Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bruke fluorescerende fargestoff, Rhodamine B, for å studere parring konkurranseevne i mannlige Aedes aegypti mygg

Published: May 7, 2021 doi: 10.3791/62432
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Environmental Health Institute, National Environmental Agency
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å studere parring av konkurranseevnen til mannlige Aedes aegypti ved hjelp av fluorescerende fargestoff som markør. Kvinnelige mygg er utsatt for både merkede og umerkede menn for kopiering. Etter parring undersøkes spermathecae under et fluorescensmikroskop for å bestemme parringspartneren.

Abstract

Suksessen til sterile eller inkompatible insektteknikkbaserte befolkningsundertrykkingsprogrammer avhenger av evnen til frigjorte menn til å konkurrere om ville kvinner og indusere sterilitet i målpopulasjonen. Laboratorievurdering av mannlig parrings konkurranseevne er derfor avgjørende for å evaluere frigjøringsstammens kondisjon før feltutgivelse. Konvensjonelt utføres en slik analyse ved å bestemme andelen levedyktige egg produsert av hunnene etter å ha blitt samtidig utsatt for to sett med menn (villtype og frigjøringsstammer) for kopiering. Denne prosessen er imidlertid tidkrevende og arbeidskrevende på grunn av behovet for å først blodmate hunnene til eggproduksjon og deretter klekke og liste opp de klekkede eggene for å bestemme egg levedyktighet.

Videre kan denne metoden ikke skjelne graden av konkurranseevne mellom to sterile eller Wolbachia-infisertemygglinjer, da villtype kvinnelige mygg bare vil produsere ikke-levedyktige egg ved parring med begge deler. For å omgå disse begrensningene beskriver dette papiret en mer direkte metode for å måle mannlig myggparring konkurranseevne i laboratoriemiljøer ved hjelp av fluorescerende fargestoff, rhodamin B (RhB), som kan brukes til å markere menn ved å mate dem i sukrose løsning som inneholder RhB. Etter parringsanalysen kan tilstedeværelsen av fluorescing sperms i spermathecae av en kvinne brukes til å bestemme hennes parringspartner. Denne metoden er kostnadseffektiv, reduserer den eksperimentelle tiden med 90% og tillater sammenligning av parringstrening mellom to sterile eller Wolbachia-infisertelinjer.

Introduction

Oppdrett og frigjøring av sterile eller inkompatible menn for undertrykkelse av Aedes myggpopulasjoner blir for tiden evaluert i feltet som et nytt verktøy for å forhindre utbrudd av denguefeber og annen Aedes-båretsykdom1. Mannlige frigjøringsundertrykkingsstrategier som for tiden er i feltforsøk inkluderer bruk av den genetiske metoden2, bestråling (Steril insektteknikk, SIT)3, endosymbiotiske bakterier Wolbachia (Insect Incompatible Technique, IIT)4, eller en kombinasjon av de to sistnevnte teknikkene5,6. Suksessen til disse tilnærmingene er i stor grad avhengig av de frigjorte mennenes evne til å utkonkurrere ville menn og søke kvinner for å sikre kopiering. Ellers kan sterilitet ikke induserer i målpopulasjonen.

I et klassisk SIT-program kan for eksempel mannlig parring påvirkes av faktorer som bestrålingsdose7,8,9, masseoppdrettsprotokoll og omfanget av innavl i kolonien10,11,12,13,14. Videre kan studier på parrings konkurranseevne gi viktig kunnskap om mygg parring atferd som kan brukes til å informere vektorkontroll strategier.

I SIT og IIT vurderes parrings konkurranseevnen til mannlige mygg vanligvis ved å tillate både villtype og frigjøringsstamme å konkurrere om villtype kvinner i et bur8,11,15,16. Hunnene blir deretter blodmatet og eggene klekket ut for å bestemme levedyktigheten. Hunnene som legger ikke-levedyktige egg eller egg med lav lukehastighet antas å ha parret seg med frigjøringsstammehanner, mens kvinner som produserer levedyktige egg antas å ha parret seg med ville menn. Parring av konkurranseevne beregnes deretter med Fried Index17. Dessverre er denne metoden ressurskrevende og tidkrevende, og den samlede stekte indeksen kan påvirkes av eksterne forvirrende faktorer som påvirker egg levedyktighet som dårlig egghåndtering og overtørking kan resultere i en lav lukehastighet i kompatibilitetskorset som deretter kan føre til en kunstig lav stekt indeks.

Videre tillater denne metoden ikke direkte sammenligning av parring av konkurranseevne mellom Aedes mygg som er smittet med forskjellige stammer av Wolbachia eller som er utsatt for forskjellige doser bestråling. Derfor kreves en mer direkte metode for å løse disse utfordringene. Nyere studier18,19 har vist effektiviteten av å bruke fluorescerende fargestoff, RhB, for å markere mannlige myggs sædvæske. Merket sædvæske overføres og lagres i de kvinnelige myggenes spermathecae ved vellykket parring, noe som muliggjør direkte måling av kvinnelig parring interaksjon med merkede menn. Rhodamine B er et tiolreaktivt fluorfargestoff som vanligvis brukes som biomarkør for økologiske og atferdsmessige forskningsstudier hos dyr, inkludert insekter20. For myggstudier blir RhB introdusert ved fôring med sukker eller honningvann som inneholder oppløst RhB-pulver18,19,21,22,23,24. Ved opptak binder RhB-fargestoffet seg til proteiner, flekker kroppsvev med en rød-rosa flekk som fluoresces lyse oransje under en fluorescerende lyskilde.

Det sterke fluorescenssignalet og stabiliteten til merkingen, kombinert med sin evne til å flekke insekt sædvæsker, gjør det mulig å overvåke overføringen av merket sædvæske fra den merkede hannen til sædlagringsorganene til det kvinnelige insektet for parringsstudier18,19,21,24. Bruken av RhB i en mannlig parring konkurranseevneanalyse tillater ikke bare direkte måling av parring samspillet mellom kvinner med enten merkede og umerkede menn, men resultatene kan også oppnås innen 24 timer, da det hindrer prosessen med å bestemme egg levedyktigheten, som vanligvis krever ca 10 til 14 dager. Videre overvinner denne metoden det potensielle tapet av data når de kvinnelige myggene ikke blodmates eller dør før oviposisjonering. Dette er spesielt viktig fordi i semi-feltforsøk, hvor kvinnelige mygg er utsatt for skade og død under post-parring samling ved hjelp av en ryggsekk eller mekanisk aspirator. For å møte de nåværende begrensningene ved å bruke kvinnelig fruktbarhet til vi presentere en alternativ metode som bruker RhB farging for å direkte måle mannlig mygg parring konkurranseevne. Metoden forenkler arbeidsflyten, forkortet eksperimentell tid fra omtrent to uker til en dag, slik at flere eksperimentelle replikeringer kan utføres og tillater sammenligning mellom to frigjøringsstammer. Denne protokollen vil være egnet for laboratorier som tar fatt på mannlige frigjøringsbaserte myggpopulasjonsundertrykkingsprogrammer, og kan brukes til rutinemessig kvalitetskontroll og belastningsevaluering.

Protocol

1. Oppdrett av mygg

  1. Utfør all myggoppdrett og den mannlige parringseffektivitetsanalysen under standard insektforhold på 27 ± 1 °C og 75-80% relativ fuktighet, med en fotoperiod på 12 t:12 t lys: mørke sykluser.
  2. Angi de to settene konkurrerende hanner som Sett A og Sett B for enkel referanse i metodikken som er beskrevet i dette dokumentet. Bak myggene under standardiserte forhold for å sikre en rettferdig sammenligning av deres kondisjon under analysen. Bak myggene ved en larvaltetthet på 500 larver i 2 L vann og mate dem med malt fiskematpulver ad libitum.
    MERK: For genereringen av de representative resultatene var sett A og sett B de innavlede og outcross hannene til Wolbachia-infiserte Ae. Aegypti, henholdsvis.
  3. Sex mannlige og kvinnelige mygg på puppetrinnet, og inneholder dem separat i bur (se materialtabellen) med dimensjoner B 32,5 cm x D 32,5 cm x H 32,5 cm, med maskestørrelse på 150 x 150 og 160 μm blenderåpning. Vedlikehold alle voksne mygg med 10% sukroseoppløsning.

2. Forberedelse av mannlige og kvinnelige mygg

  1. Kjønn de mannlige og kvinnelige myggene på puppetrinnet i henhold til deres størrelsesforskjeller (mannlige pupper er mindre enn kvinnelige pupper) (Figur 1).
  2. For hvert sett mygg (Sett A eller Sett B), overfør 100 mannlige pupper hver til et formerket bur for sukrosefôring eller RhB-sukrosefôring.
  3. Plasser den kvinnelige puppene i små partier på 40-50 per bur. Ved fremveksten av bildene, sjekk burene for tilstedeværelse av mannlige mygg.
    MERK: Voksne mannlige mygg er mindre enn kvinner og har buskere og hårete antenner (Figur 2). Bruk bare jomfruelige kvinnelige mygg for parring av konkurranseevneanalyser. Bruken av pre-inseminerte kvinner vil gjøre alle resulterende data ugyldige. Dermed må det tas ekstrem forsiktighet under sexing på puppetrinnet. Ikke bruk de kvinnelige myggene fra et bur som har blitt forurenset med mannlige mygg. Ekstra bur av kvinner bør være forberedt.

3. Tilberedning av 0,2% RhB - sukroseoppløsning

MERK: RhB er et grønt pulver i tørr form og rød-rosa i oppløsning. Standard personlig verneutstyr (PVU: laboratoriebeskyttelseskjole, nitrilhansker og øyebeskyttelse) skal brukes ved håndtering av dette kjemikaliet. For å unngå innånding, vei RhB-pulveret i en avtrekkshette.

  1. For å tilberede en 0,2% m/v RhB-sukroseoppløsning, oppløs 200 mg RhB pulver for hver 100 ml 10% m/v/ sukroseoppløsning. Bland godt for å sikre at alt pulveret er oppløst.
    MERK: Siden RhB er lysfølsom, bruk gule flasker eller pakk klare flasker helt med aluminiumsfolie.

4. Fôring av mannlige mygg

MERK: Data fra RhB-sukrose fôringsoptimalisering er presentert i Tilleggsmateriale, avsnitt 1.

  1. Forbered 20 sukkermaterflasker med en veke. Tilsett 10 ml 10% sukrose i 10 materflasker og 10 ml 0,2% RhB-sukroseoppløsning i de andre 10 materflaskene (bruk gule flasker, eller pakk flaskene i aluminiumsfolie).
  2. Plasser materflaskene i de respektive mannlige burene (5 flasker per bur) tilberedt i trinn 2.2 og 2.3. La de mannlige myggene mate i tre dager før parringseksperimentet.

5. Kontroll av RhB fluorescens i mannlige mygg

  1. Aspirate RhB-sukrose-matet mannlige mygg, og observere dem under et fluorescens stereomikroskop for å sikre at alle RhB-sukrose-matede mannlige mygg har blitt vellykket merket med RhB.
  2. Slå på kvikksølvbrennerlampen og stereomikroskopet. La lyskilden til kvikksølvbrennerlampen stabilisere seg i 10 minutter. Still inn fluorescensfiltrene for rødt fluorescensprotein 1 (RFP1) (eksitasjonsbølgelengde 540 nm, utslippsbølgelengde 625 nm).
  3. Aspirer et lite antall mygg (fire eller fem) om gangen inn i glassrøret til den orale aspiratoren. Gjennom glassrøret, observere kroppen til de mannlige myggene under fluorescens stereomikroskopet. Utelukke mannlige mygg som ikke er merket med RhB fra eksperimentet.
    MERK: Underlivet av mannlige mygg merket med RhB vil virke rosa under hvitt lys (Figur 3A) og gløde lyse oransje under fluorescerende lys (Figur 3B).
  4. Overføringssett En mannlig mygg i 12 papirkopper sikret med netting (maskestørrelse 150 x 150, 160 μm blenderåpning); 6 kopper hver med 10 sukrosefôrede mannlige mygg og de andre 6 koppene hver med 10 RhB-sukrose-matede mannlige mygg. Gjenta dette trinnet for Set B mannlige mygg.

6. Parring konkurranseevne analyse

  1. Sett opp 12 B 60 cm x D 60 cm x H 60 cm bur med maskestørrelse 44 x 32, 650 μm blenderåpning for parringsanalysen. I hvert av de seks burene, inkluderer 10 Set A (RhB-merkede) mannlige mygg, 10 Sett B (umerkede) mannlige mygg og 10 jomfruelige villtype kvinnelige mygg. I de andre seks burene inkluderer 10 Sett A (umerkede) mannlige mygg, 10 Sett B (RhB-merket) mannlige mygg og 10 jomfruelige villtype kvinnelige mygg. Merk disse burene for å tydelig skille mellom de to parringskombinasjonene.
    MERK: Basert på erfaring ble et bur på 60 cm x 60 cm x 60 cm brukt til parringsanalysen, da et mindre bur kan oppmuntre til blandet parring.
  2. Plasser de respektive koppene av menn tilberedt i trinn 5.4 i parringsburene i henhold til etiketten i trinn 6.1. Fjern nettet og trykk forsiktig på koppen for å jostle hannene ut av koppen. Fjern forsiktig papirkoppen og nettet fra buret for å sikre at ingen mygg unnslipper fra buret. La de mannlige myggene akklimatisere seg i parringsburet i minst en time.
  3. Bruk en oral aspirator, overfør jomfru villtype kvinnelige mygg til 12 papirkopper, med hver kopp som inneholder 10 mygg.
  4. Etter akklimatiseringsperioden for de mannlige myggene, overfør en kopp kvinner til hvert parringbur og fjern nettet. Jostle forsiktig koppen for å oppmuntre eventuelle gjenværende kvinnelige mygg ut av koppen. Fjern forsiktig papirkoppen og nettet fra buret for å sikre at ingen mygg unnslipper fra buret.
  5. La parring foregå i 3 timer.
    MERK: Anbefalt paringsvarighet ble bestemt gjennom tidligere observasjoner av wild-type Ae. aegypti. I eksperimenter som involverer 10 kvinner og 20 menn som holdes i et 60 cm x 60 cm x 60 cm bur, ble 90% kvinnelig inseminering oppnådd i 3 timer (Tilleggsmateriale, avsnitt 2). Ikke forstyrr buret i denne perioden, da agitasjon kan føre til avbrutt og blandet parring. Blandet parring (hvor kvinnen har parret seg med både merkede og umerkede menn) resulterer i en skjevhet mot RhB-merkede menn, da det er vanskelig å skille umerkede sædceller fra RhB-merkede sædceller under et fluorescensmikroskop.
  6. For å avslutte parringseksperimentet, fjern alle myggene fra hvert bur ved hjelp av en mekanisk aspirator. Kald bedøv myggene på is i minst 5 min. Når myggene er fullstendig bedøvet, plukk forsiktig opp de kvinnelige myggene og hus dem i en separat papirkopp sikret med netting (maskestørrelse 150 x 150, 160 μm blenderåpning). Merk papirkoppen ved å overføre den respektive etiketten fra paringsburet til papirkoppen.
    MERK: Det er mulig å pause eksperimentet på dette tidspunktet og opprettholde hunnene med 10% sukroseoppløsning. Den RhB-merkede sædvæsken vil forbli stabil inne i den kvinnelige spermathecae i minst en uke. Det er best å holde hunnene i live før disseksjon som døde og uttørkede prøver er vanskelig å dissekere.
  7. For å score den kvinnelige spermathecae, bedøvelse av de kvinnelige myggene på is i minst 5 minutter før disseksjon under et stereomikroskop (Video 1). Undersøk spermathecae under et sammensatt lysmikroskop (forstørrelse 100x) for deres inseminasjonsstatus (figur 4). For inseminerte individer, bestem om spermathecae inneholder RhB-merket sædvæske ved å undersøke dem under fluorescens stereomikroskopet utstyrt med et RFP1-filter og et kameraavbildningssystem.
    MERK: Når du bruker et fluorescenssterekroskop med et tilkoblet bildebehandlingssystem, anbefales det å bruke en lengre eksponeringstid (5 s) for å øke deteksjonsfølsomheten. Hvis den kvinnelige mygga har parret seg med en merket mann, vil hennes spermathecae fluoresce lyse oransje (Figur 5A). Men hvis den kvinnelige mygga har parret seg med en umerket mann, vil hennes inseminerte spermathecae ikke fluoresce (Figur 5B).

7. Avhending av RhB-avfall

  1. Behandle vandig RhB-avfall med aktivert karbon25 før det utlades som generelt avløpsvann. Kast fast RhB-avfall (mygg merket med RhB, papirhåndklær og veker gjennomvåt med RhB) som kjemisk avfall. Ikke bruk standard verneutstyr ved håndtering av RhB-avfall.

Representative Results

w AlbB-SG er en lokalisert (Singapore) Ae. aegypti linje stabilt infisert med wAlbB-stammen av Wolbachia. Ved hjelp av protokollen som er beskrevet i dette dokumentet, evaluerte vi den mannlige parrings konkurranseevnen til en innavlet og en outcrossed linje av wAlbB-SG for å avgjøre om innavl resulterer i tap i mannlig parring fitness. Den innavlede linjen hadde blitt opprettholdt i 11 generasjoner i insektet, mens den utkryssede linjen ble generert ved å backcrossing hunnene med vill type mannligE. aegypti. Hanner fra de innavlede og utkryssede linjene ble konkurrert mot hverandre for parring med villtype villtype kvinnelig Ae. aegypti. Parringskomplitetsanalysen ble utført i triplikat.

Resultatene indikerte at RhB ikke påvirket menns kondisjon da dataene for kvinnelig inseminering ikke var partisk mot eller mot parring med RhB-sukrose-matede hanner (Tabell 1 og Figur 6) Ettersom RhB ikke påvirker mennenes parringsform, fortsetter vi å analysere dataene basert på prosentandelen inseminerte kvinner som er parret av enten den innavlede eller utkryssede linjen (Tabell 2 og figur 7). Resultatet på tvers av de eksperimentelle triplikatene var konsistent; det var en betydelig høyere prosentandel kvinner parret med outcross menn enn med innavl menn i alle tre replikeringer (P ≤ 0,05, Mann-Whitney U-test). Disse resultatene tyder på et potensielt tap i mannlig parringstrening etter flere generasjoner innavl i laboratoriet.

Figure 1
Figur 1: Lateral visning av mannlig (venstre) og kvinne (høyre) Aedes aegypti pupper. Under de samme oppdrettsforholdene kan Ae. aegypti kjønnes på puppetrinnet i henhold til størrelse; hannene er betydelig mindre enn kvinner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Differensiering av mannlige (venstre) og kvinnelige (høyre) Aedes aegypti voksne. Voksne mannlige mygg (venstre) har buskere og hårete antenner enn den voksne kvinnen; de røde pilene angir antennene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Rhodamine B-merking av mannlig mygg. (A) Lysmikroskopi; (B) fluorescensmikroskopi. Myggen til venstre er umerket (matet med 10% m / v sukrose), mens den til høyre er merket (matet med 0,2% RhB-sukrose). Merkede mygg har en synlig rosa mage under hvitt lys (myggen til høyre i A), som fluoresces lyse oransje under fluorescensmikroskopi (B). Skalastenger = 5 mm. Forkortelse: RhB = Rhodamine B. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Inseminert og ikke-inseminert kvinnelig spermathecae under et sammensatt lysmikroskop (100x forstørrelse). Inseminasjonsstatusen til en kvinnelig mygg kan bestemmes ved å observere spermathecae under et sammensatt lysmikroskop. En inseminert kvinnelig mygg vil inneholde minst en fylt spermatheca mens alle tre spermathecae av en ikke-inseminert kvinnelig mygg vil være tom. Trådlignende, motil sæd vil være synlig i en fylt spermatheca under et sammensatt lysmikroskop. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Kvinnelig mygg spermathecae inseminert med sædvæsker under et fluorescens stereomikroskop. (A) RhB-merket og (B) umerket spermathecae inseminert med RhB-merkede sædvæsker vil fluoresce lyse oransje under fluorescensmikroskopi. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Antall villtype kvinner inseminert av enten innavlede eller outcross menn i eksperimentelle triplikater med gjensidig merking. (A) De innavlede hannene ble merket med RhB mens outcross-hannene var umerket. (B) Outcross-hannene ble merket med RhB mens de innavlede hannene var umerket. Et høyere antall kvinner ble observert å ha parret seg med outcross menn uavhengig av deres merkestatus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Andel inseminerte kvinner parret med innavlede eller outcross menn i de 3 eksperimentelle replikeringene. For hver eksperimentelle replikering er det en betydelig høyere prosentandel kvinner parret med outcross menn (P ≤ 0,05, Mann-Whitney U-test). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Disseksjon av kvinnelige Aedes aegypti for spermathecae under et lett stereomikroskop. Klikk her for å laste ned denne videoen. 

♀ x Innavl (RhB) ♂ en ♀ x Outcross (umerket) ♂ b ♀ x Innavlet (umerket) ♂ c ♀ x Outcross (RhB) ♂ d Samlet inseminasjonsrate
(a+b+c+d/120)
Repliker 1 11 35 7 40 77.5% (93/120)
Repliker 2 6 29 8 31 61.7% (74/120)
Repliker 3 6 36 6 33 67.5% (81/120)

Tabell 1: Antall kvinner paret med RhB-merkede og umerkede wAlbB-Sg Aedes aegypti inbred og outcross menn. Totalt 120 kvinner ble brukt i hver replikering.

Prosent inseminerte kvinner
Innavlede menn Outcross hanner
Repliker 1 19% (18/93) 81% (75/93)
Repliker 2 19% (14/74) 81% (60/74)
Repliker 3 15% (12/81) 85% (69/81)

Tabell 2: Prosentandel av inseminerte kvinner parret med wAlbB-Sg Aedes aegypti inbred og outcross menn.

Supplerende figur S1: Sammenligning av arbeidsflyt for RhB-basert og konvensjonell parring konkurranseevneanalyse. Sammenlignet med den konvensjonelle parringsanalysen, reduserer den forenklede og forkortede arbeidsflyten for RhB-basert parring konkurranseevneanalyse betydelig den eksperimentelle varigheten. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S2: Kaplan Meier overlevelseskurver av mannlig voksen Aedes aegypti under og etter fôring med 0,2% og 0,4% rhodamin B-sukrose fôring. Prosent overlevelse av (A) mannlig villtype og (B) wAlbB-Sg Ae. aegypti under og etter tre dager med fôring på 0,2% og 0,4% RhB-sukrose, sammenlignet med kontroller som bare ble matet med sukrose. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende bord S1: Insemineringshastighet av kvinner i en B 60 cm x D 60 cm x H 60 cm bur (forhold på 10 kvinner til 20 menn) ved 1-, 2- og 3-timers tidspunkter. Klikk her for å laste ned denne tabellen. 

Discussion

Merking brukes ofte i entomologisk forskning for å studere insektpopulasjonsdynamikk, spredning, oppførsel og parringsbiologi26. I SIT- og IIT-programmer utføres merking for å skille frigjøringsstammen fra feltpopulasjonen for å studere spredningen og optimalisere frigjøringsforholdet. Merkemetodene som brukes inkluderer genetisk merking27,28, inkorporering av isotoper i larvalmat29,30, fluorescerende støv31ogfargestoff 32. For undertrykkelse av myggpopulasjoner ved hjelp av SIT eller IIT, hvor mannlig parring fitness er en kritisk komponent, fluorescerende fargestoffer har blitt brukt som markører for å studere mygg parring biologi18,19.

Konvensjonelt, vurdering av mannlig parring konkurranseevne av utslipp stammen har blitt vurdert ved hjelp av kvinnelige fruktbarhet analyser. Denne analysen er imidlertid tidkrevende og arbeidskrevende på grunn av nedstrøms eksperimentelle prosesser etter parring (Supplerende figur S1). Disse prosessene inkluderer blodfôring av hunnene, eggsamling, klekking av eggene og opplisting av andelen klekkede egg for å bestemme egg levedyktighet. I gjennomsnitt krever denne analysen 30 arbeidstimer og to uker med eksperimentelt arbeid (fra å sette opp konkurranseevnens analysebur) til den endelige bestemmelsen av mannlig parring konkurranseevne.

hans papir presenterer bruken av et fluorescerende fargestoff, RhB, (matet som 0,2% RhB-sukrose til myggene, Supplemental Figure S2) for å direkte måle parringsinteraksjoner mellom kvinner og RhB-merkede menn. Selv om denne protokollen krever et fluorescenssterekroskop, hindrer den behovet for å utføre de tidkrevende eksperimentelle prosedyrene nevnt ovenfor. I gjennomsnitt krever denne RhB-baserte analysen omtrent 10 arbeidstimer og omtrent en dag for å få data som tilsvarer det fra kvinnelige fruktbarhetsanalyser. Dette >90% tidsbesparelser gjør det mulig for forskere å utføre flere eksperimentelle repliker, noe som gir en mer robust validering av mannlig parringstrening. I tillegg kan denne analysen brukes til å sammenligne parrings konkurranseevnen mellom to sterile eller Wolbachia-infiserte mygglinjer.

Denne typen sammenligning er ikke mulig med konvensjonelle kvinnelige fruktbarhetsanalyser, da kvinner ville gi ikke-levedyktige egg ved parring med begge slike linjer.  Til tross for dette vil enhver blandet parring i eksperimentet resultere i skjevheter mot den markerte befolkningen, da det er vanskelig å identifisere umerkede sædceller i kvinnelig spermathecae som inneholder sædvæske fra både RhB-merkede og umerkede menn. En lignende konklusjon ble gjort i en studie som vurderte parring konkurranseevnen til Anopheles gambiae ved hjelp av RhB18, hvorved en større andel kvinner i parringsanalysen ble funnet å være parret av markerte menn. Ettersom polyandry er mer sannsynlig å forekomme hos kvinner som tidligere hadde engasjert seg i en avbrutt parring33, ble sannsynligheten for at dette skjedde redusert i denne studien ved å bruke færre mygg (20 menn til 10 kvinner) i et større burvolum (0,216 m3) i disse forsøkene.

Resultatene viste ingen skjevheter mot den RhB-merkede befolkningen, noe som indikerer at blandet parring var begrenset. Oppsummert er inkorporering av RhB for å markere menn i en parrings konkurranseanalyse en økonomisk og rask måte å evaluere mannlig parring fitness. Denne metoden tillater også direkte sammenligning av parring konkurranseevne mellom menn utsatt for forskjellige doser bestråling, oppdrettet i forskjellige oppdrettsregimer, eller de som er smittet med forskjellige stammer av Wolbachia, noe som gjør det til et verdifullt verktøy for evaluering av mannlig parring egnethet for ethvert mannlig frigjøringsbasert myggpopulasjonsundertrykkingsprogram.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Denne studien ble finansiert av National Environment Agency (NEA), Singapore. Vi takker Mr Chew Ming Fai, viseadministrerende direktør (Public Health), NEA, for hans godkjenning for å publisere studien, og A/Prof Ng Lee Ching, group director (Environmental Health Institute Group), NEA, for hennes støtte i denne studien. Vi takker også Dr. Shuzhen Sim og Dr Denise Tan for korrekturlesing av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Compound light microscope Olympus CX23 To score for spermathecae insemination
Dissection forceps Bioquip Rubis forceps (4524)
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter Olympus SZX16 To check for Rhodamine B fluorescence signal
Mosquito cages Bugdorm 4F3030 W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay
6M610 W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture
For mating competitiveness assay
Mosquito netting 150 x 150, 160 µm aperture
Rhodamine B Sigma Aldrich R6626 ≥95% (HPLC)
Stereo-light microscope Olympus SZ61 For spermathecae dissection
Sucrose MP Biomedicals SKU 029047138 Food grade
TetraMin tropical flakes Tetra 77101 Fish food for feeding larvae

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Achee, N. L., et al. A critical assessment of vector control for dengue prevention. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003655 (2015).
  2. Carvalho, D. O., et al. Suppression of a field population of Aedes aegypti in Brazil by sustained release of transgenic male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003964 (2015).
  3. Lees, R. S., Gilles, J. R. L., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. B., Bourtzis, K. Back to the future: the sterile insect technique against mosquito disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 156-162 (2015).
  4. Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
  5. Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Gilles, J. R. L., Bourtzis, K. Combining the sterile insect technique with Wolbachia-based approaches: II--A safer approach to Aedes albopictus population suppression programmes, designed to minimize the consequences of inadvertent female release. PloS One. 10 (8), 0135194 (2015).
  6. Zheng, X., et al. Incompatible and sterile insect techniques combined eliminate mosquitoes. Nature. 572 (7767), 56-61 (2019).
  7. Balestrino, F., et al. Gamma ray dosimetry and mating capacity studies in the laboratory on Aedes albopictus males. Journal of Medical Entomology. 47 (4), 581-591 (2010).
  8. Bellini, R., et al. Mating competitiveness of Aedes albopictus radio-sterilized males in large enclosures exposed to natural conditions. Journal of Medical Entomology. 50 (1), 94-102 (2013).
  9. Helinski, M. E., Parker, A. G., Knols, B. G. Radiation biology of mosquitoes. Malaria Journal. 8, Suppl 2 6 (2009).
  10. Aldersley, A., et al. Too "sexy" for the field? Paired measures of laboratory and semi-field performance highlight variability in the apparent mating fitness of Aedes aegypti transgenic strains. Parasites & Vectors. 12 (1), 357 (2019).
  11. Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (3), 507-516 (2016).
  12. Benedict, M. Q., et al. Colonisation and mass rearing: learning from others. Malaria Journal. 8 (2), 4 (2009).
  13. Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56124 (2017).
  14. Ross, P. A., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. A comprehensive assessment of inbreeding and laboratory adaptation in Aedes aegypti mosquitoes. Evolutionary Applications. 12 (3), 572-586 (2019).
  15. Segoli, M., Hoffmann, A. A., Lloyd, J., Omodei, G. J., Ritchie, S. A. The effect of virus-blocking Wolbachia on male competitiveness of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3294 (2014).
  16. Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Bourtzis, K., Gilles, J. R. Combining the sterile insect technique with the incompatible insect technique: III-Robust mating competitiveness of irradiated triple Wolbachia-infected Aedes albopictus males under semi-field conditions. PloS One. 11 (3), 0151864 (2016).
  17. Fried, M. Determination of sterile-insect competitiveness. Journal of Economic Entomology. 64 (4), 869-872 (1971).
  18. Aviles, E. I., Rotenberry, R. D., Collins, C. M., Dotson, E. M., Benedict, M. Q. Fluorescent markers rhodamine B and uranine for Anopheles gambiae adults and matings. Malaria Journal. 19 (1), 236 (2020).
  19. Johnson, B. J., et al. Use of rhodamine B to mark the body and seminal fluid of male Aedes aegypti for mark-release-recapture experiments and estimating efficacy of sterile male releases. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005902 (2017).
  20. Fisher, P. Review of using rhodamine B as a marker for wildlife studies. Wildlife Society Bulletin. 27 (2), 318-329 (1999).
  21. Blanco, C. A., Perera, O., Ray, J. D., Taliercio, E., Williams, L. Incorporation of rhodamine B into male tobacco budworm moths Heliothis virescens to use as a marker for mating studies. Journal of Insect Science. 6, 5 (2006).
  22. Mascari, T. M., Foil, L. D. Laboratory evaluation of the efficacy of fluorescent biomarkers for sugar-feeding sand flies (Diptera: Psychodidae). Journal of Medical Entomology. 47 (4), 664-669 (2014).
  23. Sarkar, D., Muthukrishnan, S., Sarkar, M. Fluorescent marked mosquito offer a method for tracking and study mosquito behaviour. International Journal of Mosquito Research. 4, 5-9 (2017).
  24. South, A., Sota, T., Abe, N., Yuma, M., Lewis, S. M. The production and transfer of spermatophores in three Asian species of Luciola fireflies. Journal of Insect Physiology. 54 (5), 861-866 (2008).
  25. Üner, O., Geçgel, Ü, Kolancilar, H., Bayrak, Y. Adsorptive removal of rhodamine B with activated carbon obtained from okra wastes. Chemical Engineering Communications. 204 (7), 772-783 (2017).
  26. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annual Review of Entomology. 46, 511-543 (2001).
  27. Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). New Biotechnology. 25 (1), 76-84 (2008).
  28. Ahmed, H. M. M., Hildebrand, L., Wimmer, E. A. Improvement and use of CRISPR/Cas9 to engineer a sperm-marking strain for the invasive fruit pest Drosophila suzukii. BMC Biotechnology. 19 (1), 85 (2019).
  29. Botteon, V., Costa, M. L. Z., Kovaleski, A., Martinelli, L. A., Mastrangelo, T. Can stable isotope markers be used to distinguish wild and mass-reared Anastrepha fraterculus flies. PloS One. 13 (12), 0209921 (2018).
  30. Hood-Nowotny, R., Mayr, L., Islam, A., Robinson, A., Caceres, C. Routine isotope marking for the Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae). Journal of Economic Entomology. 102 (3), 941-947 (2009).
  31. Schroeder, W. J., Mitchell, W. C. Marking Tephritidae fruit fly adults in Hawaii for release-recovery studies. Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 23 (3), 437-440 (1981).
  32. Akter, H., Taylor, P. W., Crisp, P. Visibility and persistence of fluorescent dyes, and impacts on emergence, quality, and survival of sterile Queensland fruit fly Bactrocera tryoni (Diptera: Tephritidae). Journal of Economic Entomology. 113 (6), 2800-2807 (2020).
  33. Oliva, C. F., Damiens, D., Benedict, M. Q. Male reproductive biology of Aedes mosquitoes. Acta Tropica. 132, Suppl 12-19 (2014).

Tags

Biologi Utgave 171 Mygg parring konkurranseevne Aedes aegypti rhodamin B Steril insekt teknikk Wolbachia fitness befolkning undertrykkelse
Bruke fluorescerende fargestoff, Rhodamine B, for å studere parring konkurranseevne i <em>mannlige Aedes aegypti</em> mygg
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, I., Mak, K. W., Wong, J., Tan,… More

Li, I., Mak, K. W., Wong, J., Tan, C. H. Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes. J. Vis. Exp. (171), e62432, doi:10.3791/62432 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter