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Methodenartikel

Tumortransplantation zur Beurteilung der Dynamik tumorinfiltrierender CD8+ T-Zellen in Mäusen

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DOI:

10.3791/62442

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12. Juni 2021

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1Institute of Immunology, Third Military Medical University, 2Guanghua School of Stomatology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology, Stomatological Hospital, Sun Yat-Sen University, 3Shigatse Branch, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, 4Department of Emergency Medicine, Southwest Hospital, Third Military Medical University, 5Cancer Center, The General Hospital of Western Theater Command

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

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Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Tumortransplantationsprotokoll zur Charakterisierung von tumorinhärenten und peripherieabgeleiteten tumorinfiltrierten Lymphozyten in einem Maustumormodell vor. Die spezifische Verfolgung des Zustroms von Empfänger-abgeleiteten Immunzellen mit Durchflusszytometrie zeigt die Dynamik der phänotypischen und funktionellen Veränderungen dieser Zellen während der Antitumor-Immunantwort.

Zusammenfassung

T-Zell-vermittelte Immunität spielt eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort gegen Tumore, wobei zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) die führende Rolle bei der Ausrottung von Krebszellen spielen. Die Entstehung und der Nachschub von Tumorantigen-spezifischen CD8+ T-Zellen innerhalb der Tumormikroumgebung (TME) bleiben jedoch unklar. Dieses Protokoll verwendet die B16F10-OVA-Melanomzelllinie, die stabil das Surrogat-Neoantigen, das Ovalbumin (OVA) und die transgenen OT-I-Mäuse der TCR exprimiert, in der über 90% der CD8+ T-Zellen spezifisch das von der OVA abgeleitete Peptid OVA257-264 (SIINFEKL) erkennen, das an das MHC-Molekül (Major Histocompatibility Complex) der Klasse I H2-Kb gebunden ist. Diese Merkmale ermöglichen die Untersuchung von Antigen-spezifischen T-Zell-Reaktionen während der Tumorgenese.

Durch die Kombination dieses Modells mit der Tumortransplantationschirurgie wurden Tumorgewebe von Spendern in tumorangepasste syngene Empfängermäuse transplantiert, um den Zustrom von vom Empfänger abgeleiteten Immunzellen in transplantiertes Spendergewebe genau zu verfolgen, was die Analyse der Immunantworten von tumorinhärenten und peripheriebedingten antigenspezifischen CD8+ ermöglicht. T-Zellen. Es wurde ein dynamischer Übergang zwischen diesen beiden Populationen festgestellt. Insgesamt hat dieses experimentelle Design einen weiteren Ansatz zur präzisen Untersuchung der Immunantworten von CD8+ T-Zellen in TME geliefert, was ein neues Licht auf die Tumorimmunologie werfen wird.

Einleitung

CD8+ T-Zell-vermittelte Immunantwort spielt eine zentrale Rolle bei der Kontrolle des Tumorwachstums. Während der Tumorentstehung werden naive CD8+ T-Zellen bei Antigenerkennung in einer MHC-Klasse I-eingeschränkten Weise aktiviert und differenzieren anschließend in Effektorzellen und infiltrieren in Tumormasse 1,2. Innerhalb der Tumormikroumgebung (TME) treiben jedoch eine längere Antigenexposition sowie immunsuppressive Faktoren infiltrierte tumorspezifische CD8+ T-Zellen in einen hyporesponsiven Zustand, der als "Erschöpfung" bezeichnet wird3. Erschöpfte T-Zellen (Tex) unterscheiden sich von Effektor- oder Gedächtnis-T-Zellen, die bei akuten Virusinfektionen sowohl transkriptionell als auch epigenetisch erzeugt werden. Diese Tex-Zellen zeichnen sich hauptsächlich durch die anhaltende und erhöhte Expression einer Reihe von hemmenden Rezeptoren sowie den hierarchischen Verlust von Effektorfunktionen aus. Darüber hinaus führt die beeinträchtigte proliferative Kapazität erschöpfter CD8+ T-Zellen zu einer abnehmenden Anzahl tumorspezifischer T-Zellen, so dass die verbleibenden CD8+ T-Zellen innerhalb der TME kaum eine ausreichende schützende Immunität gegen Tumorprogressionbieten können 3. Daher ist die Aufrechterhaltung oder Verstärkung von intratumoralen antigenspezifischen CD8+ T-Zellen für die Tumorrepression unverzichtbar.

Darüber hinaus wird angenommen, dass die Therapie der Immun-Checkpoint-Blockade (ICB) Tex in Tumoren wiederbelebt, indem sie die T-Zell-Infiltration und damit die T-Zell-Anzahl erhöht und die T-Zell-Funktionen verjüngt, um die Tumorrepression zu verstärken. Die weit verbreitete Anwendung der ICB-Behandlung hat die Krebstherapielandschaft verändert, wobei eine beträchtliche Untergruppe von Patienten ein dauerhaftes Ansprechen aufweist 4,5,6. Dennoch spricht die Mehrheit der Patienten und Krebsarten nicht oder nur vorübergehend auf ICB an. Eine unzureichende T-Zell-Infiltration in der TME wurde als einer der zugrunde liegenden Mechanismen postuliert, die für den ICB-Widerstand verantwortlich sind 7,8.

Mehrere Studien haben die Heterogenität von tumorinfiltrierenden CD8+ T-Zellen (TILs) sowohl bei Patienten als auch bei Mausmodellen 9,10,11,12 gezeigt. Es wurde bestätigt, dass eine Untergruppe von CD8+ T-Zellen, die T-Zell-1 (TCF1) in einer Tumormasse exprimieren, stammzellähnliche Eigenschaften aufweist, die weiter zu terminalen erschöpften T-Zellen führen könnten und für den Proliferationsausbruch nach ICB-Therapie 12,13,14,15,16,17,18,19,20 verantwortlich sind. 21,22 Es wurde jedoch nachgewiesen, dass nur ein kleiner Teil der antigenspezifischen TCF1 + CD8 + T-Zellen in der TME existiert und einen erweiterten Pool differenzierter Nachkommen als Reaktion auf ICB23,24,25,26 erzeugt. Ob die begrenzte Größe dieser Population ausreicht, um die Persistenz zytotoxischer T-Lymphozyten (CTLs) zur Kontrolle der Tumorprogression sicherzustellen, bleibt unbekannt, und ob es zu einer Auffüllung aus peripheren Geweben kommt, bedarf weiterer Untersuchungen. Darüber hinaus deuten neuere Forschungen auf die unzureichende Wiederbelebungskapazität vorbestehender tumorspezifischer T-Zellen und das Auftreten neuartiger, zuvor nicht existierender Klonotypen nach einer anti-programmierten Zelltodprotein-1-Behandlung hin. Dies deutet darauf hin, dass die Reaktion der T-Zellen auf die Checkpoint-Blockade auf den neuen Zustrom eines ausgeprägten Repertoires von T-Zell-Klonenzurückzuführen sein könnte 27. Zusammen mit dem Vorhandensein von nicht tumorreaktiver zytotoxischer T-Zellfraktion in der TME führten diese Ergebnisse zur Etablierung eines Tumorallotransplantatmodells, um die Rolle von peripherieabgeleiteten CD8 + T-Zellen zu untersuchen11.

Bisher waren verschiedene Arten der Tumorimplantation sowie des adoptiven Transfers von Immunzellen im Bereich der Tumorimmunologieweit verbreitet 28. TILs, mononukleäre Zellen im peripheren Blut und tumorreaktive Immunzellen, die aus anderen Geweben stammen, können mit diesen Methoden gut charakterisiert werden. Bei der Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen systemischer und lokaler Antitumorimmunität scheinen diese Modelle jedoch unzureichend zu sein, um die Interaktionen zwischen Immunzellen, die aus der Peripherie stammen, und der TME zu untersuchen. Hier wurde Tumorgewebe von Spendern in tumorangepasste Empfängermäuse transplantiert, um den Zustrom von Empfänger-abgeleiteten Immunzellen genau zu verfolgen und die von Spendern abgeleiteten Zellen in der TME gleichzeitig zu beobachten.

In dieser Studie wurde ein murines syngenes Modell des Melanoms mit der B16F10-OVA-Melanomzelllinie etabliert, die das Surrogat Neoantigen Ovalbumin stabil exprimiert. TCR-transgene OT-I-Mäuse, bei denen über 90% der CD8+ T-Zellen spezifisch das von OVA abgeleitete Peptid OVA257-264 (SIINFEKL) erkennen, das an das MHC-Molekül H2-Kb der Klasse I gebunden ist, ermöglichen die Untersuchung antigenspezifischer T-Zell-Antworten, die im B16F10-OVA-Tumormodell entwickelt wurden. Durch die Kombination dieses Modells mit der Tumortransplantation wurden die Immunantworten von tumorinhärenten und peripheriebasierten antigenspezifischen CD8+ T-Zellen verglichen, um einen dynamischen Übergang zwischen diesen beiden Populationen zu zeigen. Insgesamt hat dieses experimentelle Design einen weiteren Ansatz zur präzisen Untersuchung der Immunantworten von CD8 + T-Zellen in der TME geliefert, was ein neues Licht auf die Dynamik tumorspezifischer T-Zell-Immunantworten in der TME wirft.

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Protokoll

Alle Mausversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutional Animal Care and Use Committees der Third Military Medical University durchgeführt. Verwenden Sie 6-8 Wochen alte C57BL/6-Mäuse und naive transgene OT-I-Mäuse mit einem Gewicht von 18-22 g. Verwenden Sie sowohl männlich als auch weiblich ohne Randomisierung oder "Verblindung".

1. Herstellung von Medium und Reagenzien

  1. Bereiten Sie das Zellkulturmedium D10 wie zuvor beschrieben29 vor, indem Sie 10% fetales Rinderserum (FBS), 100 E/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin in das modifizierte Eagle-Medium von Dulbecco geben.
  2. Bereiten Sie das Zellkulturmedium R10 vor, indem Sie RPMI-1640 mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin ergänzen.
    HINWEIS: Die Kulturmedien D10 und R10 können bei Lagerung bei 2-4 °C mindestens 2 Wochen lang steril und stabil bleiben.
  3. Bereiten Sie den FACS-Puffer (Fluorescence-Activated Cell Sorting) vor, indem Sie 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 2% FBS und 0,01% Natriumazid ergänzen.
    HINWEIS: Mit der Zugabe von Natriumazid kann FACS Buffer monatelang bei 2-4 °C gelagert werden.
  4. Bereiten Sie den Puffer für die Lyse der roten Blutkörperchen (RBL) vor, indem Sie 155 mM NH4Cl, 10 mMKHCO 3 und 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in doppelt destilliertes Wasser geben und den pH-Wert auf 7,3 einstellen.
    HINWEIS: Der RBL-Puffer ist bei Raumtemperatur (RT) bis zu 3 Monate stabil.
  5. Bereiten Sie den MACS-Puffer (Magnetic-Activated Cell Sorting) vor, indem Sie PBS mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA ergänzen.
    HINWEIS: Die Lösung sollte durch einen 0,22-μm-Filter geleitet werden, nachdem das Reagenz gelöst und in Asepsis konserviert wurde.
  6. Es wird eine Arbeitslösung aus 2,2,2-Tribromethanol hergestellt.
    1. 2,5 g 2,2,2-Tribromethanol werden in 5 ml Tert-Amylalkohol (2-Methyl-2-butanol) gelöst. Rühren Sie einen dampfbadenden Vibrator mit konstanter Temperatur bei 180 U / min, 40 ° C über Nacht ein.
    2. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 μm Filter in einen sterilen Behälter. Fügen Sie doppelt destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 200 ml hinzu und mischen Sie es gründlich und kontinuierlich, bis die Lösung klar und transparent wird.
    3. Der pH-Wert der Lösung wird auf 7,3 bestimmt und eingestellt. Wickeln Sie den Behälter vollständig mit Aluminiumfolie um, um Licht auszuschließen, und lagern Sie ihn bei 4 ° C.
      HINWEIS: Die Endkonzentration der Arbeitslösung von 2,2,2-Tribromethanol beträgt 12,5 mg/ml. Eine konzentriertere Lösung wird nicht empfohlen, da das Material bei höheren Konzentrationen reizend ist. Testen Sie den pH-Wert der Arbeitslösung vor jeder Verwendung und verwerfen Sie ihn, wenn der pH-Wert weniger als 5 beträgt.

2. Herstellung der B16F10-OVA-Zellsuspension

HINWEIS: Die Zellkultur sollte in einer Biosicherheitshaube unter strengen aseptischen Bedingungen durchgeführt werden.

  1. Auftauen und Kultivieren einer Durchstechflasche mit B16F10-OVA-Zellen mit D10 in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5% CO2.
  2. Wenn die Zellen den Zusammenfluss von etwa 80-90% erreichen, subkulturieren die Zellen.
    1. Entfernen Sie das Kulturmedium mit einem Pipetor und spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS ab.
      HINWEIS: Fügen Sie PBS nicht gewaltsam gegen die adhärenten Zellen im Kolben oder in der Zellkulturschale hinzu. Pipettieren Sie stattdessen das PBS in Richtung einer Seitenwand oder fügen Sie es tropfenweise in die Flasche oder Schale hinzu.
    2. Entfernen Sie das PBS und geben Sie 1-2 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung in den Kolben oder die Schale. Schaukeln Sie es hin und her, um die gesamte Zelloberfläche abzudecken. Legen Sie den Kolben oder die Schale für ~ 1 min oder bei RT in einen Inkubator bei 37 ° C, bis sich die Zellen lösen.
      HINWEIS: Ein inverses Mikroskop kann verwendet werden, um zu überprüfen, ob sich die Zellen gelöst haben.
    3. Fügen Sie frisches D10 hinzu, um die Trypsinisierung zu stoppen. Pipettieren Sie die Suspension nach oben und unten, um sicherzustellen, dass alle Zellen vom Kolben oder der Schalenoberfläche dissoziiert werden.
    4. Übertragen Sie die B16F10-OVA-Zellsuspension in ein 15 ml konisches Rohr. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 125 × g für 5-7 min bei RT.
    5. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet mit D10. Die B16F10-OVA-Zellsuspension wird in einen neuen Kolben oder eine neue Zellkulturschale mit D10 dosiert und in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
  3. Am Tag der Tumorimplantation werden B16F10-OVA-Zellen geerntet, die zu ~90% konfluent sind, wie in den Schritten 2.2.1 bis 2.2.4 beschrieben. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet mit 1 ml PBS.
  4. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer unter Verwendung von 0,4% Trypanblau. Stellen Sie die Zelldichte auf 1 ×10 6 Zellen pro 100 μL ein, indem Sie PBS hinzufügen. Halten Sie die Zellen auf Eis.

3. Eileitertumor-Implantation von B16F10-OVA-Zellen in die Leistenregion von Mäusen

  1. Verwenden Sie 6-8 Wochen alte C57BL/6-Mäuse mit einem Gewicht von 18-22 g. Verwenden Sie sowohl männlich als auch weiblich ohne Randomisierung oder "Verblindung".
  2. Entnehmen Sie 100 μL der vorbereiteten B16F10-OVA-Zellsuspension in eine 1 ml Tuberkulinspritze. Klopfen Sie auf den Lauf, um Blasen nach oben zu bewegen, und drücken Sie vorsichtig den Kolben, um Luftblasen zu entfernen.
  3. Halten Sie die Maus zurück und entblößen Sie ihren Bauch. Drücken Sie das linke Hinterbein mit dem kleinen Finger, um die Haut der linken Leistengegend zu straffen.
  4. Entfernen Sie die Haare der Maus mit einem elektrischen Rasierer vom linken Unterbauch. Verwenden Sie Baumwolle, die in 75% Ethanol getränkt ist, um den hinteren Quadranten des linken Bauches zu reinigen.
  5. Halten Sie die Spritze in einem sehr flachen Winkel (0-15 °) mit der Fase der Nadel nach oben, führen Sie sie an der Stelle des linken Oberschenkels ein und bewegen Sie sich 0,5-1 cm durch das Unterhautgewebe in die Leistengegend.
  6. Ziehen Sie den Kolben vor der Injektion zurück. Wenn es einen Unterdruck gibt, drücken Sie den Kolben vollständig und beobachten Sie einen kleinen Bolus (Bildung einer Flüssigkeitstasche) in der Unterhaut.
    HINWEIS: Wenn Blut in die Nadelnabe zurückgezogen wird, ziehen Sie es zurück und versuchen Sie es erneut an einer anderen Stelle.
  7. Entfernen Sie die Nadel nach der Injektion und entsorgen Sie sie entsprechend. Lassen Sie die Maus los und setzen Sie sie wieder in den Käfig.
  8. Messen Sie die Tumorgröße an den Tagen 6-8 mit einer Vernier-Skala nach der B16F10-OVA-Implantation. Wählen Sie Mäuse mit einem Tumor mit einem Durchmesser von ~ 3 mm (Mungobohnengröße) aus und teilen Sie sie gleichmäßig und zufällig in zwei Gruppen ein.
    HINWEIS: Mäuse mit Tumoren ähnlicher Größe werden nach dem Zufallsprinzip als Spender- und Empfängermäuse zugewiesen; Das abgestimmte Tumorgewebe, das von Spendermäusen herausgeschnitten wird, wird in die Empfängermäuse transplantiert. Darüber hinaus sollten nicht operierte Kontrollen und scheinoperierte Kontrollen einbezogen werden, um die Auswirkungen einer Operation auf den adoptiven Zelltransfer und auf den allgemeinen Gesundheitszustand von Mäusen zu bewerten. Somit dient eine Gruppe tumortragender Mäuse als nicht operierte Kontrollen, die entweder CD45.1+CD45.2+ oder CD45.1+ OT-I-Zellen, aber keine Operation erhalten. Die andere Gruppe von Mäusen dient als scheinoperierte Kontrollen, die entweder CD45.1 + CD45.2 + oder CD45.1 + OT-I-Zellen und anschließende Operationen ähnlich der experimentellen Gruppe, aber keine Allotransplantattransplantation erhalten.

4. Adoptiver Transfer von kongenisch markierten OT-I-T-Zellen in tumortragende Mäuse

  1. Am Tag vor dem Transfer 4 mg Cyclophosphamid gelöst in 200 μL PBS über intraperitoneale Injektion an jede tumortragende Maus verabreichen.
    HINWEIS: Die Behandlung mit Cyclophosphamid zielt darauf ab, Lymphopenie im Wirt zu induzieren, die "Raum" für übertragene Zellen schafft, ihr Überleben fördert und zu lymphatischen Organen führt, um effizient zu funktionieren.
  2. Verwenden Sie naive transgene OT-I-Mäuse mit ausgeprägten kongenen Markern (6-8 Wochen alt, 18-22 g, das gleiche Geschlecht wie die tumortragenden Mäuse). Verwenden Sie CD45.1+ OT-I-Mäuse und CD45.1+CD45.2+ OT-I-Mäuse, um OVA257-264 antigenspezifische T-Zellen adoptiv in tumortragende Spender- bzw. Empfängermäuse zu übertragen.
    HINWEIS: Der Ursprung adoptiv übertragener OT-I-Zellen kann leicht identifiziert werden, wenn sie unterschiedliche kongene oder fluoreszierende Marker aufweisen. Injizieren Sie beispielsweise CD45.1 + OT-I-T-Zellen in B16F10-OVA-tragende Spendermäuse, während CD45.1 + CD45.2 + OT-I-T-Zellen in B16F10-OVA-tragende Empfängermäuse injiziert werden. CD45.1 und CD45.2 sind beide Isoformen des Pan-Lymphozytenmarkers CD45 (Ly5). Andere häufig verwendete kongene Marker umfassen verschiedene Isoformen von CD90 (Thy1). Dieses Protokoll kann für Mäuse verwendet werden, die verschiedene kongene Marker tragen. OT-I-Mäuse sollten das gleiche Geschlecht haben wie die Mäuse, die einen OT-I-Zelltransfer erhalten, um Abstoßungsprobleme zu vermeiden.
  3. Isolieren Sie die Lymphozyten aus der Milz und den Lymphknoten der OT-I-Maus.
    HINWEIS: Die folgenden Verfahren in diesem Schritt müssen in einer Biosicherheitskabine durchgeführt werden, um eine strenge Asepsis aufrechtzuerhalten.
    1. Bereiten Sie zwei 60 mm × 10 mm Petrischalen zu. Fügen Sie 3 ml R10-Medium in eine Schale hinzu, während Sie 3 ml RBL-Puffer in eine andere Schale geben. Geben Sie ein 70 μm Nylonzellsieb in die Schale mit RBL-Puffer.
    2. Euthanasieren Sie eine OT-I-Maus in einer Isoflurankammer, gefolgt von einer Zervixdislokation.
    3. Ernten Sie die Milz-, Leisten- (subiliac) und axillären Lymphknoten der Maus und übertragen Sie sie auf eine 60 mm × 10 mm Schale mit 3 ml R10 auf Eis.
      HINWEIS: Die Anzahl der geopferten OT-I-Mäuse kann in Abhängigkeit von der Anzahl der zu übertragenden tumortragenden Mäuse angepasst werden. Eine typische Ausbeute an OT-I CD8+ T-Zellen aus einer Milz und bilateralen Leisten- und axillären Lymphknoten von OT-I CD8+ T-Zellen beträgt ~30-100 × 10 6 Zellen pro Maus.
    4. Mazerieren Sie mit dem Endlauf einer 1-ml-Spritze die Milz in 3 ml RBL-Puffer durch das Sieb. Inkubieren Sie für 3 min bei RT und beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von 3 ml kaltem R10-Medium.
    5. Zerdrücken Sie die Lymphknoten, bis nur noch Bindegewebe übrig ist. Spülen Sie den Filter mit R10 ab. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine neue 15 ml konische Röhre. Zentrifuge bei 500 × g, 4 °C für 6 min.
    6. Dekantieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 3 ml MACS-Puffer. Führen Sie die Zellsuspension durch ein neues 70-μm-Zellsieb, um Flocken zu entfernen.
    7. Zellsuspension bei 500 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand.
    8. Verwenden Sie ein Maus-CD8+ T-Zell-Isolationskit (siehe Materialtabelle), um CD8+ T-Zellen durch negative Selektion gemäß dem Protokoll des Herstellers zu reinigen.
      HINWEIS: Wenn Sie Kits von anderen Unternehmen verwenden, befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
    9. Halten Sie die gereinigte Zellsuspension auf Eis. Nehmen Sie eine kleine Probe von Zellen und mischen Sie mit Trypan Blue, um Zellen mit einem Hämozytometer zu zählen.
  4. Bestimmen Sie den Prozentsatz der OT-I-Zellen (Live/Dead-CD8+Va2+) durch Durchflusszytometrie.
    HINWEIS: Die gleichzeitige Färbung kongener Marker und der transgenen TCR sollte durchgeführt werden, um den korrekten Phänotyp der Zellen vor dem Transfer zu überprüfen.
    1. Geben Sie 5 × 10 4-1 × 10 5 Zellen in 1 ml FACS-Puffer in einem1,5 ml Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 350 × g,4 °C für 3 min.
    2. Verwerfen Sie den Überstand und verteilen Sie die Zellen, indem Sie den Boden der Röhre streichen. Stellen Sie die Röhre auf Eis.
    3. Bereiten Sie die folgenden konjugierten Antikörpergemische vor (verdünnt in 100 μL FACS-Puffer): Anti-CD8, 1:200; Anti-TCR Vα2, 1:100; Anti-CD45.1, 1:200; Anti-CD45.2, 1:200; und lebend/tot, 1:200 (siehe Tabelle der Materialien).
    4. Wirbeln Sie den Antikörpercocktail und zentrifugieren Sie bei 15.000 × g für 3 Minuten, um Antikörperaggregate zu pelletieren. Lagern Sie den Cocktail auf Eis und schützen Sie ihn vor Licht.
    5. Resuspendieren Sie die Zellen mit 100 μL Antikörpercocktail und mischen Sie gründlich durch Flicken der Röhre. Im Dunkeln 30 min auf Eis inkubieren.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Antikörperaggregate am Boden der Röhre zu stören.
    6. Waschen Sie die Pellets zweimal mit 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 350 × g, 4 °C für 3 min. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μL FACS-Puffer und übertragen Sie die Zellsuspension in eine FACS-Röhre.
      HINWEIS: Um die Lebensfähigkeit der zu übertragenden OT-I-Zellen zu erhalten, testen Sie die Probe so schnell wie möglich. Wenn die gefärbten OT-I-Zellen nicht sofort getestet werden können, halten Sie die Zellen im Dunkeln auf Eis oder kühlen Sie sie bis zur Analyse bei 4 ° C. Alternativ können die Proben in 1-4% Paraformaldehyd für eine längere Lagerung (16 h) resuspendiert werden, um eine Verschlechterung zu verhindern.
    7. Lassen Sie die Probe auf einem Durchflusszytometer laufen. Berechnen Sie den Prozentsatz der lebenden/toten CD8+Va2+-Zellen, indem Sie die Anzahl der lebenden/toten/toten-CD8+Vα2+-Zellen durch die Anzahl der lebenden/toten Zellen dividieren.
  5. Bestimmen Sie die absolute Anzahl der OT-I-Zellen (lebende/tote CD8+Va2+), indem Sie den Prozentsatz der lebenden/toten CD8+Va2+-Zellen mit der in Schritt 4.3.9 erhaltenen lebensfähigen Zellzahl multiplizieren.
  6. Passen Sie die Konzentration der OT-I-Zellen (lebend/tot-CD8+Va2+) mit PBS auf 1,5 × 106 /ml an.
  7. Injizieren Sie 3 × 105 verschiedene kongenisch markierte OT-I-Zellen (lebende/tote CD8+Va2+) in 200 μL PBS intravenös in zwei Gruppen von B16F10-OVA-tragenden Mäusen (tumortragende Mäuse unterteilt in Spender- und Empfängermäuse aus Schritt 3.8).
    1. Ziehen Sie 200 μL OT-I-Zellsuspension (lebend/tot-CD8+Va2+) in eine 100-HE-Insulinspritze (29 G) und entfernen Sie Blasen wie in Schritt 3.2.
    2. Legen Sie die Maus separat in einen Käfig mit einer Infrarotlampe über dem Käfig für 5-10 Minuten, um die Heckvene zu erweitern. Immobilisieren Sie die Maus mit einer Haltevorrichtung der entsprechenden Größe. Ziehen Sie den Schwanz, um ihn zu begradigen, und sprühen Sie mit 75% Ethanol, um die Vene sichtbar zu machen.
    3. Halten Sie die Spritze parallel zur Vene und führen Sie sie in einem Winkel von 0-15° in die Vene ein. Ziehen Sie den Kolben leicht zurück, und wenn Blut in das Fass gelangt, injizieren Sie die Suspension langsam und stetig mit einer Rate von nicht mehr als 1 ml / min.
      HINWEIS: Widerstand oder Schwellung an der Injektionsstelle zeigt an, dass sich die Nadel nicht in der Vene befindet; Die Injektionsstelle sollte in die Nähe verschoben werden.
    4. Nachdem die Injektion abgeschlossen ist, entfernen Sie die Spritze und drücken Sie den Einführbereich vorsichtig für 3-5 s, um die Blutung zu stoppen. Bringen Sie die Maus zurück in den Käfig und beobachten Sie sie einige Minuten lang genau auf Nebenwirkungen. Wenn es normale Beweglichkeit und Nasenausfluss hat, legen Sie es wieder in die Gesellschaft der anderen Mäuse.

5. Tumormasse von tumortragenden Spendermäusen sezieren

HINWEIS: Halten Sie sterile Bedingungen während der Operation in den Abschnitten 5 und 6 aufrecht. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren vor und nach jedem Gebrauch. Desinfizieren Sie den Arbeitsbereich in der Biosicherheitskabine mit 75% Ethanol gefolgt von ultravioletter Bestrahlung. Tragen Sie ein sauberes Kleid, eine Mütze, eine Gesichtsmaske und sterile Handschuhe.

  1. Acht bis zehn Tage nach dem adoptiven Transfer wählen Sie Spendermäuse mit vergleichbarer Tumormasse von ~5 mm Durchmesser (Sojabohnengröße) für die Transplantationschirurgie aus.
  2. Bereiten Sie eine 100 mm × 20 mm Schale in einer Biosicherheitskabine zu und fügen Sie 10 ml steriles eiskaltes PBS hinzu.
  3. Euthanasieren Sie eine tumortragende Spendermaus in einer Isoflurankammer, gefolgt von einer Zervixdislokation. Tauchen Sie die Maus für 3-5 min in 75% Ethanol und geben Sie sie in die Biosicherheitskabine.
    HINWEIS: Die folgenden Verfahren in diesem Schritt müssen in einer Biosicherheitskabine durchgeführt werden, um eine strenge Asepsis aufrechtzuerhalten.
  4. Legen Sie die Maus auf ein mit sauberem, saugfähigem Papier bedecktes Sezierbrett in Rückenlage. Halten Sie die Mäusegliedmassen mit Dissektionsnadeln zurück.
  5. Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie von oberhalb der Harnröhrenöffnung bis zum Xiphoid mit einer Schere. Dehnen Sie die Haut mit einer Pinzette auf die linke Seite des Mauskörpers und halten Sie die Haut mit Dissektionsnadeln zurück.
  6. Entfernen Sie den Tumor und halten Sie seine Kapsel so intakt wie möglich. Entfernen Sie vorsichtig und vorsichtig das Bindegewebe in der Nähe des Tumors mit einer chirurgischen Schere.
    HINWEIS: Um die Integrität des Tumors zu erhalten, ziehen Sie die Tumorkapsel nicht ab oder schneiden Sie das Tumorgewebe in Stücke.
  7. Geben Sie das Tumorgewebe in eine 100 mm × 20 mm Schale mit 10 ml sterilem eiskaltem PBS für die anschließende Transplantation.

6. Subkutane Transplantation von Spendertumoren auf die tumorangepassten Empfängermäuse

HINWEIS: Das Allotransplantat soll in die untere Flanke der Maus auf der gleichen Seite wie der zuvor vorhandene Tumor implantiert werden, damit zwei Tumore in den identischen Lymphknoten abfließen. In dem hier vorgestellten Protokoll, als der B16F10-OVA-Tumor subkutan in die linke Leistengegend der Maus implantiert wurde (Abschnitt 3), wurde in diesem Schritt das vom Spender abgeleitete Tumorgewebe auf die linke Flanke des Empfängers transplantiert. Die Transplantationsstelle kann an die zuerst implantierte Tumorstelle angepasst werden.

  1. Anästhesieren Sie eine tumorangepasste Empfängermaus mit 250 mg/kg 2,2,2-Tribromethanol durch intraperitoneale Injektion. Kneifen Sie den Zeh eines Streckglieds der Maus zusammen, um den Grad der Anästhesie zu beurteilen, und warten Sie auf das Fehlen eines Schmerzreflexes, der die richtige Tiefe der Anästhesie für die Durchführung der Operation anzeigt. Wenn eine Vokalisation oder ein Entzug der Hintergliedmaßen beobachtet wird, werden weitere 0,01−0,03 ml 2,2,2-Tribromethanol injiziert.
    HINWEIS: Die tumorangepasste Empfängermaus sollte das gleiche Geschlecht haben wie die Spendermaus, die das Allotransplantat bereitstellt, um Abstoßungsprobleme zu vermeiden.
  2. Verwenden Sie tierärztliche Salbe auf den Augen, um Trockenheit zu verhindern. Rasieren Sie die linke Flanke der Maus mit einem Elektrorasierer. Tragen Sie eine Enthaarungscreme auf, um die restlichen Haare zu entfernen.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Haut abzuschleifen, da dies das Risiko einer Kontamination und Infektion erhöhen kann.
  3. Legen Sie die Maus in die Biosicherheitskabine. Legen Sie es in Bauchlage auf eine mit sauberem, saugfähigem Papier bedeckte Seziertafel, wobei die vertikale Achse der Maus parallel zu und der Kopf auf der rechten Seite des Experimentators verläuft.
    HINWEIS: Die folgenden Verfahren in diesem Schritt müssen in einer Biosicherheitskabine durchgeführt werden, um eine strenge Asepsis aufrechtzuerhalten.
  4. Reiben Sie die Haut des rasierten Bereichs mit Baumwolle, die in Povidon-Jod getränkt ist.
    HINWEIS: Verwenden Sie Povidon-Jod anstelle von 75% Ethanol für die Sterilisation, um den Verlust von Körperwärme zu verhindern.
  5. Heben Sie die Haut im Mittelpunkt zwischen den Hüftgelenken der Maus mit einer chirurgischen Pinzette an. Verwenden Sie die Schere, um eine 5 mm lange vertikale Exzision durchzuführen. Verlängern Sie den Schnitt rostral entlang der dorsalen Mittellinie auf ~ 10-15 mm.
  6. Führen Sie eine scharfe Dissektion durch, indem Sie die geschlossenen Spitzen der Schere in den Schnitt einführen und dann öffnen, um das Peritoneum der linken Flanke von der Haut und dem Weichgewebe zu trennen.
    HINWEIS: Um Schäden am Unterhautgewebe und am Peritoneum zu vermeiden, heben Sie die Haut in der Mitte des Einschnitts an und führen Sie dann die geschlossene Schere so nah wie möglich an der Haut ein.
  7. Machen Sie eine Hauttasche an der linken Flanke, indem Sie mehrmals eine scharfe Sezierung durchführen. Deponieren Sie die verkapselte, intakte, vom Spender abgeleitete Tumormasse in die Kapsel.
    HINWEIS: Mäuse in der scheinoperierten Kontrollgruppe erhalten die gleiche chirurgische Operation ohne die vom Spender abgeleitete Tumortransplantation.
  8. Schließen Sie den Schnitt durch unterbrochene Naht (siehe Materialliste). Platzieren Sie 2-3 Nähte für jeden Einschnitt. Desinfizieren Sie die Haut um den Schnitt mit Baumwolle, die in Povidon-Jod getränkt ist.
    HINWEIS: Zwischen zwei aufeinanderfolgenden Stichen und einem Abstand von 3 mm vom Schnitt sollten 5 mm liegen.
  9. Stellen Sie die Maus in die seitliche Position in einen sauberen und warmen Käfig. Überwachen Sie es kontinuierlich, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die sternale Liegefähigkeit aufrechtzuerhalten.
  10. Verabreichen Sie Buprenorphin subkutan in einer Dosis von 0,1 mg / kg Körpergewicht alle 8 Stunden dreimal nach der Operation, um die Schmerzen zu lindern. Überwachen Sie das Essen, Trinken, Bewegen und den bedienten Bereich der Maus. Geben Sie den Transplantatempfänger erst dann an die Gesellschaft anderer Tiere zurück, wenn er sich vollständig erholt hat.
    HINWEIS: Die Maus erholt sich in der Regel innerhalb von 3 Tagen vom Trauma der Operation. Wenn die Maus nicht wieder normal füttert und beweglich ist und Manifestationen einer Infektion zeigt, konsultieren Sie einen Tierarzt für Interventionen oder euthanasieren Sie sie.
  11. Die Mäuse werden zu den angegebenen Zeitpunkten geopfert (die Tiere wie in Schritt 4.3.2 eingeschläfert) und die Zellen von Interesse für die durchflusszytometrische Analyse zurückgewonnen.

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Ergebnisse

Der Schaltplan dieses Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Acht Tage nach der Tumorimpfung wurden CD45.1+ und CD45.1+CD45.2+ OT-I-Zellen in B16F10-OVA-tumortragende C57BL/6-Mäuse injiziert. Der Tumor wurde am Tag 8 nach dem Transfer chirurgisch aus CD45.1+ OT-I-zellimplantierten Mäusen (Spender) seziert und in tumorangepasste CD45.1+CD45.2+ OT-I-zellimplantierte Mäuse (Empfänger) in der dorsalen Flanke auf der gleichen Seite wie de...

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Diskussion

T-Zell-vermittelte Immunität spielt eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort gegen Tumore, wobei CTLs die führende Rolle bei der Ausrottung von Krebszellen spielen. Die Ursprünge von tumorantigenspezifischen CTLs innerhalb von TME wurden jedoch nicht aufgeklärt30. Die Verwendung dieses Tumortransplantationsprotokolls hat einen wichtigen Hinweis darauf geliefert, dass intratumorale antigenspezifische CD8+ T-Zellen trotz der Existenz stammartiger TCF1+ Vorläufer-CD8+ T-Zel...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch Zuschüsse des National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (Nr. 31825011 an LY) und der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31900643 an QH, Nr. 31900656 an ZW) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22 μm m FilterMilliporeSLGPR33RB
1 mL TuberkulinspritzeKDLBB000925
1,5 mL ZentrifugenröhrchenKIRGENKG2211
100 U InsulinspritzeBD Biosciences320310
15 mL konisches RöhrchenBEAVER43008
2,2,2-Tribromethanol (Avertin)SigmaT48402-25G
2-Methyl-2-butanolSigma240486-100ML
70 μ m Nylon ZellsiebBD Falcon352350
APC Anti-Maus CD45.1BioLegend110714Klon: A20
B16F10-OVA ZellliniebluefbioBFN607200447
BSA-V (Rinderserumalbumin)Biossbs-0292P
BV421 Maus Anti-Maus CD45.2BD Horizon562895Klon: 104
ZellkulturschaleBEAVER43701/43702/43703
ZentrifugeEppendorf5810R-A462/5424R
CyclophosphamidSigmaC0768-25G
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibcoC11995500BT
EasySep Maus CD8+ T-Zell-IsolationskitStemcell Technologies19853
EDTASigmaEDS-500g
FACS RöhrchenBD Falcon352052
fötales RinderserumGibco10270-106
DurchflusszytometerBDFACSCanto II
HämozytometerPorLab ScientificHM330
IsofluranRWD Life ScienceR510-22-16
KHCO3 Sangon BiotechA501195-0500
LIVE/DEAD Fixierbares Nahinfrarot-Fleckenset für tote Zellen für 633 oder 635 nmAnregung Life TechnologiesL10199
NadelträgerRWD Life ScienceF31034-14
NH4ClSangon BiotechA501569-0500
ParaformaldehydBeyotimeP0099-500ml
PE Anti-Maus TCR Vα 2BioLegend127808Klon: B20.1
Pen Strep Glutamin (100x)Gibco10378-016
PerCP/Cy5.5 Anti-Maus CD8aBioLegend100734Klon: 53-6.7
RPMI-1640SigmaR8758-500ML
NatriumazidSigmaS2002
chirurgische ZangeRWD Life ScienceF12005-10
chirurgische SchereRWD Life ScienceS12003-09
NahtfadenRWD Life ScienceF34004-30
Trypsin-EDTASigma T4049-100ml

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 4/29/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.

Step 6.10 of the Protocol was updated from:

Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.

to:

Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.

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Tumorinfiltrierende T-ZellenCD8-positive T-ZellenTumormikroumgebungB16F10-OVA-MelanomOT-I-Mäuseantigenspezifische T-ZellenDurchflusszytometrieadoptiver ZelltransferTumorimmunologie
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