Größenausschlusschromatographie zur Analyse der Heterogenität bakterieller äußerer Membranvesikel

Zusammenfassung

Bakterielle Vesikel spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese und haben vielversprechende biotechnologische Anwendungen. Die Heterogenität der Vesikel erschwert die Analyse und Verwendung; Daher ist eine einfache, reproduzierbare Methode zur Trennung unterschiedlicher Größen von Vesikeln erforderlich. Hier demonstrieren wir die Verwendung der Größenausschlusschromatographie zur Trennung heterogener Vesikel, die von Aggregatibacter actinomycetemcomitansproduziert werden.

Zusammenfassung

Die Zellwand gramnegativer Bakterien besteht aus einer inneren (zytoplasmatischen) und äußeren Membran (OM), die durch eine dünne Peptidoglykanschicht getrennt sind. Während des gesamten Wachstums kann die äußere Membran kugelförmige äußere Membranvesikel (OMVs) bilden. Diese OMVs sind an zahlreichen zellulären Funktionen beteiligt, einschließlich der Frachtabgabe an Wirtszellen und der Kommunikation mit Bakterienzellen. In jüngster Zeit wurde das therapeutische Potenzial von OMVs untersucht, einschließlich ihrer Verwendung als Impfstoffe und Arzneimittelverabreichungsvehikel. Obwohl OMVs vom OM abgeleitet sind, wird seit langem geschätzt, dass sich die Lipid- und Proteinladung der OMV oft deutlich von der der OM unterscheidet. In jüngerer Zeit wurden Beweise dafür entdeckt, dass Bakterien mehrere Arten von OMVs freisetzen können, und es gibt Hinweise darauf, dass die Größe den Mechanismus ihrer Aufnahme durch Wirtszellen beeinflussen kann. Studien in diesem Bereich sind jedoch durch Schwierigkeiten bei der effizienten Trennung der heterogen dimensionierten OMVs begrenzt. Zu diesem Zweck wurde traditionell die Dichtegradientenzentrifugation (DGC) verwendet; Diese Technik ist jedoch zeitaufwendig und schwer zu skalieren. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) hingegen ist weniger umständlich und eignet sich für das notwendige zukünftige Scale-up für den therapeutischen Einsatz von OMVs. Hier beschreiben wir einen SEC-Ansatz, der eine reproduzierbare Trennung von heterogen großen Vesikeln ermöglicht, wobei als Testfall OMVs von Aggregatibacter actinomycetemcomitanenverwendet werden, deren Durchmesser von weniger als 150 nm bis über 350 nm reicht. Wir demonstrieren die Trennung von "großen" (350 nm) OMVs und "kleinen" (<150 nm) OMVs, verifiziert durch dynamische Lichtstreuung (DLS). Wir empfehlen SEC-basierte Techniken gegenüber DGC-basierten Techniken zur Trennung von heterogen großen Vesikeln aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit, Reproduzierbarkeit (einschließlich Benutzer-zu-Benutzer) und der Möglichkeit des Scale-ups.

Einleitung

Gramnegative Bakterien setzen während des gesamten Wachstums Vesikel frei, die von ihrer äußeren Membran abgeleitet sind, sogenannte äußere Membranvesikel (OMVs). Diese OMVs spielen eine wichtige Rolle in der Zell-zu-Zell-Kommunikation, sowohl zwischen Bakterien und Wirt als auch zwischen Bakterienzellen, indem sie eine Reihe wichtiger Biomoleküle tragen, darunter DNA / RNA, Proteine, Lipide und Peptidoglykane^1,2. Insbesondere wurde die Rolle von OMVs bei der bakteriellen Pathogenese aufgrund ihrer Anreicherung in bestimmten Virulenzfaktoren und Toxinen^3,4 ,^....

Protokoll

1. Vorbereitung von Puffern

1. Um den ELISA-Waschpuffer vorzubereiten, fügen Sie 3,94 g Tris-Base, 8,77 g NaCl und 1 g Rinderserumalbumin (BSA) zu 1 L entionisiertem (DI) Wasser hinzu. Fügen Sie 500 μL Polysorbat-20 hinzu. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl oder NaOH auf 7,2 ein.
2. Um den Blockierungspuffer vorzubereiten, fügen Sie 3,94 g Tris-Base, 8,77 g NaCl und 10 g BSA hinzu. 500 μL Polysorbat-20 bis 1 L DI-Wasser hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl oder NaOH auf 7,2 ein.
3. Zur Herstellung des Elutionspuffers (PBS) werden 8,01 g NaCl, 2,7 g KCl, 1,42 g_Na2HPO4und 0,24 g_KH2PO₄ zu 1 L DI Wasser ....

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse dieser Methode. OMVs, die von A. actinomycetemcomitans Stamm JP2 produziert wurden, wurden zuerst aus dem Kulturüberstand mittels Ultrazentrifugation¹⁵gereinigt. Wir haben zuvor festgestellt, dass dieser Stamm zwei Populationen von OMVs produziert, eine mit Durchmessern von etwa 300 nm und eine mit Durchmessern von etwa 100 nm¹⁵. Um diese OMV-Populationen zu trennen, haben wir die Probe mit d.......

Diskussion

Hier haben wir ein Protokoll für die einfache, schnelle und reproduzierbare Trennung bakterieller OMV-Subpopulationen bereitgestellt. Obwohl die Technik relativ einfach ist, gibt es einige Schritte, die äußerst sorgfältig durchgeführt werden müssen, um sicherzustellen, dass eine effiziente Trennung in der Säule erfolgt. Zunächst ist es wichtig, dass das Gel vorsichtig und langsam in die Säule geladen wird, um Luftblasen zu vermeiden. Wir haben beobachtet, dass das Gel vor dem Laden der Säule mehrere Stunden bei Raumtempe.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1-Step Ultra TMB-ELISA	Thermo Scientific	34028
Amicon 50 kDa Filter	Millipore Sigma	UFC905024
Rinderserumalbumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9704-100
ELISA Immunoplatten	Thermo Scientific	442404
FM 4-64	Thermo Scientific	T13320	1,5 x 50 cm
Glas Econo-Säule	BioRad	7371552
Infinite 200 Pro Plate Reader	Tecan
Kaliumchlorid (KCl)	Amresco (VWR)	0395-500G
Kaliumphosphat Monobasisch wasserfrei (KH2PO4)	Amresco (VWR)	0781-500G
Sephacryl S-1000 Superfein	GE Gesundheitswesen	17-0476-01
Natriumchlorid (NaCl)	Fisher Chemical	S271-3
Natriumphosphat Dibasisches Wasserfreies (Na2HPO4)	Amresco (VWR)	0404-500G
Tris Base	VWR	0497-1KG
Tween(R) 20	Acros Organics	23336-2500