Methodenartikel

Verwendung des fluoreszierenden Farbstoffs Rhodamin B zur Untersuchung der Paarungswettbewerbsfähigkeit bei männlichen Aedes aegypti-Moskitos

DOI:

10.3791/62432

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7. Mai 2021

 ,  ,  , 
1Environmental Health Institute, National Environmental Agency

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Untersuchung der Paarungswettbewerbsfähigkeit von männlichen Aedes aegypti unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff als Marker. Weibliche Moskitos sind sowohl markierten als auch unmarkierten Männchen zur Kopulation ausgesetzt. Nach der Paarung werden ihre Spermatheken unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht, um ihren Paarungspartner zu bestimmen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Erfolg steriler oder inkompatibler insektentechnischer Populationsunterdrückungsprogramme hängt von der Fähigkeit der freigelassenen Männchen ab, um Wildtyp-Weibchen zu konkurrieren und Sterilität in der Zielpopulation zu induzieren. Daher ist die Laborbewertung der männlichen Paarungswettbewerbsfähigkeit unerlässlich, um die Fitness der Freisetzungssorte vor der Freisetzung zu bewerten. Herkömmlicherweise wird ein solcher Assay durchgeführt, indem der Anteil der lebensfähigen Eier bestimmt wird, die von den Weibchen produziert werden, nachdem sie gleichzeitig zwei Gruppen von Männchen (Wildtyp- und Freisetzungsstämme) zur Kopulation ausgesetzt wurden. Dieser Prozess ist jedoch zeitaufwendig und mühsam, da die Weibchen zuerst für die Eierproduktion mit Blut gefüttert und dann die geschlüpften Eier ausgeheckt und aufgezählt werden müssen, um die Lebensfähigkeit der Eier zu bestimmen.

Darüber hinaus kann diese Methode den Grad der Wettbewerbsfähigkeit zwischen zwei sterilen oder Wolbachia-infiziertenMückenlinien nicht erkennen, da wildartige weibliche Moskitos nur bei der Paarung mit beiden nicht lebensfähige Eier produzieren. Um diese Einschränkungen zu umgehen, beschreibt dieses Papier eine direktere Methode zur Messung der Paarungsfähigkeit männlicher Mücken in Laborumgebungen mit dem fluoreszierenden Farbstoff Rhodamin B (RhB), mit dem Männchen markiert werden können, indem sie in RhB-haltiger Saccharoselösung gefüttert werden. Nach dem Paarungstest kann das Vorhandensein von fluoreszierenden Spermien in den Spermatheken eines Weibchens verwendet werden, um ihren Paarungspartner zu bestimmen. Diese Methode ist kostengünstig, reduziert die Versuchszeit um 90% und ermöglicht den Vergleich der Paarungstauglichkeit zwischen zwei sterilen oder Wolbachia-infiziertenLinien.

Einleitung

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Die Aufzucht und Freisetzung steriler oder inkompatibler Männchen zur Unterdrückung von Aedes-Mückenpopulationen wird derzeit im Feld als neuartiges Instrument zur Verhinderung von Dengue-Ausbrüchen und anderen durch Aedes übertragenenKrankheiten evaluiert1. Männliche Freisetzungsunterdrückungsstrategien, die sich derzeit in Feldversuchen befinden, umfassen die Verwendung der genetischen Methode2, Bestrahlung (Sterile Insect Technique, SIT)3, endosymbiotische Bakterien Wolbachia (Insect Incompatible Technique, IIT) 4 oder eine Kombination derbeidenletzteren Techniken5,6. Der Erfolg dieser Ansätze hängt weitgehend von der Fähigkeit der freigelassenen Männchen ab, Wildtyp-Männchen zu übertreffen und Weibchen zu suchen, um die Kopulation zu sichern. Andernfalls kann die Sterilität in der Zielpopulation nicht induziert werden.

In einem klassischen SIT-Programm kann beispielsweise die männliche Paarungstauglichkeit durch Faktoren wie Bestrahlungsdosis7,8,9, Massenaufzuchtprotokoll und das Ausmaß der Inzucht in der Kolonie10 , 11,12,13,14beeinflusst werden. Darüber hinaus können Studien zur Paarungswettbewerbsfähigkeit wichtige Erkenntnisse über das Paarungsverhalten von Mücken liefern, die zur Information über Vektorkontrollstrategien verwendet werden könnten.

In SIT und IIT wird die Paarungswettbewerbsfähigkeit männlicher Moskitos typischerweise bewertet, indem sowohl Wildtyp-als auch Freisetzungsstämme ineinem Käfig 8, 11 ,15,16um Wildtypweibweibinnen konkurrieren können . Weibchen werden dann mit Blut gefüttert und ihre Eier geschlüpft, um die Lebensfähigkeit zu bestimmen. Es wird angenommen, dass Weibchen, die nicht lebensfähige Eier oder Eier mit niedriger Schlupfrate legen, sich mit Männchen des Freisetzungsstamms gepaart haben, während Weibchen, die lebensfähige Eier produzieren, sich vermutlich mit Wildtyp-Männchen gepaart haben. Die Paarungswettbewerbsfähigkeit wird dann mit dem Fried Index17berechnet. Leider ist diese Methode ressourcenintensiv und zeitaufwendig, und der gesamte Fried Index kann durch externe Störfaktoren beeinflusst werden, die die Lebensfähigkeit der Eier beeinflussen, wie schlechtes Eierhandling und Übermäßigetrocknung, die zu einer niedrigen Schlupfrate im Kompatibilitätskreuz führen kann, die dann zu einem künstlich niedrigen Fried Index führen kann.

Darüber hinaus erlaubt diese Methode keinen direkten Vergleich der Paarungswettbewerbsfähigkeit zwischen Aedes-Moskitos, die mit verschiedenen Wolbachia-Stämmen infiziert sind oder unterschiedlichen Bestrahlungsdosen ausgesetzt sind. Daher ist eine direktere Methode erforderlich, um diese Herausforderungen anzugehen. Jüngste Studien18,19 haben die Wirksamkeit der Verwendung des fluoreszierenden Farbstoffs RhB zur Markierung der Samenflüssigkeit männlicher Moskitos gezeigt. Markierte Samenflüssigkeit wird übertragen und nach erfolgreicher Paarung in den Spermatheken der weiblichen Moskitos gespeichert, was eine direkte Messung der weiblichen Paarungsinteraktion mit markierten Männchen ermöglicht. Rhodamin B ist ein Thiol-reaktiver Fluoronfarbstoff, der häufig als Biomarker für ökologische und verhaltenswissenschaftliche Studien an Tieren einschließlich Insekten verwendet wird20. Für Mückenstudien wird RhB durch Fütterung mit Zucker oder Honigwasser eingebracht, das gelöstes RhB-Pulver18,19,21,22,23,24 enthält. Bei der Aufnahme bindet der RhB-Farbstoff an Proteine und färbt das Körpergewebe mit einem rötlich-rosa Fleck, der unter einer fluoreszierenden Lichtquelle leuchtend orange fluoresziert.

Das starke Fluoreszenzsignal und die Stabilität der Markierung, gepaart mit ihrer Fähigkeit, Insekten-Samenflüssigkeiten zu färben, ermöglicht die Überwachung der Übertragung von markierter Samenflüssigkeit vom markierten Männchen zu den Spermienspeicherorganen des weiblichen Insekts für Paarungsstudien18,19,21,24. Die Verwendung von RhB in einem männlichen Paarungs-Wettbewerbstest ermöglicht nicht nur die direkte Messung der Paarungsinteraktion von Weibchen mit markierten und unmarkierten Männchen, sondern die Ergebnisse können auch innerhalb von 24 Stunden erzielt werden, da sie den Prozess der Bestimmung der Eilebensfähigkeit, der typischerweise etwa 10 bis 14 Tage dauert, entfällt. Darüber hinaus überwindet diese Methode den potenziellen Datenverlust, wenn die weiblichen Moskitos vor der Eiablage nicht bluten oder sterben. Dies ist besonders wichtig, da weibliche Moskitos bei Halbfeldversuchen anfällig für Schäden und Tod während der Nachpaarungssammlung mit einem Rucksack oder einem mechanischen Absauger sind. Um die derzeitigen Einschränkungen der Verwendung der weiblichen Fruchtbarkeit zu beheben, stellen wir eine alternative Methode vor, die RhB-Färbung verwendet, um die Paarungswettbewerbsfähigkeit männlicher Mücken direkt zu messen. Die Methode vereinfacht den Workflow, verkürzt die Experimentellenzeit von etwa zwei Wochen auf einen Tag, so dass mehr experimentelle Replikate durchgeführt werden können und ermöglicht den Vergleich zwischen zwei Freisetzungsstämmen. Dieses Protokoll eignet sich für Labore, die programme zur Unterdrückung der Mückenpopulation durch männliche Freisetzungen durchführen, und kann für die routinemäßige Qualitätskontrolle und Stammbewertung verwendet werden.

Protokoll

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1. Aufzucht von Moskitos

  1. Führen Sie die gesamte Mückenaufzucht und den männlichen Paarungswettbewerbstest unter Standard-Insektenbedingungen von 27 ± 1 ° C und 75-80% relativer Luftfeuchtigkeit mit einer Photoperiode von 12 h: 12 h hell: dunkel durch.
  2. Bezeichnen Sie die beiden Gruppen konkurrierender Männchen als Set A und Set B zur einfachen Referenz in der in diesem Artikel beschriebenen Methodik. Züchte die Moskitos unter standardisierten Bedingungen, um einen fairen Vergleich ihrer Fitness während des Assays zu gewährleisten. Züchtet die Mücken bei einer Larvendichte von 500 Larven in 2 L Wasser auf und füttert sie mit gemahlenem Fischfutterpulver ad libitum.
    HINWEIS: Für die Generierung der repräsentativen Ergebnisse waren Set A und Set B die Inzucht- und Outcross-Männchen der Wolbachia-infizierten Ae. Aegypti, jeweils.
  3. Männliche und weibliche Mücken im Puppenstadium werden getrennt in Käfigen (siehe Materialtabelle)der Maße B 32,5 cm x T 32,5 cm x H 32,5 cm mit einer Maschenöffnung von 150 x 150 und 160 μm Öffnung enthalten. Pflegen Sie alle erwachsenen Moskitos mit 10% Saccharoselösung.

2. Vorbereitung von männlichen und weiblichen Moskitos

  1. Geschlecht der männlichen und weiblichen Moskitos im Puppenstadium nach ihren Größenunterschieden (männliche Puppen sind kleiner als weibliche Puppen) (Abbildung 1).
  2. Für jeden Satz Moskitos (Set A oder Set B) werden jeweils 100 männliche Puppen in einen vormarkierten Käfig zur Saccharosefütterung oder RhB-Saccharosefütterung überführt.
  3. Legen Sie die weiblichen Puppen in kleine Chargen von 40-50 pro Käfig. Überprüfen Sie bei der Entstehung der Imagoes die Käfige auf das Vorhandensein männlicher Moskitos.
    HINWEIS: Erwachsene männliche Moskitos sind kleiner als Weibchen und haben buschigere und haarigere Antennen (Abbildung 2). Verwenden Sie nur jungfräuliche weibliche Moskitos für die Paarungswettbewerbsfähigkeitstests. Die Verwendung von vorbefruchteten Weibchen macht alle resultierenden Daten ungültig. Daher muss beim Sexing im Puppenstadium äußerste Vorsicht walten. Verwenden Sie die weiblichen Moskitos nicht aus einem Käfig, der mit männlichen Moskitos kontaminiert wurde. Zusätzliche Käfige von Weibchen sollten vorbereitet werden.

3. Herstellung von 0,2% RhB - Saccharoselösung

HINWEIS: RhB ist ein grünes Pulver in trockener Form und rötlich-rosa in Lösung. Beim Umgang mit dieser Chemikalie ist eine normale persönliche Schutzausrüstung (PSA: Laborschutzkleid, Nitrilhandschuhe und Augenschutz) zu tragen. Um ein Einatmen zu vermeiden, wiegen Sie das RhB-Pulver in einem Abzug.

  1. Zur Herstellung einer 0,2%igen RhB-Saccharoselösung werden 200 mg RhB-Pulver pro 100 ml 10%iger Saccharoselösung gelöst. Gut mischen, um sicherzustellen, dass das gesamte Pulver gelöst ist.
    HINWEIS: Da RhB lichtempfindlich ist, verwenden Sie bernsteinfarbene Flaschen oder wickeln Sie klare Flaschen vollständig mit Aluminiumfolie ein.

4. Fütterung von männlichen Moskitos

HINWEIS: Daten zur RhB-Saccharose-Fütterungsoptimierung sind in Supplemental Material, Abschnitt 1dargestellt.

  1. Bereiten Sie 20 Zuckerzufuhrflaschen mit einem Docht vor. Fügen Sie 10 mL 10% Saccharose in 10 Feederflaschen und 10 ml 0,2% RhB-Saccharoselösung in die anderen 10 Feederflaschen hinzu (verwenden Sie Bernsteinflaschen oder wickeln Sie die Flaschen in Aluminiumfolie).
  2. Legen Sie die Futterflaschen in die jeweiligen männlichen Käfige (5 Flaschen pro Käfig), die in den Schritten 2.2 und 2.3 vorbereitet wurden. Lassen Sie die männlichen Moskitos drei Tage vor dem Paarungsexperiment füttern.

5. Überprüfung auf RhB-Fluoreszenz bei männlichen Moskitos

  1. Aspiratieren Sie mit RhB-Saccharose gefütterte männliche Mücken und beobachten Sie sie unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass alle mit RhB-Saccharose gefütterten männlichen Mücken erfolgreich mit RhB markiert wurden.
  2. Schalten Sie die Quecksilberbrennerlampe und das Stereomikroskop ein. Lassen Sie die Lichtquelle der Quecksilberbrennerlampe für 10 minuten stabilisieren. Stellen Sie die Fluoreszenzfilter für rotes Fluoreszenzprotein 1 (RFP1) ein (Anregungswellenlänge 540 nm, Emissionswellenlänge 625 nm).
  3. Saugen Sie eine kleine Anzahl von Moskitos (vier oder fünf) gleichzeitig in die Glasröhre des oralen Absaugers ab. Beobachten Sie durch die Glasröhre den Körper der männlichen Moskitos unter dem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Männliche Mücken, die nicht mit RhB markiert sind, vom Experiment ausschließen.
    HINWEIS: Der Bauch männlicher Moskitos, die mit RhB markiert sind, erscheint unter weißem Licht rosa (Abbildung 3A) und leuchtet unter fluoreszierendem Licht hellorange (Abbildung 3B).
  4. Transfer Set A männliche Mücken in 12 Pappbecher, die mit Netz gesichert sind (Maschenweite 150 x 150, 160 μm Öffnung); 6 Tassen mit je 10 mit Saccharose gefütterten männlichen Mücken und die anderen 6 Tassen mit je 10 RhB-Saccharose-gefütterten männlichen Mücken. Wiederholen Sie diesen Schritt für männliche Moskitos des Satzes B.

6. Test der Paarungswettbewerbsfähigkeit

  1. 12 B 60 cm x T 60 cm x H 60 cm Käfige mit Maschenweite 44 x 32, 650 μm Öffnung für den Paarungsassay aufstellen. In jedem der sechs Käfige sind 10 männliche Mücken des Satzes A (RhB-markiert), 10 männliche Mücken des Satzes B (unmarkiert) und 10 jungfräuliche weibliche Wildtypmücken enthalten. In den anderen sechs Käfigen sind 10 Set A (unmarkierte) männliche Moskitos, 10 Set B (RhB-markierte) männliche Moskitos und 10 jungfräuliche weibliche Wildtypmücken. Beschriften Sie diese Käfige, um klar zwischen den beiden Paarungskombinationen zu unterscheiden.
    HINWEIS: Basierend auf erfahrungsgemäß wurde ein Käfig von 60 cm x 60 cm x 60 cm für den Paarungstest verwendet, da ein kleinerer Käfig die gemischte Paarung fördern kann.
  2. Legen Sie die jeweiligen Becher von Männchen, die in Schritt 5.4 vorbereitet wurden, in die Paarungskäfige gemäß dem Etikett in Schritt 6.1. Entfernen Sie das Netz und klopfen Sie vorsichtig auf die Tasse, um die Männchen aus der Tasse zu drängeln. Entfernen Sie vorsichtig den Pappbecher und das Netz aus dem Käfig, um sicherzustellen, dass keine Moskitos aus dem Käfig entweichen. Lassen Sie die männlichen Moskitos mindestens eine Stunde lang im Paarungskäfig akklimatisieren.
  3. Übertragen Sie mit einem oralen Aspirator jungfräuliche weibliche Wildtypmücken in 12 Pappbecher, wobei jede Tasse 10 Moskitos enthält.
  4. Nach der Akklimatisierungszeit für die männlichen Moskitos eine Tasse Weibchen in jeden Paarungskäfig geben und das Netz entfernen. Drängeln Sie die Tasse vorsichtig, um alle verbleibenden weiblichen Moskitos aus der Tasse zu ermutigen. Entfernen Sie vorsichtig den Pappbecher und das Netz aus dem Käfig, um sicherzustellen, dass keine Moskitos aus dem Käfig entweichen.
  5. Lassen Sie die Paarung für 3 Stunden stattfinden.
    HINWEIS: Die empfohlene Paarungsdauer wurde durch vorherige Beobachtungen von Wildtyp Ae. aegyptibestimmt. In Experimenten mit 10 Weibchen und 20 Männchen, die in einem 60 cm x 60 cm x 60 cm großen Käfig gehalten wurden, wurde eine weibliche Besamung von 90% in 3 h erreicht (Ergänzungsmaterial, Abschnitt 2). Stören Sie den Käfig während dieser Zeit nicht, da Unruhe zu einer unterbrochenen und gemischten Paarung führen kann. Die Mischpaarung (bei der sich das Weibchen sowohl mit markierten als auch mit unmarkierten Männchen gepaart hat) führt zu einer Verzerrung gegenüber RhB-markierten Männchen, da es schwierig ist, unmarkierte Spermien von RhB-markierten Spermien unter einem Fluoreszenzmikroskop zu unterscheiden.
  6. Um das Paarungsexperiment zu beenden, entfernen Sie alle Moskitos aus jedem Käfig mit einem mechanischen Absauger. Kalt betäuben Sie die Moskitos auf Eis für mindestens 5 min. Wenn die Moskitos vollständig betäubt sind, nehmen Sie die weiblichen Moskitos vorsichtig auf und beherbergen Sie sie in einem separaten Pappbecher, der mit Netzen gesichert ist (Maschenweite 150 x 150, 160 μm Öffnung). Beschriften Sie den Pappbecher, indem Sie das entsprechende Etikett aus dem Steckkäfig auf den Pappbecher übertragen.
    HINWEIS: Es ist möglich, das Experiment an dieser Stelle zu pausieren und die Weibchen mit 10% iger Saccharoselösung zu halten. Die RhB-markierte Samenflüssigkeit bleibt in den weiblichen Spermathekanen mindestens eine Woche lang stabil. Es ist am besten, die Weibchen vor der Sezierung am Leben zu erhalten, da tote und ausgetrocknete Exemplare schwer zu sezieren sind.
  7. Um die weiblichen Spermatheken zu bewerten, betäuben Sie die weiblichen Moskitos mindestens 5 Minuten lang kalt auf Eis, bevor Sie unter einem Stereomikroskop sezieren (Video 1). Untersuchen Sie die Spermatheka unter einem zusammengesetzten Lichtmikroskop (Vergrößerung 100x) auf ihren Besamungsstatus (Abbildung 4). Bestimmen Sie bei befruchteten Personen, ob die Spermatheken RhB-markierte Samenflüssigkeit enthalten, indem Sie sie unter dem Fluoreszenz-Stereomikroskop untersuchen, das mit einem RFP1-Filter und einem Kamerabildgebungssystem ausgestattet ist.
    HINWEIS: Bei Verwendung eines Fluoreszenz-Stereomikroskops mit angeschlossenem Bildgebungssystem wird empfohlen, eine längere Belichtungszeit (5 s) zu verwenden, um die Erkennungsempfindlichkeit zu erhöhen. Wenn sich die weibliche Mücke mit einem markierten Männchen gepaart hat, fluoreszieren ihre Spermatheken leuchtend orange (Abbildung 5A). Wenn sich die weibliche Mücke jedoch mit einem unmarkierten Männchen gepaart hat, fluoreszieren ihre befruchteten Spermatheken nicht (Abbildung 5B).

7. Entsorgung von RhB-Abfällen

  1. Wässrige RhB-Abfälle mit Aktivkohle25 behandeln, bevor sie als allgemeines Abwasser abgelassen werden. Feste RhB-Abfälle (mit RhB gekennzeichnete Mücken, Papierhandtücher und mit RhB getränkte Dochte) entsorgen als chemische Abfälle. Verwenden Sie Standard-PSA beim Umgang mit RhB-Abfällen.

Ergebnisse

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w AlbB-SG ist eine lokalisierte (Singapur) Ae. aegypti-Linie, die stabil mit dem wAlbB-Stamm von Wolbachia infiziert ist. Unter Verwendung des in diesem Artikel beschriebenen Protokolls bewerteten wir die männliche Paarungswettbewerbsfähigkeit einer Inzucht und einer durchkreuzten Linie von wAlbB-SG, um festzustellen, ob Inzucht zu einem Verlust der männlichen Paarungstauglichkeit führt. Die Inzuchtlinie wurde seit 11 Generationen im Insektär beibehalten, während die auskreuzte Linie durch Rückkreuzung der Weibchen mit Wildtyp-Männchen Ae erzeugt wurde. aegypti. Männchen aus den inzuchtierten und ausgekreuzten Linien wurden gegeneinander um die Paarung mit Wildtyp-Wildtyp-Weibchen Ae. aegyptikonkurriert. Der Test der Paarungswettbewerbsfähigkeit wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.

Die Ergebnisse zeigten, dass rhB die Fitness der Männchen nicht beeinflusste, da die Daten für die weibliche Besamung nicht auf oder gegen die Paarung mit RhB-Saccharose-gefütterten Männchen verzerrt waren (Tabelle 1 und Abbildung 6) Da die RhB die Paarungstauglichkeit der Männchen nicht beeinflusst, analysieren wir die Daten auf der Grundlage des Prozentsatzes der befruchteten Weibchen, die entweder durch die inzuchtierte oder durchkreuzte Linie gepaart wurden (Tabelle 2 und Abbildung 7). Die Ergebnisse über die experimentellen Triplikate hinweg waren konsistent; es gab einen signifikant höheren Prozentsatz von Weibchen, die mit den Outcross-Männchen gepaart waren als mit den Inzuchtmänneln in allen drei Replikaten (P ≤ 0,05, Mann-Whitney U-Test). Diese Ergebnisse deuten auf einen möglichen Verlust der männlichen Paarungsfitness nach mehreren Generationen der Inzucht im Labor hin.

Mückenlarven, Männchen vs. Weibchen, Diagramm zeigt das Stadium der aquatischen Larven, morphologischen Unterschied.
Abbildung 1: Seitenansicht der männlichen (links) und weiblichen (rechts) Puppen von Aedes aegypti. Unter den gleichen Aufzuchtbedingungen kann Ae. aegypti im Puppenstadium je nach Größe gesext werden; Männchen sind deutlich kleiner als Weibchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Vergleich der Mückenidentifikation, Diagramm mit roten Pfeilen, die Unterscheidungsmerkmale markieren.
Abbildung 2: Differenzierung von männlichen (links) und weiblichen (rechts) Aedes aegypti Erwachsenen. Erwachsene männliche Moskitos (links) haben buschigere und haarigere Antennen als das erwachsene Weibchen; die roten Pfeile zeigen die Antennen an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Vergleich der Fluoreszenz von Mücken; natürlich vs. unter UV-Strahlung modifiziert; Mikroskopie-Bild; genetische Studie.
Abbildung 3: Rhodamin-B-Markierung der männlichen Mücke. (A) Lichtmikroskopie; (B) Fluoreszenzmikroskopie. Die Mücke links ist unmarkiert (gefüttert mit 10% w/v Saccharose), während die rechte markiert ist (gefüttert mit 0,2% RhB-Saccharose). Markierte Moskitos haben einen sichtbaren rosa Bauch unter weißem Licht (die Mücke rechts in A),der unter Fluoreszenzmikroskopie leuchtend orange fluoresziert (B). Maßstabsbalken = 5 mm. Abkürzung: RhB = Rhodamin B. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Mikroskopische Aufnahme von befruchteten und nicht befruchteten Zellen für die Befruchtungsanalyse, 100 μm Maßstab.
Abbildung 4: Befruchtte und nicht befruchtete weibliche Spermatheka unter einem zusammengesetzten Lichtmikroskop (100-fache Vergrößerung). Der Besamungsstatus einer weiblichen Mücke kann durch Beobachtung ihrer Spermatheken unter einem zusammengesetzten Lichtmikroskop bestimmt werden. Eine befruchtete weibliche Mücke enthält mindestens eine gefüllte Spermatheka, während alle drei Spermatheka einer nicht befruchteten weiblichen Mücke leer sind. Fadenartige, bewegliche Spermien werden in einer gefüllten Spermatheca unter einem zusammengesetzten Lichtmikroskop sichtbar sein. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Mikroskopische Aufnahme von Zellclustern unter sichtbarem Licht, 100 Mikrometer Maßstab, biologische Untersuchung.
Abbildung 5: Weibliche Mückenspertheken, die mit Samenflüssigkeiten unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop befruchtet werden. (A) RhB-markierte und (B) unmarkierte Spermatheken, die mit RhB-markierten Samenflüssigkeiten befruchtet werden, fluoreszieren unter Fluoreszenzmikroskopie leuchtend orange. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Studie zur Paarung von Mücken; männlicher Einfluss auf den Paarungserfolg; Vergleichende Datenanalyse, Diagramm.
Abbildung 6: Anzahl der Wildtyp-Weibchen, die entweder von den Inzucht- oder Outcross-Männchen in den experimentellen Triplikaten mit gegenseitiger Markierung befruchtet wurden. (A) Die Inzuchtmännchen wurden mit RhB markiert, während die Auskreuzungsmännchen nicht markiert waren. (B) Die Auskreuzungsmännchen waren mit RhB markiert, während die Inzuchtmännchen unmarkiert waren. Es wurde beobachtet, dass sich eine höhere Anzahl von Weibchen mit auskreuzenden Männchen gepaart hat, unabhängig von ihrem Markierungsstatus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Erfolgsdiagramm für die Mückenpaarung; Inzucht vs. Outcross; Das Balkendiagramm zeigt den Prozentsatz der verpaarten Weibchen pro Replikat.
Abbildung 7: Anteil der befruchteten Weibchen, die mit inzuchtierten oder auskreuzten Männchen in den 3 experimentellen Replikaten gepaart wurden. Für jedes experimentelle Replikat gibt es einen signifikant höheren Prozentsatz von Weibchen, die mit den Outcross-Männchen gepaart sind (P ≤ 0,05, Mann-Whitney U-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: Dissektion von weiblichen Aedes aegypti für Spermatheken unter einem lichten Stereomikroskop. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen. 

♀ x Inzucht (RhB) ♂ a ♀ x Auskreuzung (unmarkiert) ♂ b ♀ x Inzucht (unmarkiert) ♂ c ♀ x Outcross (RhB) ♂ d Gesamtinseminationsrate
(a+b+c+d/120)
Replizieren 1113574077.5% (93/120)
Replizieren 262983161.7% (74/120)
Replizieren 363663367.5% (81/120)

Tabelle 1: Anzahl der Weibchen, die mit RhB-markierten und nicht markierten Weibchen mitAlbB-Sg Aedes aegypti inzucht und outcross Männchen gepaart sind. In jedem Replikat wurden insgesamt 120 Weibchen verwendet.

Prozentualer Anteil befruchteter Frauen
Inzuchtmännliche MännchenMännchen auskreuzen
Replizieren 119% (18/93)81% (75/93)
Replizieren 219% (14/74)81% (60/74)
Replizieren 315% (12/81)85% (69/81)

Tabelle 2: Prozentsatz der befruchteten Weibchen, die mit wAlbB-Sg Aedes aegypti inzuchtierten und auskreuzten Männchen gepaart wurden.

Ergänzende Abbildung S1: Vergleich des Workflows für RhB-basierten und konventionellen Paarungswettbewerbsfähigkeitstest. Im Vergleich zum herkömmlichen Paarungs-Competitiveness-Assay reduziert der vereinfachte und verkürzte Workflow für den RhB-basierten Paarungs-Competitiveness-Assay die Versuchsdauer deutlich. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Kaplan Meier Überlebenskurven des männlichen erwachsenen Aedes aegypti während und nach der Fütterung mit 0,2% und 0,4% Rhodamin B-Saccharosefütterung. Prozentuales Überleben von (A) männlichem Wildtyp und (B) wAlbB-Sg Ae. aegypti während und nach drei Tagen der Fütterung mit 0,2% und 0,4% RhB-Saccharose, verglichen mit Kontrollen, die nur mit Saccharose gefüttert wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatztabelle S1: Besamungsrate von Weibchen in einem B 60 cm x T 60 cm x H 60 cm (Verhältnis von 10 Weibchen zu 20 Männchen) zu 1-, 2- und 3-h-Zeitpunkten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen. 

Diskussion

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Markierung wird häufig in der entomologischen Forschung verwendet, um die Dynamik, Ausbreitung, das Verhalten und die Paarungsbiologie von Insektenpopulationen zu untersuchen26. In SIT- und IIT-Programmen wird die Markierung durchgeführt, um den Freisetzungsstamm von der Feldpopulation zu unterscheiden, ihre Ausbreitung zu untersuchen und das Freisetzungsverhältnis zu optimieren. Die verwendeten Markierungsmethoden umfassen die genetische Markierung27,28, die Isotope in Larvenfutter29,30, fluoreszierendem Staub31und Farbstoff32. Zur Unterdrückung von Mückenpopulationen mit SIT oder IIT, bei denen die männliche Paarungsfitness eine kritische Komponente ist, wurden fluoreszierende Farbstoffe als Marker verwendet, um die Paarungsbiologie von Moskitos zu untersuchen18,19.

Herkömmlicherweise wurde die Beurteilung der männlichen Paarungswettbewerbsfähigkeit des Freisetzungsstamms mit weiblichen Fruchtbarkeitstests bewertet. Dieser Assay ist jedoch aufgrund nachgelagerter experimenteller Prozesse nach der Paarung zeit- und arbeitsintensiv (Ergänzende Abbildung S1). Diese Prozesse umfassen die Blutfütterung der Weibchen, die Eizellentnahme, das Schlüpfen der Eier und die Aufzählung des Anteils der geschlüpften Eier, um die Lebensfähigkeit der Eier zu bestimmen. Im Durchschnitt erfordert dieser Assay 30 Arbeitsstunden und zwei Wochen experimentelle Arbeit (beginnend mit der Einrichtung der Wettbewerbs-Assay-Käfige) bis zur endgültigen Bestimmung der männlichen Paarungswettbewerbsfähigkeit.

seine Arbeit stellt die Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffs, RhB, (gefüttert als 0,2% RhB-Saccharose an die Moskitos, Ergänzende Abbildung S2)zur direkten Messung von Paarungsinteraktionen zwischen Weibchen und RhB-markierten Männchen vor. Während dieses Protokoll ein Fluoreszenz-Stereomikroskop erfordert, entfällt die Notwendigkeit, die oben genannten zeitaufwändigen experimentellen Verfahren durchzuführen. Im Durchschnitt benötigt dieser RhB-basierte Assay etwa 10 Mannstunden und etwa einen Tag, um Daten zu erhalten, die denen von weiblichen Fruchtbarkeitstests entsprechen. Dies Diese >90% Zeitersparnis ermöglicht es Forschern, mehrere experimentelle Replikate durchzuführen, was eine robustere Validierung der männlichen Paarungsfitness ermöglicht. Darüber hinaus kann dieser Assay verwendet werden, um die Paarungswettbewerbsfähigkeit zwischen zwei sterilen oder Wolbachia-infizierten Moskitoslinien zu vergleichen.

Diese Art des Vergleichs ist mit herkömmlichen weiblichen Fruchtbarkeitstests nicht möglich, da Weibchen bei der Paarung mit beiden solchen Linien nicht lebensfähige Eier liefern würden.  Ungeachtet dessen wird jede gemischte Paarung im Experiment zu einer Verzerrung gegenüber der markierten Population führen, da es schwierig ist, unmarkierte Spermien in weiblichen Spermatheken zu identifizieren, die Samenflüssigkeit sowohl von RhB-markierten als auch von unmarkierten Männchen enthalten. Eine ähnliche Schlussfolgerung wurde in einer Studie zur Bewertung der Paarungswettbewerbsfähigkeit von Anopheles gambiae mit RhB18gezogen, wobei ein größerer Anteil von Weibchen im Paarungstest von markierten Männchen gepaart wurde. Da Polyandrie bei Weibchen, die zuvor eine unterbrochene Paarung33hatten, häufiger auftritt, wurde die Wahrscheinlichkeit, dass dies auftritt, in dieser Studie reduziert, indem in diesen Experimenten weniger Moskitos (20 Männchen bis 10 Weibchen) in einem größeren Käfigvolumen (0,216m3)verwendet wurden.

Die Ergebnisse zeigten keine Verzerrung gegenüber der RhB-markierten Population, was darauf hindeutet, dass die gemischte Paarung begrenzt war. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Einbeziehung der RhB zur Kennzeichnung von Männchen in einen Paarungswettbewerbsfähigkeitstest eine wirtschaftliche und schnelle Möglichkeit zur Bewertung der männlichen Paarungstauglichkeit ist. Diese Methode ermöglicht auch den direkten Vergleich der Paarungswettbewerbsfähigkeit zwischen Männchen, die unterschiedlichen Bestrahlungsdosen ausgesetzt sind, in verschiedenen Aufzuchtregimen aufgezogen werden, oder solchen, die mit verschiedenen Wolbachia-Stämmeninfiziert sind, was sie zu einem wertvollen Werkzeug für die Bewertung der männlichen Paarungstauglichkeit für jedes männliche Freisetzungs-basierte Mückenpopulationsunterdrückungsprogramm macht.

Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde von der National Environment Agency (NEA), Singapur, finanziert. Wir danken Herrn Chew Ming Fai, Deputy Chief Executive Officer (Public Health), NEA, für seine Genehmigung zur Veröffentlichung der Studie und A/Prof. Ng Lee Ching, Group Director (Environmental Health Institute Group), NEA, für ihre Unterstützung bei dieser Studie. Wir danken auch Dr. Shuzhen Sim und Dr. Denise Tan für das Korrekturlesen des Manuskripts.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
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VerbundlichtmikroskopOlympusCX23Zur Bewertung für Spermathecae Insemination
DissektionszangeBioquipRubis Pinzette (4524)
Fluoreszenz-Stereolichtmikroskop mit RFP1Filter OlympusSZX16Zur Prüfung auf Rhodamin B Fluoreszenzsignal
MückenkäfigeBugdorm4F3030B 32,5 cm x T 32,5 cm x H 32,5 cm; Maschenweite von 150 x 150; 160 &Mikro; m aperture Für die Haltung von männlichen und weiblichen adulten Mücken vor dem Paarungstest
6M610B 60 cm x T 60 cm x H 60 cm; Maschenweite von 44 x 32; 650 & Mikro; m aperture
Für die Paarungsfähigkeit Assay
Moskitonetze150 x 150, 160 & Mikro; m aperture
Rhodamin BSigma AldrichR6626≥ 95% (HPLC)
Stereo-LichtmikroskopOlympusSZ61Für die Spermathecae-Dissektion
SaccharoseMP BiomedicalsSKU 029047138
Lebensmittelqualität TetraMin tropische FlockenTetra77101Fischfutter zur Fütterung von Larven

Referenzen

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Schlagwörter

Aedes Aegypti MosquitoesMating CompetitivenessRhodamine B MarkingSterile Insect TechniqueWolbachia Infected MosquitoesFluorescent Dye AssaySpermathecae DissectionPopulation SuppressionMark Release RecaptureMosquito Fitness Assessment

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