die globalen Rme1- und Rme2s-Spiegel in den Zellen (Abb.1A, B). Die PRMT Typ I chemische Sonde MS023 senkte die H4R3me2a-Spiegel dosisabhängig (Abb. 1D).

Die Zellen unterscheiden sich in basalen H4R3me2a-Spiegeln (Abb. 1C). MCF7-Zellen haben hohe basale H4R3me2a-Spiegel, was sie für Assays zur Überwachung der Abnahme der PRMT1-Aktivität vorzuziehen macht.

8

PRMT3

H4R3me2a

H4R3me2a-Methylierungswerte, die durch exogene FLAG-markierte PRMT3 WT- oder katalytische E338Q-Mutante (Hintergrund) verursacht werden, normalisiert auf Gesamthton H4

Die Überexpression von Wildtyp PRMT3, aber nicht seiner katalytischen Mutante (E338Q), erhöhte H4R3me2a (Abb. 2A). PRMT3-selektiver Inhibitor SGC707 verringerte PRMT3-abhängigen Anstieg der H4R3me2a-Spiegel (Abb. 2B)

HEK293T-Zellen haben niedrige basale H4R3me2a-Spiegel (Abb. 1C), was für die Überwachung der exogenen PRMT3-Aktivität bevorzugt ist

7

PRMT4

BAF155-R1064me2a

BAF155-R1064me2a-Werte normalisiert auf Gesamt-BAF155

PRMT4-Knockdown verringerte die asymmetrische Dimethylierung von BAF155 (Abb. 3A). Die 2-tägige Behandlung mit der selektiven chemischen Sonde PRMT4 (TP-064) verringerte die asymmetrische Dimethylierung von BAF155 (Abb. 3B).

Beliebige Zelllinie

10

PRMT5

SmBB'-Rme2s

SmBB'-Rme2s-Spiegel, die mit Pan-Rme2s-Antikörpern (CST) nachgewiesen wurden, normalisiert auf Gesamt-SmBB'

Der Knockdown von PRMT5 führte zu einer Abnahme der symmetrischen Dimethylierungswerte von SmBB (Abb. 4A). 2-tägige Behandlung mit PRMT5 selektiven chemischen Sonden, GSK591 und LLY285, verringerte SmBB'-Rme2s-Spiegel (Abb. 4B).

Beliebige Zelllinie

11

PRMT6

H4R3me2a H3R2me2a H3R8me2a

H4R3me2a-, H3R2me2a- oder H3R8me2a-Methylierungswerte werden durch exogene FLAG-markierte PRMT6 WT erhöht, jedoch nicht durch katalytische V86K,D88A-Mutante (Hintergrund), normalisiert auf Gesamthton H4 bzw. H3

Die Überexpression von Wildtyp PRMT6, aber nicht seiner katalytischen Mutante (V86K, D88A), erhöhte die H3R2me2a-, H3R8me2a- und H4R3me2a-Spiegel (Abb. 5A). Allosterischer PRMT6-Inhibitor (SGC6870), PRMT-Typ-I-Inhibitor MS023, PRMT4/6-Inhibitor MS049 verringerten den PRMT6-abhängigen Anstieg der H3R2me2a-Spiegel (Abb. 5B).

HEK293T-Zellen haben niedrige basale H4R3me2a-, H3R2me2a- und H3R8me2a-Spiegel, was für die Überwachung der exogenen PRMT6-Aktivität bevorzugt ist

8,9

PRMT7

HSP70-R469me1

HSP70-Rme1-Methylierungswerte normalisiert auf Gesamt-HSP70

PRMT7 Knockout oder Knockdown reduzierte die HSP70-Monomethylierung (Abb. 6A). Die 2-tägige Behandlung mit der selektiven chemischen PRMT7-Sonde SGC3027 verringerte die PRMT7-abhängige HSP70-Monomethylierung dosisabhängig (Abb. 6B).

C2C12, HT180 Mehrere Krebszelllinien exprimieren eine induzierbare Form von HSP70, deren Methylierungssignal sich mit einem unspezifischen Protein nuklearen Ursprungs überschneidet (Abb. 6C). In diesem Fall empfehlen wir die Analyse der HSP70-Methylierungswerte in der zytoplasmatischen Fraktion.

12

PRMT8

EWS-Rme2a

Exogene GFP-markierte EWS-Methylierungswerte, die durch exogene FLAG-markierte PRMT8 WT- oder E185Q-katalytische Mutante (Hintergrund) verursacht werden, normalisiert auf das Gesamt-GFP-Signal in PRMT1 KO-Zellen.

Überexpression des Wildtyps PRMT8, aber nicht katalytisch E185Q mutierte methyliertes ektopisches EWS nur in PRMT1 KD-Zellen (Abb. 7A). Die chemische Sonde MS023 vom Typ I PRMT hemmte die asymmetrische Dimethylierung von exogenem EWS durch PRMT8 (Abb. 8B).

HEK293T PRMT1 KD (induzierbar). PRMT1 Knockdown führt zum Zelltod, daher empfehlen wir die Verwendung eines induzierbaren Systems.

8

PRMT9

SAP145-R508me2s

PRMT9-abhängige SAP145-symmetrische Dimethylierung bei R508 normalisiert auf SAP145

Der Verlust PRMT9, aber nicht PRMT5, führte zu einer verminderten symmetrischen Dimethylierung von SAP145. GFP-getaggtes SAP145 WT, aber nicht SAP145mut (R508K) wurde durch PRMT9 methyliert (Abb. 8A). Die 2-tägige Behandlung mit Copound X, dem Prototyp des PRMT9-Inhibitors, verringerte den SAP145-R508me2s-Spiegel dosisabhängig Abb. 8B).

Beliebige Zelllinie

21

Tabelle 4. Zusammenfassung der PRMT-Assays.

Diskussion

Hier werden die detaillierten zellulären Assay-Protokolle für Mitglieder der PRMT-Familie beschrieben, die fluoreszierende Western-Blotting-Methoden verwenden. Es wurden einzigartige Substrate ausgewählt, bei denen die Veränderungen der Argininmethylierung bei individuellem PRMT-Verlust oder katalytischer Hemmung leicht nachgewiesen werden können und nicht von anderen Familienmitgliedern kompensiert werden können. Einige Proteine werden durch mehrere PRMTs^21,23methyliert, was auf eine Überlappung der Substratspezifität hindeutet, wobei einige PRMTs nur eine geringe Menge an zellulärer Markierung in einem bestimmten Proteinsubstrat^24,25 ,^26,27beitragen, zum Beispiel tragen sowohl PRMT8 als auch PRMT1 zur Methylierung von EWS bei. Daher erforderte jeder Assay eine gründliche Validierung von Substraten und Antikörpern mit Knockdown- und/oder Überexpressionsexperimenten und eine weitere Validierung mit gut charakterisierten selektiven Inhibitoren. ES WURDEN PRMT-spezifische Substrate identifiziert, für die Veränderungen der Methylierungsmark innerhalb von 2-3 Tagen nach PRMT-Verlust/-Hemmung nachgewiesen werden konnten, um Compoundierungseffekte einer verminderten Zelllebensfähigkeit und -proliferation zu vermeiden, die sich indirekt auf die Methyl-Arginin-Mark-Spiegel auswirken können. Obwohl es möglich war, einzigartige Substrate für PRMT1, 4, 5, 7 und 9 zu finden; für PRMT3, 6 und 8 musste der Funktionsgewinnansatz angewendet werden. Mehrere Argininmethyl-spezifische Antikörper wurden auf verschiedene zelluläre Ziele getestet, aber keiner konnte signifikante Veränderungen innerhalb von 3 Tagen nach dem PRMT3- und PRMT6-Knockdown nachweisen; Daher wurden Biomarker-Assays mit ektopisch exprimierten Enzymen zusammen mit katalytisch inaktiven Mutanten entwickelt, die als Kontrolle für die Basissubstratmethylierung dienten. PRMT8 ist ein nahes PRMT1-Homolog und teilt ähnliche Substratpräferenzen. Da ein SELEKTIVER PRMT8-Biomarker nicht identifiziert werden konnte, wurde ein Assay in PRMT1-Knockdown-Zellen entwickelt, bei dem PRMT8 zusammen mit EWS co-exprimiert wurde. PRMT1 ist auch ein wichtiges Enzym, das für die asymmetrische H4R3-Methylierung verantwortlich ist, daher wurden für die Verwendung von H4R3me2a als Biomarker für PRMT3- und PRMT6-Zellassays Zellen mit niedrigen basalen H4R3me2a-Spiegeln ausgewählt sowie katalytisch inaktive Mutanten als Hintergrundkontrolle verwendet. Obwohl endogene Assays bevorzugt werden, erweisen sich exogene Assays als unschätzbar wertvoll für die Prüfung der zellulären Potenz mehrerer selektiver PRMT-Inhibitoren^7,8,9. Mit wachsendem Wissen über prMT-Biologie erwarten wir, die Assays zu verbessern, indem wir spezifischere Biomarkerproteine für PRMT3, PRMT6 und PRMT8 finden.

Die Verwendung validierter Antikörper und geeigneter Kontrollen sind entscheidend für die Leistung des PRMT-Assays. Alle hier empfohlenen Antikörper wurden durch Knockdown- und Überexpressionsexperimente gründlich validiert, jedoch können Batch-to-Batch-Unterschiede, insbesondere bei polyklonalen Antikörpern, ihre Leistung immer noch beeinflussen. Daher ist es wichtig, genetische Methoden und chemische Sonden zusammen mit ihren eng verwandten Negativkontrollen zu verwenden, um die Zuverlässigkeit des Assays zu bestätigen. Darüber hinaus ist es für PRMT-Assays, die eine Proteinüberexpression erfordern, entscheidend, katalytisch inaktive Mutanten zusammen mit Wildtypprotein zu verwenden, um die basalen Methylierungsniveaus zu bestimmen.

Diese Sammlung quantitativer Assays zur Profilierung der Aktivität von PRMTs in Zellen kann für die wissenschaftliche Gemeinschaft von breitem Nutzen sein, da sie schnell und einfach mit minimaler Ausrüstung und begrenztem technischem Fachwissen implementiert werden kann, wobei nur grundlegende Zellkulturierungs- und fluoreszierende Western-Blotting-Techniken verwendet werden. Die empfohlenen Antikörper und chemischen Sonden für PRMTs können auch für aktivitätsbasierte Proteinprofilierungstests (ABPP) verwendet werden, um die Eignung einer bestimmten ABPP-Sonde zu ermitteln, das Zielengagement zu überwachen und Off-Target-Effekte unter Verwendung des konkurrierenden ABPP-Formats zu bewerten. Die hier diskutierten Assay-Entwicklungsansätze können auch auf andere Enzymfamilien wie Protein-Lysin-Methyltransferasen und Acetyltransferasen extrapoliert werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 cm TC-Schalen	Greiner bio-one	664160
24-Well-TC-Platten	Greiner bio-one	662160
4– 12% Bis-Tris Protein Gele	ThermoFisher Scientiffic NP0323BOX	, NP0322BOX,NP0321BOX
Amersham Hybond P PVDF Membran	Millipore-Sigma	10600021
anti-Asym 24	Millipore-Sigma	07-414
anti-Asym 25	Millipore-Sigma	09-814
anti-B-Aktin	Santa Cruz Biotechnologies	sc-47778
anti-BAF155	Santa Cruz Biotechnologies	sc-32763
anti-BAF155-R1064me2a	Millipore-Sigma	ABE1339
anti-FLAG (#, 1:5000)	Millipore-Sigma	F4799
anti-GFP	Clontech	632381
anti-H3	Abcam	ab10799
anti-H3R2me2a	Millipore-Sigma	04-848
Anti-H3R8me2a	Rockland	600-401-I67
Anti-H4	Abcam	ab174628
Anti-H4R3me2a	Active Motif	39705
Anti-Hsp/Hsc70	Enzo	ADI-SPA-820
Anti-PRMT1	Millipore-Sigma	07-404
Anti-PRMT3	Abcam	ab191562
Anti-PRMT4	Bethyl	#A300-421A
Anti-PRMT5	Abcam	ab109451
Anti-PRMT6	Abcam	ab47244
Anti-PRMT7	Abcam	ab179822
Anti-Rme1	CST	8015
Anti-Rme2a	CST	13522
Anti-Rme2s	CST	13222
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000)		09-814
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000)	Abcam	ab56800
anti-SAP145-R508me2s			freundliches Geschenk von Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope
anti-SmBB'	Santa Cruz Biotechnologies	sc-130670
benzonase			HERGESTELLT IM EIGENEN HAUS
	BSA Millipore-Sigma	A7906
C2C12			Geschenk von Dr. Stephane Richard, McGill University
cOmplete, EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail	Millipore-Sigma	11873580001
DMEM	Wisent	319-005-CL
DMSO	Bioshop	DMS666.100
Esel Anti-Maus IgG-IR680	Licor	926-68072
Doxycyclin	Millipore-Sigma	D9891
EDTA	Bioshop	EDT111.500
FBS	Wisent	80150
Glycin	Bioshop	GLN002.5
ziegen-anti-kaninchen IgG-IR800	Licor	926-32211
HEK293T			Geschenk von Dr. Sam Benchimol, York University
Image Studio Software ver 5.2	Licor
Ladepuffer: NuPAGE LDS Probenpuffer (4x)	ThermoFisher Scientiffic	NP0007
MCF7		ATCC® HTB-22&Handel;
NaCl	Bioshop	SOD001.1
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	ThermoFisher Scientiffic	NP0001
Odyssey Blocking Buffer (4 x mit PBST verdünnen)	Licor	927-40000	Intercept (PBS) Blocking Buffer kann auch verwendet werden # 927-70001
Odyssey CLX Imaging System	Licor	Modellnummer 9140
PBS (Gewebekultur)	Wisent	311-010-CL
PBS (Western Blot)	Bioshop	PBS405.4
Penstrep	Wisent	450-201-EL
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientiffic	23225
SDS	Bioshop	SDS001.1
Magermilchpulver	Bioshop	SKI400.500
TC20 automatisierter Zellzähler	Biorad	1450102
Tripsin-EDTA (0,25%)	Wisent	325-043-EL
Tris	Bioshop	TRS003.5
Tritton X-100	Bioshop	TRX506
trypanblau	GIBCO	15250-061
Tween-20	Bioshop	TWN510.500