Summary

Größenausschlusschromatographie zur Analyse der Heterogenität bakterieller äußerer Membranvesikel

Published: March 31, 2021
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Summary

Bakterielle Vesikel spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese und haben vielversprechende biotechnologische Anwendungen. Die Heterogenität der Vesikel erschwert die Analyse und Verwendung; Daher ist eine einfache, reproduzierbare Methode zur Trennung unterschiedlicher Größen von Vesikeln erforderlich. Hier demonstrieren wir die Verwendung der Größenausschlusschromatographie zur Trennung heterogener Vesikel, die von Aggregatibacter actinomycetemcomitansproduziert werden.

Abstract

Die Zellwand gramnegativer Bakterien besteht aus einer inneren (zytoplasmatischen) und äußeren Membran (OM), die durch eine dünne Peptidoglykanschicht getrennt sind. Während des gesamten Wachstums kann die äußere Membran kugelförmige äußere Membranvesikel (OMVs) bilden. Diese OMVs sind an zahlreichen zellulären Funktionen beteiligt, einschließlich der Frachtabgabe an Wirtszellen und der Kommunikation mit Bakterienzellen. In jüngster Zeit wurde das therapeutische Potenzial von OMVs untersucht, einschließlich ihrer Verwendung als Impfstoffe und Arzneimittelverabreichungsvehikel. Obwohl OMVs vom OM abgeleitet sind, wird seit langem geschätzt, dass sich die Lipid- und Proteinladung der OMV oft deutlich von der der OM unterscheidet. In jüngerer Zeit wurden Beweise dafür entdeckt, dass Bakterien mehrere Arten von OMVs freisetzen können, und es gibt Hinweise darauf, dass die Größe den Mechanismus ihrer Aufnahme durch Wirtszellen beeinflussen kann. Studien in diesem Bereich sind jedoch durch Schwierigkeiten bei der effizienten Trennung der heterogen dimensionierten OMVs begrenzt. Zu diesem Zweck wurde traditionell die Dichtegradientenzentrifugation (DGC) verwendet; Diese Technik ist jedoch zeitaufwendig und schwer zu skalieren. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) hingegen ist weniger umständlich und eignet sich für das notwendige zukünftige Scale-up für den therapeutischen Einsatz von OMVs. Hier beschreiben wir einen SEC-Ansatz, der eine reproduzierbare Trennung von heterogen großen Vesikeln ermöglicht, wobei als Testfall OMVs von Aggregatibacter actinomycetemcomitanenverwendet werden, deren Durchmesser von weniger als 150 nm bis über 350 nm reicht. Wir demonstrieren die Trennung von “großen” (350 nm) OMVs und “kleinen” (<150 nm) OMVs, verifiziert durch dynamische Lichtstreuung (DLS). Wir empfehlen SEC-basierte Techniken gegenüber DGC-basierten Techniken zur Trennung von heterogen großen Vesikeln aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit, Reproduzierbarkeit (einschließlich Benutzer-zu-Benutzer) und der Möglichkeit des Scale-ups.

Introduction

Gramnegative Bakterien setzen während des gesamten Wachstums Vesikel frei, die von ihrer äußeren Membran abgeleitet sind, sogenannte äußere Membranvesikel (OMVs). Diese OMVs spielen eine wichtige Rolle in der Zell-zu-Zell-Kommunikation, sowohl zwischen Bakterien und Wirt als auch zwischen Bakterienzellen, indem sie eine Reihe wichtiger Biomoleküle tragen, darunter DNA / RNA, Proteine, Lipide und Peptidoglykane1,2. Insbesondere wurde die Rolle von OMVs bei der bakteriellen Pathogenese aufgrund ihrer Anreicherung in bestimmten Virulenzfaktoren und Toxinen3,4 ,5,6,7,8,9,10,11umfassend untersucht.

Es wurde berichtet, dass OMVs in der Größe von 20 bis 450 nm reichen, abhängig von den Elternbakterien und dem Wachstumsstadium, wobei mehrere Arten von Bakterien heterogene OMVsfreisetzen 8,12,13,14, die sich auch in ihrer Proteinzusammensetzung und ihrem Mechanismus des Wirtszelleintrittsunterscheiden 12. H. pylori gab OMVs mit einem Durchmesser von 20 bis 450 nm frei, wobei die kleineren OMVs eine homogenere Proteinzusammensetzung enthielten als die größeren OMVs. Wichtig ist, dass die beiden Populationen von OMVs von Wirtszellen über verschiedene Mechanismen internalisiert wurden12. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Aggregatibacter actinomycetemcomitans eine Population kleiner (350 nm) OMVs freisetzt, wobei die OMVs eine signifikante Menge eines sezernierten Proteintoxins, Leukotoxin (LtxA)15 enthalten. Während die Rolle der OMV-Heterogenität in zellulären Prozessen eindeutig wichtig ist, haben technische Schwierigkeiten bei der Trennung und Analyse verschiedener Populationen von Vesikeln diese Studien eingeschränkt.

Zusätzlich zu ihrer Bedeutung für die bakterielle Pathogenese wurden OMVs für den Einsatz in einer Reihe von biotechnologischen Anwendungen vorgeschlagen, darunter als Impfstoffe und Arzneimittelverabreichungsvehikel16,17,18,19,20. Für ihre translationale Verwendung in solchen Ansätzen ist eine saubere und monodisperse Herstellung von Vesikeln erforderlich. Daher sind effektive und effiziente Trennmethoden notwendig.

Am häufigsten wird die Dichtegradientenzentrifugation (DGC) verwendet, um heterogene Vesikelpopulationen von Zelltrümmern, einschließlich Flagellen und sezernierten Proteinen, zu trennen21; Die Methode wurde auch als Ansatz zur Trennung heterogen großer OMV-Subpopulationen12,13,14berichtet. DGC ist jedoch zeitaufwändig, ineffizient und sehr variabel von Benutzer zu Benutzer22 und daher nicht ideal für das Scale-up. Im Gegensatz dazu stellt die Größenausschlusschromatographie (SEC) einen skalierbaren, effizienten und konsistenten Ansatz zur Reinigung von OMVs21,23,24 dar. Wir haben festgestellt, dass eine lange (50 cm), Gravity-Flow, SEC-Säule, gefüllt mit Gelfiltrationsmedium, ausreicht, um Subpopulationen von OMVs effizient zu reinigen und zu trennen. Konkret haben wir diesen Ansatz verwendet, um A. actinomycetemcomitans OMVs in “große” und “kleine” Subpopulationen zu unterteilen sowie Protein- und DNA-Kontaminationen zu entfernen. Die Reinigung wurde in weniger als 4 Stunden abgeschlossen und die vollständige Trennung der OMV-Subpopulationen und die Entfernung von Trümmern wurde erreicht.

Protocol

1. Vorbereitung von Puffern Um den ELISA-Waschpuffer vorzubereiten, fügen Sie 3,94 g Tris-Base, 8,77 g NaCl und 1 g Rinderserumalbumin (BSA) zu 1 L entionisiertem (DI) Wasser hinzu. Fügen Sie 500 μL Polysorbat-20 hinzu. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl oder NaOH auf 7,2 ein. Um den Blockierungspuffer vorzubereiten, fügen Sie 3,94 g Tris-Base, 8,77 g NaCl und 10 g BSA hinzu. 500 μL Polysorbat-20 bis 1 L DI-Wasser hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl oder NaOH auf 7,2 ein. Zur Hers…

Representative Results

Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse dieser Methode. OMVs, die von A. actinomycetemcomitans Stamm JP2 produziert wurden, wurden zuerst aus dem Kulturüberstand mittels Ultrazentrifugation15gereinigt. Wir haben zuvor festgestellt, dass dieser Stamm zwei Populationen von OMVs produziert, eine mit Durchmessern von etwa 300 nm und eine mit Durchmessern von etwa 100 nm15. Um diese OMV-Populationen zu trennen, haben wir die Probe mit…

Discussion

Hier haben wir ein Protokoll für die einfache, schnelle und reproduzierbare Trennung bakterieller OMV-Subpopulationen bereitgestellt. Obwohl die Technik relativ einfach ist, gibt es einige Schritte, die äußerst sorgfältig durchgeführt werden müssen, um sicherzustellen, dass eine effiziente Trennung in der Säule erfolgt. Zunächst ist es wichtig, dass das Gel vorsichtig und langsam in die Säule geladen wird, um Luftblasen zu vermeiden. Wir haben beobachtet, dass das Gel vor dem Laden der Säule mehrere Stunden bei…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (1554417) und den National Institutes of Health (DE027769) finanziert.

Materials

1-Step Ultra TMB-ELISA Thermo Scientific 34028
Amicon 50 kDa filters Millipore Sigma UFC905024
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP9704-100
ELISA Immuno Plates Thermo Scientific 442404
FM 4-64 Thermo Scientific T13320 1.5 x 50 cm
Glass Econo-Column BioRad 7371552
Infinite 200 Pro Plate Reader Tecan
Potassium Chloride (KCl) Amresco (VWR) 0395-500G
Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4) Amresco (VWR) 0781-500G
Sephacryl S-1000 Superfine GE Healthcare 17-0476-01
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Chemical S271-3
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) Amresco (VWR) 0404-500G
Tris Base VWR 0497-1KG
Tween(R) 20 Acros Organics 23336-2500

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Diesen Artikel zitieren
Collins, S. M., Nice, J. B., Chang, E. H., Brown, A. C. Size Exclusion Chromatography to Analyze Bacterial Outer Membrane Vesicle Heterogeneity. J. Vis. Exp. (169), e62429, doi:10.3791/62429 (2021).

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