Summary
We beschrijven de methode voor kwantitatieve analyse van de verdeling van Aspergillus fumigatus conidia (3 μm groot) in de luchtwegen van muizen. De methode kan ook worden gebruikt voor de analyse van microdeeltjes en nanodeeltjes agglomeraat distributie in de luchtwegen in verschillende pathologische conditiemodellen.
Abstract
Aspergillus fumigatus conidia zijn ziekteverwekkers in de lucht die menselijke luchtwegen kunnen binnendringen. Immunocompetente mensen zonder allergieën vertonen resistentie en immunologische tolerantie, terwijl bij immuungecompromitteerde patiënten conidia de luchtwegen kan koloniseren en ernstige invasieve ademhalingsstoornissen kan veroorzaken. Verschillende cellen in verschillende luchtwegcompartimenten zijn betrokken bij de immuunrespons die schimmelinvasie voorkomt; de spatio-temporele aspecten van pathogene eliminatie zijn echter nog steeds niet volledig begrepen. Driedimensionale (3D) beeldvorming van optisch gewiste organen van hele bergen, met name de longen van experimentele muizen, maakt detectie van fluorescerend gelabelde pathogenen in de luchtwegen mogelijk op verschillende tijdstippen na infectie. In deze studie beschrijven we een experimentele opstelling om een kwantitatieve analyse uit te voeren van A. fumigatus conidia distributie in de luchtwegen. Met behulp van fluorescerende confocale laserscanmicroscopie (CLSM) hebben we de locatie van fluorescerend gelabelde conidia in de bronchiale takken en het alveolaire compartiment 6 uur na orofaryngeale toepassing op muizen getraceerd. De hier beschreven aanpak werd eerder gebruikt voor de detectie van de precieze locatie van de ziekteverwekker en de identificatie van de pathogene interagerende cellen in verschillende fasen van de immuunrespons. De experimentele opstelling kan worden gebruikt om de kinetiek van de eliminatie van pathogenen in verschillende pathologische omstandigheden te schatten.
Introduction
Dagelijks inhaleren mensen ziekteverwekkers in de lucht, waaronder sporen van opportunistische schimmels Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) die de luchtwegen kunnen binnendringen1. De luchtwegen van zoogdieren is een systeem van luchtwegen van verschillende generaties die worden gekenmerkt door de verschillende structuren van de luchtwegwanden2,3,4. Tracheobronchiale wanden bestaan uit verschillende celtypen, waaronder ciliated cellen die de mucociliaire klaring bieden5. In de longblaasjes zijn er geen ciliated cellen en de doordringende alveolaire ruimtepathogenen kunnen niet worden geëlimineerd door de mucociliaire klaring6. Bovendien is elke luchtweggeneratie een niche voor meerdere immuuncelpopulaties en zijn subsets van deze populaties uniek voor bepaalde luchtwegcompartimenten. Alveolaire macrofagen bevinden zich dus in de alveolaire compartimenten, terwijl zowel de luchtpijp als de geleidende luchtwegen zijn bekleed met de intra-epitheliale dendritische cellen7,8.
De geschatte grootte van A. fumigatus conidia is 2-3,5 μm9. Aangezien de diameter van kleine luchtwegen bij mensen en zelfs bij muizen groter is dan 3,5 μm, werd gesuggereerd dat conidia de alveolaire ruimte kan binnendringen2,10,11. In feite toonde histologisch onderzoek de schimmelgroei in de longblaasjes van de patiënten die lijden aan aspergillose12. Conidia werden ook gedetecteerd in de longblaasjes van geïnfecteerde muizen met behulp van levende beeldvorming van de dikke longschijfjes13. Tegelijkertijd werden conidia gedetecteerd in de lichtgevende kant van het bronchiale epitheel van muizen14.
Driedimensionale (3D) beeldvorming van de optisch ontruimde muislongen met hele montering maakt morfometrische analyse van de luchtwegenmogelijk 15. In het bijzonder werd de kwantitatieve analyse van de viscerale pleurale zenuwverdeling uitgevoerd met behulp van optisch gewiste muislongmonsters15. Onlangs onderzochten Amich et al.16 de schimmelgroei na intranasale toepassing van conidia op de immuungecompromitteerde muizen met behulp van een lichtbladfluorescentiemicroscopie van optisch gewiste muizenlongmonsters. De precieze locatie van de rustende conidia in de luchtwegen op verschillende tijdstippen na de infectie is belangrijk voor het identificeren van de celpopulaties die voldoende antischimmelverdediging kunnen bieden in bepaalde fasen van ontsteking. Vanwege de relatief kleine omvang worden de spatio-temporele aspecten van A. fumigatus conidia-distributie in de luchtwegen echter slecht gekarakteriseerd.
Hier presenteren we een experimentele opstelling voor de kwantitatieve analyse van A. fumigatus conidia distributie in de luchtwegen van geïnfecteerde muizen. Met behulp van fluorescerende confocale laserscanmicroscopie (CLSM) van optisch gewiste longen van muizen die een orofaryngeale toepassing van de fluorescerend gelabelde A. fumigatus conidia kregen, verkrijgen we 3D-beelden en voeren we de beeldverwerking uit. Met behulp van 3D-beeldvorming van de longkwab met de hele montering hebben we eerder de verdeling van A. fumigatus conidia in de geleidende luchtwegen van muizen 72 uur na conidia-toepassing8getoond .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden met betrekking tot proefdieren zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences (protocolnummer 226/2017).
1. A. fumigatus conidia-toepassing
- Om fluorescerend gelabelde A. fumigatus conidia te verkrijgen, bevestigt u 5 × 108 conidia door 1 ml 3% paraformaldehyde aan de conidiakorrel toe te voegen. Incubeer in een reageerbuis van 50 ml gedurende 2 uur op een shaker bij kamertemperatuur.
- Was conidia met 20 ml fosfaatbufferoplossing (PBS): centrifugeer gedurende 15 minuten op 1000 x g, verwijder voorzichtig het supernatant en voeg verse PBS toe in een volume van 20 ml. Herhalen.
- Los de conidia op in 900 μL van 0,1 M NaHCO3.
- Los de succinimidylester van de fluorescerende kleurstof van 594 nm op in 100 μL dimethylsulfoxide en voeg toe aan conidia.
- Incubeer de conidia met de kleurstof gedurende 1 uur op een shaker bij 150 tpm bij kamertemperatuur.
- Was de conidia tweemaal met 20 ml PBS in de centrifuge op 1.000 x g gedurende 15 min.
- Verdun de conidia tot een concentratie van 1 × 108 conidia/ml in PBS en bewaar bij 4 °C.
- Verdoof de muis met 0,5-3% isofluraandamp. Plaats de muis op de houder, bevestig de tong met een gladde tang en houd de nares vast. Neem een pipet met één kanaal en breng 50 μL conidia-suspensie aan op de keelholte van de muis. Wacht tot de suspensie is ingeademd.
2. Monstervoorbereiding
- Bereid de reageerbuis van 50 ml voor en vul deze met 15 ml verse 2% paraformaldehyde. Plaats de medische instrumenten (15 cm getande dissectied tang, 8 cm fijn getipte tang en 10 cm schaar met stompe uiteinden) in 70% ethanoloplossing.
- Euthanaseer de muis in overeenstemming met het IACUC-protocol. Plaats vervolgens de muis in de dorsale positie en bevestig de muizenpoten met naalden.
OPMERKING: Als u cervicale dislocatie gebruikt voor euthanasie, zorg dan voor de integriteit van de luchtpijp.- Behandel de muis met 70% ethanol met een spuit.
- Maak een mediane longitudinale snede in de ventrale huid van de achterpoten tot de voorpoten en de kin.
- Scheid de huid van het onderhuidse weefsel met behulp van getande tang en gesloten schaar. Bevestig de bovenste uiteinden van de huid met naalden.
- Maak een incisie in de buikwand en scheid de lever van het middenrif. Pluk het membraan voorzichtig met een gesloten schaar en snijd vervolgens het membraan.
- Maak een mediale snede van de thorax en nek bindweefsels totdat de luchtpijp zichtbaar is.
- Voer een zijden draad onder de luchtpijp en maak een chirurgische knoop met behulp van twee tangen.
OPMERKING: U kunt ook tandzijde gebruiken in plaats van zijden draad.- Trek voorzichtig aan de draad en snijd de longen met een schaar af van het bindweefsel. Houd de schaar loodrecht op de tafel.
- Doe de longen in de reageerbuis van 50 ml met 2% paraformaldehyde. Laat draaduiteinden buiten de buis, zet het deksel strak en draai de buis om om de longen te bedekken met paraformaldehyde. Houd de longen 's nachts bij 4 °C.
- Ontleed de longlobben van het hart en elkaar met een scalpel.
- Leg de longlobben in een 24 putplaat, waarbij elke kwab in een aparte put. Was de longlobben in 1 ml Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) pH 7,4, 5 keer gedurende 1 uur elk op een shaker bij 150 tpm.
- Vervang 1 ml TBS door 1 ml van de blokkeerbuffer (1% Triton X 100, 5% melkpoeder in TBS) en laat het monster 's nachts bij kamertemperatuur op een shaker staan.
- Vervang de blokkeerbuffer door 1 ml streptavidine-488 nm fluorchrome conjugaat verdund 1:30 in TBS. Laat het monster minstens 72 uur bij kamertemperatuur op een shaker (150 tpm) staan.
- Was het monster 5 keer gedurende 1 uur elk in 1 ml TBS bij kamertemperatuur op een shaker (150 tpm). Breng het monster over naar de nieuwe putten en bedek het met 2% paraformaldehyde 's nachts bij 4 °C voor postfixatie.
3. Muis longkwab optische clearing
- Plaats het monster in de glazen fles van 5 ml gevuld met 3 ml methanol-wateroplossing van 50% en zet het gedurende 1 uur op kamertemperatuur op de monstermixer.
- Vervang 3 ml 50% methanol door 3 ml 100% methanol en zet het gedurende 2 uur op de monstermixer. Bereid een 1:2 v/v mengsel van benzylalcohol en benzylbenzoaat (BABB) in een totaal volume van 1 ml.
- Breng het monster over op een plaat van 24 put en dek af met 1 ml BABB-mengsel gedurende ten minste 30 minuten. Laat het monster niet lang in BABB staan; BABB kan de kunststof plaat beschadigen en het monster te stijf maken.
- Plaats het monster in de celbeeldkamer met afdekglas. Het monster is klaar voor beeldvorming.
4. Beeldvorming van de longkwab van de muis met CLSM
- Zet het microscoopsysteem aan. Open de microscoopsoftware. Schakel het zendlampje in op het tabblad Zoeken. Selecteer de 10x doelstelling.
OPMERKING: Gebruik voor een meer gedetailleerde analyse de doelstelling 20x, maar dit verhoogt de tijd van het experiment en de bestandsgrootte van de afbeelding. - Plaats de kamer met het monster in de afdekschuifhouder. Plaats de houder op het XY-podium boven het doel. Centreer het monster met behulp van de XY-besturingselementen van het werkgebied boven op het doel. Gebruik het zendlampje en het oculair om het monster Z-vlak handmatig te vinden.
- Schakel de software over naar het tabblad Acquisitie. Selecteer CLSM λ-mode. Zet de lasers van 488 nm en 561 nm aan. Selecteer de dichroïsche spiegel van 488/561 nm. Verander het spectrale bereik van de detector in 490-695 nm. Stel het laservermogen in op het juiste bereik (10-50 μW). Stel de detectorversterking in tussen 750-900 bereik.
OPMERKING: Hogere versterkingsinstellingen zijn ongewenst vanwege ruis. - Verklein het pinhole tot 1 Airy unit door op 1 AU knop te klikken. Stel de pixelresolutie in op 512 × 512 pixels.
- Schakel de Z-stack modus in. Start Live Imaging. Selecteer het brandpuntsvlak waarin beide kleurstoffen zichtbaar zijn.
OPMERKING: Pas indien nodig het laservermogen aan om de helderheid van de twee fluorescerende kleurstoffen te normaliseren. Gebruik galerij- en eenkanaalsmodus om uitknippen te voorkomen en de fluorescentie-intensiteit nauwkeurig aan te passen. - Vouw het verschenen Z-stackvenster uit. Gebruik het scherpstelwiel en zoek het laagste vlak van het monster. Gebruik de knop Eerste in het Z-stack-deelvenster. Beweeg het brandpuntsvlak naar boven om de bovengrens van het monster te vinden en sla de positie op met de laatste knop. Controleer de weergave van de monsterdiepte in het Z-stackvenster.
OPMERKING: Een weergave van de monsterdiepte verschijnt in het Z-stackvenster nadat de eerste en de laatste posities zijn gekozen. - Plaats het objectief met behulp van het scherpstelwiel aan de onderkant van het monster, door naar de Z-stack ruit te kijken. Dit is ongeveer 20 μm van de bodem van het monster.
- Schakel de Z-stackmodus uit en schakel de tegelscanmodus in. Verkrijg de afbeelding met een geschikt aantal tegels voor de grootte van het monster. 5 × 5 tegels zijn een goed uitgangspunt.
- Pas het aantal tegels en de XY-positie van het monster aan totdat de hele long in de betegelde afbeelding past. Controleer opnieuw de juistheid van de Z-stackposities met de nieuw verkregen XY-positie in het midden van het monster.
- Schakel de modi Z-stack en Tile Scan in. Stel de Z-stap (in het Z-stapelvenster) in op 5 μm. Stel scansnelheid in op 6. Schakel de functie Automatisch opslaan in. Schakel de optie Afzonderlijke tegels opslaan in. Geef het bestand een naam. Druk op de knop Experiment starten.
- Controleer of het experiment de toegewezen tijd op de microscoop niet overschrijdt; zo ja , pas dan de snelheid aan.
OPMERKING: De geschatte bestandsgrootte is meer dan 10 Gb; zorg ervoor dat er voldoende ruimte op de harde schijf is.
5. Spectrale unmixing en stiksels
- Gebruik de software voor de eerste beeldverwerking. Voor spectrale unmixing selecteert u de optie Unmixing. Selecteer twee regio's die overeenkomen met de streptavidin/airways en conidia om de spectra uit de afbeelding te verkrijgen. Klik op Uitmenging starten.
OPMERKING: U kunt ook de bestaande spectra gebruiken voor fluorchromen van 488 en 594 nm. - Open het bestand voor de beeldverwerking en selecteer het tabblad Verwerking. Selecteer geometrisch en stikselsin de sectie Methoden . Selecteer in de sectie Parameter de optie Nieuwe uitgang en markeer de optie Zekeringstegels. Gebruik de referentiemodus met het geselecteerde kanaal dat overeenkomt met de luchtwegfluorescentie. Pas de stiksels toe door op Toepassente klikken.
6. Beeldverwerking: oppervlakteweergave
- Open de afbeelding als een 3D-weergave overtreffen. Maak een luchtwegoppervlak met de optie Oppervlak voor het kanaal dat is gebruikt voor de luchtwegvisualisatie. Kies de parameter Smoothing van 10 μm.
OPMERKING: Kies ook de automatische drempelwaarde. - Inspecteer het oppervlak visueel. Kies de drempels om het signaal te verminderen. Verwijder de oppervlakken van pleura en vaten.
- Maak een masker voor het luchtwegoppervlak met de opties Alles bewerken en maskeren. Selecteer het luchtwegkanaal en stel Voxels buiten het oppervlak in op 0,001.
- Sla het bestand met het luchtwegmasker op als een TIFF-serie in de map. Sla het bestand met het conidia-kanaal op als een TIFF-serie in de afzonderlijke map.
7. Beeldverwerking: maskercorrectie
- Open het bestand met het luchtwegmasker in een open-source platform voor biologische-beeldanalyse17 als een 8-bits afbeelding. Maak de afbeelding binair door te klikken op Proces | Binaire | Binair maken.
OPMERKING: Corrigeer indien nodig het masker: verwijder de overmatige oppervlakken met behulp van de polygoonselectie en het tabblad Verwijderen. U kunt ook het gereedschap Overstromingsvulling gebruiken. - Teken de ontbrekende oppervlakken met behulp van meerdere keren Dilate (3D): klik op Plug-ins | | verwerken Verwijden (3D). Vul de gaten door op Proces | te klikken Binaire | Vul gaten. Gebruik selectie- en ROI-managerinterpolatie om de resterende gaten in het masker handmatig te vullen. Verschillende Erode (3D) opties toepassen (Plugins | | verwerken Eroderen (3D)) om de dikte van het masker opnieuw te bemonsteren.
OPMERKING: Maak macro's met behulp van Plug-ins | Macro's opties voor meerdere Dilate (3D) en Erode (3D) herhalingen.
Zorg ervoor dat het aantal Erode (3D) gelijk is aan het aantal Dilate (3D) toepassingen. - Sla het masker op in een nieuwe map als een TIFF-serie.
8. Conidia kwantitatieve analyse
- Open de app in het programmeer- en numerieke computerplatform: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
- Druk op de knop Bestanden toevoegen. Selecteer de map luchtwegmasker en de map conidia.
- Stel een aangepaste drempel tussen 0 en 1 in. Druk op de KNOP OK.
- Sla de uitvoertabel op in het aangepaste .xls bestand.
- Analyseer de gegevens met software voor statistische analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het bovenstaande protocol werd het 3D-beeld met de luchtwegen en A. fumigatus conidia in de longkwab van een muis verkregen (figuur 1A). Streptavidin (dat werd gebruikt voor luchtwegvisualisatie) gelabeld bronchiën en bronchiolen15. Bovendien worden de grote vaten, die gemakkelijk te onderscheiden zijn van de luchtwegen door hun morfologie, en pleura gevisualiseerd in het luchtwegkanaal (Figuur 1A-C). De creatie van het luchtwegoppervlak en het masker maakte het mogelijk het vaartuig en de pleuraprojecties in het luchtwegkanaal te verwijderen; de integriteit van het luchtwegoppervlak wordt echter vernietigd als gevolg van het zwakke signaal van streptavidin in verschillende bronchiale takken (figuur 1B-C). De verdere verwerking van het luchtwegmasker maakt het mogelijk de ontbrekende fragmenten te repareren (figuur 1D).
De verdeling van A. fumigatus conidia in de longen van muizen werd geschat met behulp van de linker of rechter superieure longlobben op verschillende tijdstippen na conidia toepassing. Voor de juiste superieure longkwab bestaat het beeld uit ongeveer 30 tegels en ongeveer 250 Z-stacks. Na het borduren had het beeld dat werd verkregen met de resolutie 512 × 512 een beeldgrootte van 2360 × 2815 pixels en de grootte van één pixel is 2,77 μm × 2,77 μm, wat vergelijkbaar is met de grootte van A. fumigatus conidia dat is 2-3,5 μm9.
Het vergrote beeld van het distale luchtweggebied toont aan dat de detectie van de precieze locatie van conidia (binnen of buiten de bronchiale takken) vrij moeilijk is vanwege de complexiteit van het beeld en de kleine omvang van conidia in verhouding tot de grootte van de luchtwegen (Figuur 2A). Nauwkeurig onderzoek wees uit dat conidia zich zowel binnen als buiten de bronchiale takken bevonden (figuur 2B-C).
De drempelinstellingen van het conidiakanaal hebben een grote invloed op het resulterende aantal conidia (figuur 2B-C). Om de onbevooroordeide kwantitatieve analyse te maken, hebben we een app ontwikkeld in het programmeer- en numerieke computerplatform waarmee het aantal conidia binnen en buiten het luchtwegmasker kan worden geschat, waardoor de handmatige drempelinstelling wordt vermeden. De app werkt op basis van het volgende algoritme. Ten eerste wordt het conidia-kanaal gesegmenteerd in een binaire 3D-stapel afbeeldingen met een optimale drempelwaarde. Zoals hierboven beschreven, maakt de geselecteerde beeldresolutie het mogelijk om één conidium als één pixel te identificeren. Het gebruik van streptavidin voor luchtwegetikettering maakt visualisatie van bronchiën mogelijk, maar niet alveoli15. Daarom worden conidia die in bronchiën verblijven gedefinieerd als conidia-pixels in het luchtwegenmasker, terwijl conidia in longblaasjes worden gedefinieerd als conidia-pixels buiten het luchtwegmasker. Gezien dit, in de volgende stap van het algoritme, wordt een binaire EN bewerking uitgevoerd voor de luchtwegmaskerafbeelding en de conidia-afbeelding om pixels van conidia te extraheren die zich in bronchiën bevinden. Op dezelfde manier worden de resterende conidia-pixels geëxtraheerd om het aantal conidia in longblaasjes te verkrijgen. Het resulterende percentage conidia in bronchiën en longblaasjes ten opzichte van de totale hoeveelheid conidia in de long wordt weergegeven in het staafdiagram en de uitvoertabel van de gebruikersinterface van de app.
Met behulp van deze benadering werd de kwantitatieve analyse van de conidiaverdeling in de luchtwegen van muizen uitgevoerd gedurende het tijdspunt van 6 uur na conidiatoepassing (figuur 2D). De gegevens suggereren dat bij orofaryngeale toepassing de meerderheid van conidia de alveolaire ruimte penetreert en zich daar aan het begin van de inflammatoire immuunrespons bevindt.
Figuur 1. Het principe van luchtwegbeeldverwerking. (A) 3D-beeld van de rechter superieure longkwab van een muis, 24 uur na conidia-toepassing met biotinerijke structuren (streptavidin, wit) en A. fumigatus conidia (magenta). Steptavidine-positieve grote vaten worden aangegeven met fijne pijlen. (B,C) Het oppervlak (groen) en het masker (oranje) voor de luchtwegen. De ontbrekende luchtwegfragmenten in het oppervlak en het masker worden aangegeven met pijlen; de overmatige structuren met pijlpunten. Schaalbalk is 1000 μm. (D) Het luchtwegmasker na de correcties. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Conidia beeldverwerking en kwantitatieve analyse. (A) Vergrote afbeelding van de distale luchtwegen (Streptavidin, grijze tinten) en A. fumigatus conidia (magenta) die worden weergegeven in figuur 1A. Schaalbalk is 300 μm B, C. Vergrote afbeelding willekeurig verpakt op (A) wordt weergegeven als een Z-segment met een hoge drempel (B) en een lage drempelwaarde (C). Conidia binnen de luchtweg worden aangegeven met pijlen, en buiten met pijlpunten. Schaalbalk is 150 μm. (D) Kwantitatieve analyse van conidia in de bronchiale takken en de alveolaire ruimte. De gegevens worden weergegeven als het mediaan- en interkwartielbereik voor 4 muizen, 6 uur na ontvangst van A. fumigatus conidia. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D-beeldvorming van het hele orgaan maakt het mogelijk om de gegevens te verkrijgen zonder dissectie van het specimen, wat van groot belang is voor het onderzoeken van de ruimtelijke aspecten van de anatomische verdeling van de ziekteverwekker in het organisme. Er zijn verschillende technieken en modificaties van weefsel optische clearing die helpen om de laser licht verstrooiing te overwinnen en maken hele-orgaan beeldvorming15,16,18,19. Een van de aangepaste weefselopruimingsbenaderingen bestaat uit op methanol gebaseerde weefseluitdroging en delipidatie gevolgd door optische clearing met BABB. De aanpak is meer dan 100 jaar geleden ontwikkeld en heeft verschillende aanpassingen. In ons werk gebruiken we de eenvoudigste modificatie die door Scott c.s. werd beschreven. 15 Een dergelijke aanpak is optimaal voor gebruik met fluorescerend gelabelde pathogenen. Bovendien hebben fluorchromen met hoge fotostabiliteit de voorkeur voor langdurige beeldvorming. Helaas is visualisatie van transgene TdTomato A. fumigatus conidia niet mogelijk met deze methode, vanwege de hoge gevoeligheid van TdTomato voor BABB (gegevens niet weergegeven). De aanpak die we hier beschrijven, maakt dus een succesvolle detectie van rustende of vaste pathogenen mogelijk, maar kan niet worden gebruikt voor beeldvorming van groeiende A. fumigatus conidia of hyphae. Bovendien heeft de immunohistochemische kleuring van het monster met de bindingsstoffen met hoge affiniteit de voorkeur. Zo werden we ook geconfronteerd met problemen bij het toepassen van de fluorescerend gelabelde antilichamen om vaten en lymfeklieren in longkwabmonsters met een hele berg te visualiseren. Scott et al. 15 gevisualiseerde zenuwvezels met behulp van tweestapskleuring met antilichamen tegen PGP 9.5. Dit geeft aan dat sommige antilichamen kunnen worden gebruikt voor kleuring met de volgende optische clearing met BABB. We verloren ook het fluorescerende signaal van de 0,1 μm fluorescerende latexdeeltjes na BABB-clearing, terwijl het gebruik van clearing-enhanced 3D (Ce3D) clearingoplossing18 geen invloed had op het fluorescerende signaal van de deeltjes.
In de huidige aanpak gebruiken we streptavidin om de luchtwegen te labelen. Streptavidin bindt endogene biotine die wordt beschouwd als uitgedrukt in Clara-cellen (en de alveolaire type II epitheelcellen in mindere mate)20. Omdat Clara-cellen (ook bekend als Club-cellen) bij afwezigheid van ontsteking in de bronchiën en bronchiolen zitten, maar niet in het alveolaire compartiment, visualiseert streptavidin-kleuring alleen bronchiale takken. Daarom werden in de huidige benadering alle conidia buiten de luchtwegen met streptavidin-label bepaald als zijnde gelegen in de alveolaire ruimte. Voor de nauwkeurigere detectie van de conidia-locatie moeten enkele andere luchtwegmarkeringen, zoals SOX9, worden gebruikt3. In het geval dat het gebruik van antilichamen noodzakelijk is Ce3D of driedimensionale beeldvorming van oplosmiddelgeklaarde organen (3DISCO)zijn 19 technieken geschikter dan optische clearing op basis van BAAB. Babb optische clearing is echter de meest eenvoudige en tijdrovende aanpak, en daarom is de meest voordelige voor de vooraf fluorescerend gelabelde conidia detectie in de gemarkeerd met streptavidin luchtwegen.
3D-beeldvorming van de muislongen kan ook worden uitgevoerd met behulp van optische projectietomografie geïntegreerde microscopie3. Vanwege de beperking in de resolutie van tomografie is CLSM echter meer geschikt voor de gelijktijdige beeldvorming van de luchtwegen en 3 μm conidia. In ons geval wordt een enkel conidium gezien als één pixel. De verwerking van dergelijke beelden maakte kwantificering van conidia binnen en buiten de bronchiale takken mogelijk. De methode kan ook worden toegepast om anatomische conidiaverdeling in de immunocompetente en immunocompromitteerde muizen te vergelijken. De aanpak kan ook worden gebruikt om de kinetiek van de conidia-eliminatie uit de luchtwegen van muizen te schatten. Bovendien, de combinatie van de aanpak van de hele luchtwegmorfometrie die werd ontwikkeld door Scott et al. 15 met het algoritme voor onbevooroordede conidia kwantitatieve analyse kan nuttig zijn in de precieze locatie van A. fumigatus conidia en andere deeltjes van vergelijkbare grootte in verschillende generaties van de bronchiale boom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs melden geen belangenconflicten in dit werk.
Acknowledgments
De auteurs danken prof. Sven Krappmann (Universitair Ziekenhuis Erlangen en FUA Erlangen-Nürnberg, Duitsland) voor het leveren van de Aspergillus fumigatus conidia stam AfS150. De auteurs bedanken MIPT Press Office. V.B. erkent het Ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs van de Russische Federatie (#075-00337-20-03, project FSMG-2020-0003). Het werk met betrekking tot A. fumigatus conidia imaging en quantification werd ondersteund door RSF nr. 19-75-00082. Het werk met betrekking tot beeldvorming van de luchtwegen werd ondersteund door RFBR nr. 20-04-60311.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 - 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With ground-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
- O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
- Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).
- Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung. Nature Communications. 5, (2014).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).
- Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E.
- Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).
- Patel, V. I., Metcalf, J. P. Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).
- Bogorodskiy, A. O., et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Frontiers in Immunology. 11, (2020).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen. PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).
- Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis. Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).
- Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).
- Tochigi, N., et al. Histopathological implications of Aspergillus infection in lung. Mediators of Inflammation. 2013, (2013).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA. PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).
- Shevchenko, M. A., et al. Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice. Journal of Immunology Research. 2018, 5379085 (2018).
- Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).
- Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J Vis Exp. (89), e51382 (2014).
- Kuhn, C. Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells. Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).
