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Methodenartikel

Regenwurm, Lumbricus terrestris: Ein neuartiges In-vivo-Modell für wirbellose Mikroinjektionsgefäße

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DOI:

10.3791/62449

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1. April 2021

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1Bioinnovation PhD Program, Tulane University, 2Biology Department, Virginia Commonwealth University, 3Mechanical Engineering Department, Montgomery College, 4Biomedical Engineering Department, Tulane University, 5US Food and Drug Administration

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Regenwürmer sind ein neuartiges In-vivo-Tischmodell für Gefäßuntersuchungen. Wir stellen Techniken und Geräte vor, die eine effiziente Operation und Mikroinjektion in das Regenwurmgefäßsystem ermöglichen. Chirurgische Protokolle, Mikroinjektionstechniken und das Verfahren zur Herstellung von maßgeschneiderten Mikropipetten werden beschrieben.

Zusammenfassung

Obwohl Wirbeltiere für die biomedizinische Forschung unverzichtbar sind, werden Studien oft durch Faktoren wie Kosten, langwierige interne Überprüfungen und ethische Überlegungen eingeschränkt. Wir stellen den Regenwurm als ein alternatives, kostengünstiges, wirbelloses Tier vor, das für bestimmte vorläufige Gefäßuntersuchungen anwendbar ist. Aufgrund der chirurgischen Verfügbarkeit der dorsalen Gefäße, der ventralen Gefäße und der fünf Paare von Pseudoherzen des Regenwurms sind Regenwürmer leicht zugänglich, bieten eine kostengünstige Wartung und erfordern die Verabreichung nur kleiner Dosen einer bestimmten Verbindung. Das Regenwurmmodell bietet ein einfaches geschlossenes vaskuläres Kreislaufsystem mit einer Hämoglobinstruktur, die der des menschlichen Blutes ähnelt. Es wird ein Protokoll für die Betäubung der Regenwürmer und die Durchführung chirurgischer Schnitte zur Freilegung relevanter Blutgefäße erstellt. Mikropipetten für die Verabreichung von Verbindungen werden durch Erhitzen und Ziehen von Glas mit einem Pipettenabzieher und unter Verwendung eines Abschrägungssystems gebildet, um eine feine Nadelspitze im Mikrometerbereich zu erzeugen. Die Spitzen werden dann mit einem Mikropositionierer und einem Mikroinjektor verwendet, um beliebige Verbindungen in das Gefäßsystem eines Regenwurms zu injizieren, und zwar wiederholbar, wobei große Probengrößen und kleine Verbindungsvolumina zur Verfügung stehen. Es werden Einzelheiten zu den Feinheiten des Injektionsverfahrens bereitgestellt. Die geringe Gefäßgröße des Regenwurms ist eine Herausforderung, insbesondere im Fall des ventralen Gefäßes; Die Beherrschung der vorgestellten Techniken bietet jedoch eine hohe Wiederholbarkeit und eine kostengünstige Lösung, die Studien mit sehr großen Stichprobengrößen praktisch macht.

Einleitung

Der Regenwurm wurde als wichtiger Bioindikator und Bioassay für frühere wissenschaftliche Anwendungenverwendet 1,2,3,4,5,6; Es ist ein idealer Organismus für die Bewertung biologischer Risiken von gefährlichen und giftigen Abfällen in terrestrischen Umgebungen für In-situ- und Bioakkumulationsstudien, wie z. B. Biozide (Insektizide) im Boden und schädliche ökotoxikologische Wirkungen 7,8,9,10. Darüber hinaus ist der Regenwurm aufgrund der Bioprospektion eine alternative Quelle für fibrinolytische, gerinnungshemmende, antimikrobielle und krebshemmende Moleküle11,12; bis zu dem Punkt, an dem ein Team 1991 Lumbricin aus der Regenwurmhaut extrahierte und reinigte und auf Brusttumoren von SHN-Mäusen aufbrachte, was zu einer Hemmung des Tumorwachstums führte13. Der Regenwurm ist auch ein pädagogisch nützliches Tiermodell, da er verwendet werden kann, um Schüler mit der Chirurgie vertraut zu machen und die Anatomie eines Präparats zu verstehen; Von der Erforschung der Durchblutung bis zur Elektrophysiologie14,15.

In unseren eigenen Forschungen haben wir die Reaktion der Gefäße lebender Regenwürmer auf hochintensiven Ultraschall untersucht18. Wir fanden heraus, dass der Gefäßriss im Wurm unter ähnlichen Bedingungen auftrat wie bei Rissschäden in menschlichen Mikrogefäßen. Unsere laufende Arbeit besteht darin, Mikrobläschen in das Gefäßsystem des Regenwurms zu injizieren. Mikrobläschen bestehen aus einem schweren Gas, das von einer Lipid-, Albumin- oder Polymerhülle umhüllt ist, diese Wirkstoffe können sowohl als Bildkontrastmittel als auch als Vehikel für die gezielte Verabreichung von Medikamenten verwendet werden.

Dieses neuartige Protokoll ist für jede Studie relevant, die von einer intravenösen (IV) Injektion einer Verbindung profitieren würde, die die natürlichen Bioindikatoren des Regenwurms nutzen könnte. Der Ansatz basiert auf einer intravenösen Mikroinjektion in einen von mehreren möglichen Eintrittspunkten, einschließlich eines der fünfpaarigen Pseudoherzen des Regenwurms, des dorsalen Gefäßes und des ventralen Gefäßes. Der Eingriff umfasst einen aufwendigen chirurgischen Schnitt, um die Gefäße freizulegen, gefolgt von einer mikropositionierergesteuerten Injektion. Dies wird durch spezielle Mikropipetten erreicht, die speziell für die vaskuläre Mikroinjektion von Regenwürmern entwickelt wurden. Diese Mikropipetten ermöglichen eine präzise Ausrichtung auf Gefäße, die nur ein ventrales Gefäß mit einem Durchmesser von 90 μm haben.

Dieses Protokoll soll frühere Mikropipettiertechniken verbessern, einschließlich einer Studie aus dem Jahr 1948 zur Extraktion von Regenwurmblut und Urin16. Wie in Abbildung S1 zu sehen ist, kann die Einrichtung für diese Extraktion schwierig sein und, wie vom Autor angegeben, bis zu einer Stunde oder länger dauern. Eine ähnliche Methode wurde 1970 entwickelt, aber der Autor erlebte mehrere abgebrochene Spitzen, als er Flüssigkeit in die riesigen Fasern des Regenwurms injizierte17. Bei dem vorliegenden Verfahren, das unten beschrieben wird, ist die Extraktion von Blut eine Sache von Sekunden bis Minuten und ist sowohl für die Injektion von Verbindungen als auch für die Extraktion von Regenwurmflüssigkeiten relevant. In diesem speziellen Fall haben wir Kontrastmittel, Mikrobläschen, injiziert.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Mikropipette: Glas ziehen und Spitze anfasen

  1. Ziehen von Mikropipetten
    1. Schalten Sie den Mikropipettenabzieher ein und wählen Sie ein Programm aus, um bestimmte Parameter für die Regenwurm-Mikroinjektion einzugeben.
    2. Legen Sie die Parameter auf Druck = 500, Zug = 75, Zeit = 250, Hitze = 336 und Geschwindigkeit = 70 fest. Die Ergebnisse können von Abzieher zu Abzieher variieren; Experimentieren Sie daher mit Parametern, um die gewünschte Spitze (Größe, Schärfe, Form usw.) zu erreichen.
    3. Führen Sie unbedingt einen RAMP-Test durch, um den Heizwert für die Mikropipetten zu bestimmen, bevor Sie sie ziehen, da dies zum Durchbrennen des Trogfilaments oder zum Zerbrechen des Glases führen kann.
    4. Wenn der Luftdruck geändert werden muss, drücken Sie die Löschtaste, wählen Sie Nein (0), wenn Sie aufgefordert werden, alle Werte zu löschen, und wählen Sie Druck ändern (2). Dieser Prozess kann von Abzieher zu Abzieher variieren; Schlagen Sie daher im Handbuch des Geräts nach, um die Druckeinstellungen zu ändern.
    5. Öffnen Sie den Deckel des Mikropipettenabziehers und legen Sie eine Mikropipette in den Abzieher. Bei dem verwendeten Mikropipettenglas handelte es sich um Borosilikatglas mit Filamentpipette: 10 cm Länge, Außendurchmesser: 1,5 mm und Innendurchmesser: 0,86 mm.
    6. Schieben Sie die Pipette von rechts entlang des Pipettenschlitzes in die V-Nut, bis das Ende der Pipette mit dem Ende des Pipettenhalters übereinstimmt. Um sicherzustellen, dass die Pipette über das Filament auf die gegenüberliegende Seite wandern kann, schieben Sie die Pipette so weit wie möglich und stellen Sie sicher, dass sie auf dem Pipettenschlitz aufliegt.
    7. Um die Pipette zu verriegeln, ziehen Sie den Knopf auf der rechten Seite fest und schieben Sie das verriegelte System zusammen mit der Pipette, bis es die andere Seite des Abziehers durch das Filament erreicht. Zum Schluss verriegeln Sie die linke Seite der Pipette mit dem Abzieher. Die Pipette sollte sich in der Mitte des Filaments befinden; Im Handbuch finden Sie Anweisungen zum richtigen Ausrichten der Pipette.
    8. Sobald die Pipette geladen ist, schließen Sie den Abzieher, drücken Sie den Zugknopf und warten Sie, bis die Pipette gezogen ist, bevor Sie die beiden resultierenden Pipetten entfernen.
    9. Lösen Sie die Knöpfe, um die Pipetten zu entfernen, und achten Sie darauf, die Pipetten beim Herausnehmen aus dem Schlitz nicht zu clippen.
    10. Platzieren Sie die gezogenen Mikropipetten auf einem Mikropipettenhalter oder einer anderen Stütze, um die Mikropipette an Ort und Stelle zu halten und eine einfache Drehung zu ermöglichen, ohne die gezogenen Mikropipetten zu beschädigen. Wir haben einen eigenen Mikropipettenhalter entwickelt, der in einer Maschinenwerkstatt hergestellt oder sogar 3D-gedruckt werden kann.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
    11. Legen Sie den Mikropipettenhalter unter das Mikroskop und verwenden Sie ein Kameraprogramm oder eine ähnliche Software, um ein Bild der gezogenen Mikropipetten aufzunehmen und den Spitzendurchmesser mit 10-facher Vergrößerung ~1000 mm und ~50 mm von der Spitze aus aufzuzeichnen.
    12. Stellen Sie vor der Aufnahme eines Bildes sicher, dass die Kameraeinstellungen mit der Mikroskopeinstellung (10x) übereinstimmen, um eine genaue Messung zu ermöglichen, insbesondere bei Messungen nach der Bildgebung. Die Einstellung 10x befindet sich in der horizontalen Multifunktionsleiste am oberen Rand des Bildschirms.
    13. Um ein Bild der Mikropipette anzuzeigen und aufzunehmen, wählen Sie die Kamera in der Kamerasoftware in der oberen linken Ecke aus und drücken Sie die Snap-Taste, nachdem Sie auf die Spitze fokussiert haben, um einen genauen Messwert zu erhalten. Die Schaltfläche "Einrasten" befindet sich in der horizontalen Symbolleiste auf der linken Seite der Seite unter der Registerkarte "Kamera".
    14. Nehmen Sie Messungen an den gezogenen Mikropipetten vor, um festzustellen, ob die gewünschte Spitzengröße und Konsistenz erreicht wurde. Das Ziehen von bis zu 5 Pipetten reicht aus, um festzustellen, ob der Abzieher und seine Parameter konstant die gewünschte Größe erzeugen. Wenn die gewünschte Spitzengröße nicht erreicht wurde oder wenn die Größe weiterhin pro Pipette variiert, muss der Forscher möglicherweise mit verschiedenen Einstellungen experimentieren, bis eine gewünschte Spitzengröße erreicht ist, oder es kann notwendig sein, das Filament und die Pipettenplatzierung zu fixieren, was möglicherweise die Referenz des Handbuchs des Pipettenabziehers erfordert.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
  2. Einrichten der Abschrägung der Mikropipette und Verwenden des Elektrodenimpedanzmessers
    1. Um die gezogenen Mikropipetten abzuschrägen, verwenden Sie eine Mikropipetten-Anfasmaschine mit einem Elektrodenimpedanzmessgerät und einem 40-fach-Stereomikroskop.
      HINWEIS: Es können auch andere Anfasen verwendet werden; Sogar hauseigene Anfasmaschinen sind erfolgreich, und es können verschiedene Konfigurationen mit verschiedenen Mikroskopen erreicht werden, um den Anfasprozess zu untersuchen, einschließlich der Montage einer Kamera am Mikroskop.
    2. Montieren Sie den Sockel/die Schleifplatte mit der feinen Platte zwischen den beiden schwarzen Haltern.
    3. Platzieren Sie die Bodenplatte mit den Magneten von der Platte weg.
    4. Verschrauben Sie die drei Teile: (1) den oberen Sicherungsring, (2) die Schleiffeinplatte und (3) den unteren Sicherungsring (magnetisch). Identifizieren Sie die abrasive Oberfläche der Schleifplatte; Die feine Platte hat eine violette Farbe und sollte nach oben zeigen, damit das Glas mit der optischen Fläche des Quarzes in Kontakt kommt.
    5. Geben Sie fünf Tropfen Anfasen-Sockelöl oder so viele wie nötig auf die optische Quarzfläche des Anfasinstruments und legen Sie die zusammengebaute Platte darauf. Dieses Öl kann den ganzen Tag halten, aber wenn die Platte ruckelt oder sich nicht so dreht, wie sie sollte, muss die optische Quarzplatte möglicherweise nachgeölt werden.
    6. Drehen Sie die Platte ein paar Mal manuell, um das Öl zu verteilen, und dann kann das Instrument eingeschaltet werden.
    7. Um das Impedanzmessgerät einzurichten, fügen Sie Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) auf den Docht hinzu, der der Referenzdraht ist, und platzieren Sie den Docht auf der Abschrägungsplatte. Tränken Sie das Farbband, um mit der Mikropipette einen Kreislauf zu bilden, und bedecken Sie die Platte mit einer dünnen Schicht Kochsalzlösung.
    8. Befestigen Sie das Leitungssegment am Ende des Drahtes, der am Impandenzmesser befestigt ist.
    9. Schalten Sie den Ein-Schalter am Impedanzmesser um und lassen Sie ihn auf "Standby", bis Sie mit dem Abschrägen beginnen können. Da wir eine große Öffnung erstellen, stellen Sie das Elektrodenimpedanzmessgerät auf x0,1 ein, wenn es zum Abschrägen bereit ist.
  3. Einlegen der Mikropipette und Anfasen
    1. Legen Sie die Mikropipette auf die Pipettenklemme, die sich am Manipulator befindet, und ziehen Sie den Knopf fest, um ihn beim Abschrägen an Ort und Stelle zu halten.
    2. Füllen Sie die gesamte Pipette durch das hintere Ende der Mikropipette mit Kochsalzlösung und führen Sie die Leitung in die Mikropipette ein, wobei Sie darauf achten, dass sich keine Luftblasen in der Mikropipette befinden. Es wurde festgestellt, dass das Vorhandensein von Luftblasen in der Mikropipette zu einer Variabilität der Messungen führt.
    3. Schalten Sie den Impedanzmesser ein, indem Sie von "Standby" auf "x0,1" umschalten. Der Widerstand sollte zunächst 100 MΩ betragen und wenn die Mikropipettenspitze die Kochsalzlösung berührt, sollte sie einen anderen Messwert anzeigen.
    4. Um die richtige Öffnungsgröße der Spitze zu erzielen, stellen Sie vor dem Absenken der Mikropipette den Winkel am Manipulator auf 35° ein, um eine gleichmäßige Abschrägung zu erzielen. Ein Winkel von 30° ist ebenfalls ausreichend, aber zwischen den beiden hält 35° eine niedrigere Standardabweichung, wodurch die Abschrägung gleichmäßiger ist und die Spitze weniger bricht.
    5. Positionieren Sie die Spitze der Mikropipette mit dem Manipulator etwa zwei Drittel vom Rotationszentrum der Schleifplatte entfernt.
    6. Senken Sie die Mikropipette mit dem groben Einstellknopf nahe an der Platte ab, so dass sich die Mikropipettenspitze der Kochsalzlösung nähert. Wenn keine Kamera zur Verfügung steht, ist es wichtig, durch das Mikroskop zu schauen, um die Abschrägung der Spitze zu sehen.
    7. Sobald die Mikropipettenspitze mit der Kochsalzlösung in Kontakt kommt, sollte der Messwert des Impedanzmessgeräts von 100 MΩ auf einen Wert im Bereich zwischen 80 und 20 MΩ sinken. Dieser Wert variiert aufgrund der eingezogenen Glasöffnung.
    8. Wechseln Sie an dieser Stelle vom groben Einstellknopf zum Feineinstellknopf, um die Pipette langsamer abzusenken und ein Brechen der Spitze auf der Platte zu vermeiden. In dieser Phase der Abschrägung ist es wichtig, das Impedanzmessgerät und die Spitze gleichzeitig zu überwachen.
    9. Beobachten Sie beim Abschrägen, wie sich die Spitzengröße ändert, und verwenden Sie die Beleuchtung, um beim Abschrägen einen guten Blickwinkel zu schaffen.
      HINWEIS: Die Spitze wird durch Abschrägung extrem glänzend und die Spitzenöffnung wird größer. In dieser Phase ist es zwingend erforderlich, den Feineinstellknopf am Manipulator zu verwenden, um die Mikropipette abzusenken oder anzuheben. Sobald die Mikropipette von der Platte abgehoben wurde, kann das Zurückbringen auf die Platte dazu führen, dass die Spitze bricht.
    10. Senken Sie die Spitze langsam ab, bis sie die Abschrägungsplatte erreicht, und fasen Sie sie langsam ab, bis ein Widerstand von ca. 20 MΩ erreicht ist. Die Beherrschung dieses Prozesses wird eine starke Lernkurve sein und es erfordert Übung, die Spitze konsequent abzuschrägen.
    11. Wenn ein Widerstand von 20 MΩ erreicht ist, heben Sie die Mikropipette aus der Anfasmaschine.
    12. Entfernen Sie die Mine von der Mikropipette und entladen Sie die Mikropipette aus der Anfasmaschine. Wenn die Mikropipette auf dem Anfaser verbleibt, kann sie entweder brechen oder eine größere Öffnung an ihrer Spitze erzeugen. Daher ist es wichtig, das Messgerät und die Spitze beim Anfasen zu überwachen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
    13. Setzen Sie die abgeschrägte Mikropipette auf den Mikropipettenhalter und verwenden Sie das 10-fach-Objektiv der Mikroskopsoftware, um die Öffnungsgröße der Spitze zu messen. Eine Stichprobengröße von 10 Spitzen ist ausreichend, um die Konsistenz aller abgeschrägten Spitzen zu überprüfen.
    14. Vergewissern Sie sich, dass die Mikroskopeinstellung (10x) mit den Kameraeinstellungen übereinstimmt, bevor Sie ein Bild aufnehmen. Ausreißer können nach Messungen der Spitzenöffnung verworfen werden.
    15. Um den Anfaser auszuschalten, stellen Sie den Schalter sowohl am Antriebsriemenmotor als auch am Impedanzmesser auf "Aus".
    16. Schrauben Sie den Sockel/die Schleifplatte ab, um den oberen Sicherungsring zu entfernen. Heben Sie den Sockel/die Schleifplatte nicht an, während sie aneinander befestigt sind, da sie durch ein erzeugtes Vakuum brechen können.
    17. Nachdem Sie den oberen Sicherungsring des Aufsatzes mit den Schrauben angehoben haben, schieben Sie die Feinschleifplatte ab und heben Sie den letzten Magnetaufsatz an, um ihn zu entfernen. Entfernen Sie das überschüssige Öl auf der optischen Quarzplatte mit Labortüchern.
    18. Reinigen Sie alle drei Komponenten mit entionisiertem (DI) Wasser und tupfen Sie es trocken, um die Bildung von Salzkristallen zu vermeiden. Nach längerem Gebrauch kann es bei dem drehbaren Magnetfuß zu Ruckeln kommen. Spritzen Sie in diesem Fall eine kleine Menge DI-Wasser auf den Antriebsriemen, um kristallisiertes Salz zu entfernen.
    19. Wischen Sie das überschüssige Öl auf der Rückseite der Schleifplatte sowie auf der optischen Ebene des Quarzes ab.
    20. Verwenden Sie DI-Wasser auf der Anfasplattform, um überschüssige Kochsalzlösung zu entfernen, die sich möglicherweise auf dem Instrument befindet, um eine Kristallisation zu vermeiden.
    21. Verwenden Sie DI-Wasser, um die abgeschrägten Spitzen zu waschen. Wenn die Spitzen nicht gewaschen werden, kristallisieren sie, können aber später leicht mit DI-Wasser abgewaschen werden.
    22. Legen Sie den Ton in eine Platte und verwenden Sie das Deckglas, um eine Kontamination der Mikropipetten zu verhindern.
    23. Machen Sie Vertiefungen in den Ton, um die Mikropipetten zu halten. Wenn sie gebrauchsfertig sind, können die abgeschrägten Spitzen nun mit einer interessanten Verbindung verfüllt und in das Gefäßsystem des Regenwurms injiziert werden. Für dieses Protokollbeispiel wurden Kontrastmittel, Mikrobläschen, als interessierende Verbindung verwendet.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.

2. Mikroinjektor-Kalibrierung mit abgeschrägten Spitzen

  1. Bereiten Sie eine hydrophobe beschichtete Platte vor.
    1. Beschichten Sie am Vortag zwei Platten mit einer hydrophoben Beschichtung auf der Oberfläche, um sie über Nacht auszuhärten. Diese Chemikalie sollte aus im Laden gekauften Materialien oder aus hauseigenen Labormaterialien stammen, falls verfügbar, und es werden mindestens 12 Stunden zum Aushärten benötigt.
    2. Die Beschichtung ist ein schneller zweistufiger Prozess. Mit dem Base Coat aufsprühen und anschließend mit dem Top Coat besprühen.
    3. Sprühen Sie in einer Haube oder an einem offenen Raum den Base Coat auf die Platte, nachdem Sie die Base Coat Dose kräftig geschüttelt haben, nachdem die Mischkugeln eine Minute lang geklappert haben.
    4. Sprühen Sie die Platte mit dem Base Coat etwa 6-12 Zoll von der Oberfläche entfernt, indem Sie Durchgänge durchführen, während Sie die Platte beschichten. Die Bahnen bestehen aus leichten Bahnen von rechts nach links und dann auf und ab. Schütteln Sie weiter, während die Platte beschichtet ist, und stellen Sie sicher, dass Sie nicht zu viel sprühen, da dies die Produktleistung verringert.
    5. Warten Sie 1-2 Minuten, bevor Sie eine weitere Schicht des Base Coat auftragen. Obwohl es nicht notwendig ist, kann die zusätzliche Beschichtung auf Wunsch aufgetragen werden.
    6. Warten Sie 30 Minuten, bis der Base Coat getrocknet ist.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.3 - 2.1.5 für den Überlack.
    8. Sobald die Platte über Nacht oder mindestens 12 Stunden ausgehärtet ist, kann die Platte mit Mineralöl gefüllt werden. Füllen Sie den Teller etwa zur Hälfte mit Mineralöl.
    9. Legen Sie die Platte mit Mineralöl auf den Mikroinjektortisch.
  2. Laden Sie die abgeschrägten Spitzen auf den Mikroinjektor.
    1. Schließen Sie den Mikroinjektor direkt an einen Labor-Druckluftstrahl an. Für dieses System können eine komprimierte Stickstoffflasche und ein Druckregler verwendet werden, aber beachten Sie, dass andere Mikroinjektorsysteme eine andere Schnittstelle erfordern könnten.
    2. Öffnen Sie die Druckluft und öffnen Sie den Niederdruck-Luftleitungsregler auf 70 PSI und schalten Sie den Mikroinjektor ein. Überschreiten Sie nicht 80 PSI, da das System nicht mit mehr als 80 PSI umgehen kann.
    3. Füllen Sie die Spitzen mit Wasser mit einer 1-ml-Spritze mit einer Metallnabennadel auf. Wenn der Innendurchmesser der Pipette unterschiedlich ist, wird eine Metallnadel mit anderer Stärke benötigt, um sie aufzunehmen.
    4. Nach dem Befüllen mit Wasser laden Sie die Mikropipette auf den Nadelhalter des Joystick-Mikromanipulators. Es können verschiedene Mikroinjektoren und Mikromanipulatoren verwendet werden.
  3. Erstellen Sie Wasserblasen, um das Dosiervolumen durch eine abgeschrägte Mikropipette zu kalibrieren.
    HINWEIS: Bevor eine Verbindung in das Gefäßsystem des Regenwurms verabreicht wird, muss der Mikroinjektor kalibriert werden, um das richtige Injektionsvolumen zu bestimmen.
    1. Stellen Sie die Parameter am Mikroinjektor auf einen Druck von 4 PSI und eine Zeit auf 0,5 Sekunden ein. Das Überschreiten dieser Parameter verzerrt die Größe des Schiffes, was ungünstig ist, es sei denn, das Ziel des Forschers ist es, die Schiffsexpansion zu untersuchen.
    2. Senken Sie die Pipettenspitze ab, bis sie sich nahe am Boden der Platte befindet, aber achten Sie darauf, dass die Spitze am unteren Rand der Platte nicht bricht. Je tiefer die Spitze im Mineralöl ist, desto zähflüssiger wird sie auf der Spitze, was zum Bruch führen kann.
    3. Beginnen Sie an einer Kante der Platte, um die Platte während der Kalibrierung vollständig zu nutzen.
    4. Sobald dies in Position ist, drücken Sie das Pedal, um eine Wasserblase im Öl abzugeben.
    5. Die Blase kann an der Spitze kleben bleiben. Um dies zu beheben, ziehen Sie die Platte schnell in die entgegengesetzte Richtung von der Blase weg, um sie von der Pipettenspitze zu trennen.
    6. Messen Sie mit der Kamerasoftware die Blasengröße und berechnen Sie das Volumen. Wenn keine Kamerasoftware verfügbar ist, kann eine alternative Software verwendet werden.
    7. Erstellen Sie 10 Blasen und messen Sie den durchschnittlichen Blasendurchmesser, um das richtige Volumen zu bestimmen, das die Mikropipette in das Regenwurmgefäßsystem abgibt.
      HINWEIS: Wenn der Forscher daran interessiert ist, eine Vielzahl von Volumina zu dosieren, können die Parameter für Druck und Zeit manipuliert werden. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1 - 2.3.7.

3. Vorbereitung einer Regenwurmoperation, um bestimmte Regenwurmgefäße von Interesse freizulegen

  1. Regenwurmvorbereitung und Messungen
    1. Bereiten Sie eine 10%ige Ethanollösung vor, die die Regenwürmer vor der Operation betäubt.
    2. Halten Sie Regenwürmer zwischen den Versuchen in einem 100-ml-Becherglas mit Erde.
    3. Bewahren Sie jeweils nur 5 - 10 Regenwürmer im Becherglas auf, um zu verhindern, dass die Regenwürmer durch den abrupten Wechsel vom Kühlschrank auf die Arbeitsplatte, 4 °C bis 25 °C, austrocknen.
    4. Legen Sie die Regenwürmer für 30 Minuten in 10%iges Ethanol. Wenn sich der Regenwurm nach 30 Minuten immer noch bewegt, lassen Sie ihn weitere 5 Minuten in der Ethanollösung.
      HINWEIS: Manchmal braucht der Regenwurm aufgrund seiner Größe mehr Zeit; Daher muss die Zeit im Ethanol möglicherweise an die Größe des Regenwurms angepasst werden, darf jedoch nicht länger als eine Stunde betragen. Über eine Stunde schadet dem Regenwurm.
    5. Spülen Sie den Regenwurm unter dem Wasser des Wasserhahns ab, um den von ihm produzierten Schleim und das Ethanol zu entfernen.
    6. Lege den Regenwurm auf ein Papiertuch, um überschüssiges Wasser zu entfernen.
    7. Sobald der Regenwurm betäubt ist, notieren Sie das Gewicht (g), die Breite (mm), die Länge (mm) und die Gefäßbreite (μm) jedes Regenwurms. Messen Sie das Gewicht und die Abmessungen des Regenwurms, bevor Schnitte gemacht werden und ohne den Regenwurm zu dehnen.
    8. Sobald das Gefäß chirurgisch unter einem Mikroskop freigelegt wurde, verwenden Sie die Kamerasoftware, um die Breite des Gefäßes zu messen. Wenn keine Kamerasoftware verfügbar ist, würde ein rostfreies Mikrolineal ausreichen, das jedoch nicht so genau ist wie eine digitale Softwaremessung.
      HINWEIS: Fahren Sie je nach interessierendem Gefäß mit Schritt 3.2 (ventrales Gefäß), 3.3 (dorsales Gefäß), 3.4 (Draufsicht auf Herzen) oder 3.5 (Seitenansicht von Herzen) fort.
  2. Freilegung des Regenwurmgefäßes, des ventralen Gefäßes (Methode 1)
    1. Verwenden Sie während des chirurgischen Eingriffs ein Gummipolster, um den Regenwurm festzunageln und so das Gefäß von Interesse für den Forscher freizulegen. Der dunkle Teil der Haut sollte nach unten zeigen.
    2. Um den Regenwurm chirurgisch zu öffnen, legen Sie ihn auf seine dorsale Seite, den dunkleren Teil des Regenwurms, wo mit einer Klinge ein kleiner Seitenschnitt von etwa 1 mm auf der Haut gemacht wird. Dieser kleine Schnitt ermöglicht den Eintritt der chirurgischen Schere, um einen langen Schnitt zu erstellen.
    3. Stecke die Regenwurmhaut in einem Abstand von 33 mm fest, so dass eine Öffnung von 27 mm entsteht, um das Gefäß freizulegen, und verwende nur vier Stifte, um das Gefäß richtig freizulegen. Stecknadeln können hinzugefügt oder verschoben werden, sobald der Regenwurm festgesteckt wurde, um die Haut des Regenwurms zu manipulieren.
    4. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt, um den anderen Stift an der Seite seines Körpers zu erreichen. Indem es in Richtung Haut nach oben schiebt, verhindert es Schäden an der Innenseite des Regenwurms, wie z. B. das Durchtrennen des Gefäßsystems oder des Darms.
    5. Sobald der Schnitt gemacht wurde, stecken oder stecken Sie ihn wieder an der Stelle, an der der erste Schnitt gemacht wurde, und dann am Ende des Schnitts.
    6. Bewegen Sie mit beiden chirurgischen Instrumenten (chirurgischen Griffen) die Haut, um das Innere des Regenwurms freizulegen.
    7. Stecken Sie die Haut auf den Boden, während die Haut darüber bewegt wird, und während Sie den Regenwurm nach oben bewegen, trennen Sie die Haut vorsichtig von den Organen. Oben angekommen, platzieren Sie den letzten Pin.
    8. Wenn das Gefäß nicht freigelegt ist, ziehen Sie an gegenüberliegenden Seiten der Haut des Regenwurms, um das elastische Gewebe des Regenwurms zu trennen und das ventrale Gefäß freizulegen und die Haut weiter zu trennen.
      HINWEIS: Dieser Ruck entfernt einen Teil des Gewebes, das die Organe im Regenwurm hält. Seien Sie vorsichtig bei diesem Schritt, da er die Gefäße des Regenwurms unbeabsichtigt aufreißen kann. Das ventrale Gefäß sollte nun freigelegt sein, und der Nervenstrang kann als Marker des Gefäßes fungieren, da der Nervenstrang direkt neben und parallel zum ventralen Gefäß entlang der Haut verläuft. Befindet sich das ventrale Gefäß in der Nähe des Darms, kann ein Ruck an der Haut das Gefäß weiter freilegen. Wenn nicht, schiebe den Darm zur Seite, aber das kann zu einem unordentlichen Arbeitsbereich führen.
  3. Freilegung des Regenwurmgefäßes, des dorsalen Gefäßes (Methode 2)
    HINWEIS: Die Schritte zur Freilegung des dorsalen Gefäßes sind ähnlich wie bei der Exposition des ventralen Gefäßes.
    1. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 - 3.2.3 von Schritt 3.2. Der dunkle Teil der Haut sollte für diese Schritte nach oben zeigen.
    2. Schneide mit einer chirurgischen Schere in die Mitte des Regenwurms auf die gegenüberliegende Seite.
    3. Mache von der Mitte des Regenwurms aus einen Schnitt in Richtung des vorderen Teils des Regenwurms, dem Kopf. Das Schieben nach oben in Richtung Haut verhindert Schäden am Inneren des Regenwurms, wie z. B. das Schneiden des Gefäßes oder des Darms.
    4. Sobald der diagonale Schnitt gemacht wurde, stecken Sie die Stelle des ersten Schnitts und dann am Ende des Schnitts, der gemacht wurde, fest oder stecken Sie ihn erneut fest.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.6 - 3.2.9 in Schritt 3.2.
      HINWEIS: Das dorsale Gefäß sollte nun freiliegen.
  4. Freilegung des Regenwurmgefäßsystems, Draufsicht auf die Herzen (Methode 3)
    1. Verwenden Sie während des chirurgischen Eingriffs ein Gummipolster, um den Regenwurm festzunageln und so das Gefäß von Interesse für den Forscher freizulegen.
    2. Um den Regenwurm chirurgisch freizulegen, legen Sie ihn auf seine Bauchseite, den hellen Teil des Regenwurms. Der dunkle Teil der Haut sollte nach oben zeigen.
    3. Verwende vier Stecknadeln, um die Haut des Regenwurms festzuhalten und ein Fenster zu schaffen, um die Herzen des Interesses freizulegen. Mit einer zusätzlichen Nadel, also insgesamt fünf, kann der Regenwurm in der Nähe der Spitze seines Kopfes, dem vorderen Ende, festgehalten werden.
    4. Beginne, den Regenwurm von unten nach oben festzustecken, beginnend auf der rechten Seite und dann auf der linken Seite. Stecke den Regenwurm fest, indem du zwei Stecknadeln oben in der Nähe der Spitze des Kopfes, das vordere Ende und zwei in der Nähe der Klitoris platzierst.
    5. Verwenden Sie eine Klinge, um einen kleinen Schnitt von ca. 1 mm an der Seite des Regenwurms zu machen.
    6. Schneide mit einer chirurgischen Schere in die Mitte des Regenwurms auf die gegenüberliegende Seite.
    7. Mache von der Mitte des Regenwurms aus einen Schnitt in Richtung der Vorderseite des Regenwurms bis zum Maul des Regenwurms, dem vorderen Ende.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Schere gegen die Haut angehoben wird, um ein Durchtrennen des Gefäßsystems zu vermeiden. Die Scherenklinge ist sichtbar, wenn Sie durch die Haut gehen. Achte darauf, dass der Schnitt bis zum vorderen Ende des Regenwurms gemacht wird, da dies eine bessere Sichtbarkeit der Herzen ermöglicht.
    8. Sobald du ihn festgesteckt hast, stecke den Regenwurm wieder fest, wenn sich die Haut in den Regenwurm einrollt.
    9. Machen Sie einen Ruck, um das Gewebe des Regenwurms richtig zu trennen und die Herzen richtig freizulegen.
    10. Wenn die Herzen nicht freigelegt sind, bewegen Sie die weißen Samenbläschen, da sich die Herzen manchmal unter diesen Bläschen verstecken.
      HINWEIS: Die Exposition des Herzens kann von Regenwurm zu Regenwurm variieren, alle 10 Herzen können sichtbar sein oder nur die Hälfte und so weiter. An diesem Punkt muss der Forscher entscheiden, ob er Organe und Gewebe bewegen muss, um die Herzen des Regenwurms zu lokalisieren.
  5. Freilegung des Regenwurmgefäßsystems, Seitenansicht der Herzen (Methode 4)
    1. Verwenden Sie während des chirurgischen Eingriffs ein Gummipolster, um den Regenwurm festzunageln und so das Gefäß von Interesse für den Forscher freizulegen.
    2. Um den Regenwurm chirurgisch freizulegen, legen Sie ihn auf die Seite. Da der Regenwurm auf der Seite liegt, sollten sowohl die helle als auch die dunkle Seite des Regenwurms sichtbar sein.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 3.4.3 - 3.4.9 ab Schritt 3.4.
    4. Wenn die Herzen nicht freigelegt sind, bewegen Sie die weißen Samenbläschen, da sich die Herzen manchmal unter diesen Bläschen verstecken.
      HINWEIS: Die Exposition des Herzens kann von Regenwurm zu Regenwurm variieren, alle fünf Herzen können sichtbar oder weniger sichtbar sein. An diesem Punkt muss der Forscher entscheiden, ob er Organe und Gewebe bewegen muss, um die Herzen des Regenwurms zu lokalisieren.

4. Verabreichung von Verbindungen in das Regenwurmgefäßsystem

  1. Vorbereitung des Regenwurms für die Verabreichung von Verbindungen
    HINWEIS: Für diese speziellen Schritte haben wir Kontrastmittel, Mikrobläschen, als interessierende Verbindung in das Regenwurmgefäßsystem injiziert.
    1. Legen Sie den Regenwurm vor der Mikroinjektion auf die Mikroinjektionsstufe und verwenden Sie ein Labortuch, um alle Flüssigkeiten um das interessierende Gefäß herum zu entfernen, wodurch das Gefäßsystem für die Injektion freigelegt wird.
      HINWEIS: Üben Sie keinen starken Druck aus, da dies zu Blutungen des Gefäßes führt.
    2. Richten Sie das gewünschte Gefäßsystem auf die Mikropipette aus, da es wichtig ist, dass das ventrale Gefäß für die Injektion ausgerichtet ist. Wenn die Herzen von Interesse sind, müssen sie senkrecht zur Mikropipette stehen.
    3. Fokussieren Sie das Mikroskop auf das gewünschte Gefäßsystem und beginnen Sie, die Mikropipette auf das Gefäßsystem abzusenken. Bevor Sie einen der Joystick-Manipulatoren bewegen, vergewissern Sie sich, dass sie alle auf 0 mm eingestellt sind, um eine optimale Mobilität zu gewährleisten.
    4. Wenn die Spitze der Mikropipette mit dem Regenwurmgefäß in Kontakt kommt, stellen Sie sicher, dass der Winkel zwischen dem Gefäß und der Mikropipette weniger als 15° beträgt.
    5. Sobald die Mikropipette beginnt, Druck auf das Gefäß auszuüben, bewegt sich das Blut aufgrund des Drucks auf das Gefäßsystem von der Spitze weg. Dies ist ein guter Hinweis auf die richtige Platzierung der Injektion.
    6. Um eine erfolgreiche Injektion zu gewährleisten, bewegen Sie die Mikropipette mit dem Joystick nach vorne, um Kontakt mit dem Gefäßsystem aufzunehmen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, das Gefäß nicht zu punktieren. Beachten Sie, dass die Spitze das Gefäßsystem für das dorsale und ventrale Gefäß in die Richtung bewegen sollte, in die sich die Mikropipette bewegt, und dann sollte das grobe Drehrad verwendet werden, um die Spitze der Mikropipette nach vorne zu bewegen, um ein vollständiges Eindringen in das Gefäß zu ermöglichen. Wenn die Platte beweglich ist, kann dies verwendet werden, um das Gefäß in die Mikropipette zu bewegen und zu durchstechen, anstatt die Mikrocontroller zu verwenden oder alles gleichzeitig. Das Gefäß wird nicht sofort durchdrungen, aber ein Rückstoß des Gefäßes ist ein Indikator für das richtige Eindringen der Mikropipette. Sobald die Spitze in das Gefäß eingedrungen ist, sollte das Gefäß gerade und auf die Mikropipette ausgerichtet sein. Ist dies nicht der Fall, ziehen Sie die Mikropipette langsam mit dem Feinregler zurück.
    7. Drücken Sie das Pedal, um das Gefäßsystem des Regenwurms zu injizieren. Die Verdünnung des Blutes ist ein weiterer Indikator für die richtige Penetration, sobald das Pedal gedrückt wird.
    8. Ziehen Sie die Mikropipette langsam zurück und ziehen Sie sie weg.
      HINWEIS: Alternativ ist das Brechen der Spitze, während sich die Mikropipette noch im Gefäß befindet, eine wirksame Methode, um Blutverlust zu vermeiden.

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Ergebnisse

Die folgenden repräsentativen Ergebnisse basieren auf einer Reihe spezifischer Parameter, die die Einstellungen zum Ziehen der Glaspipette, die Größe der Pipettenöffnung, die aus einem bestimmten Anfaswinkel gebildet wird, sowie den Druck und die Zeit der Mikroinjektionen umfassen. In Abbildung 1 ist ein Schema des Ablaufs dargestellt, das den Prozess von Anfang bis Ende darstellt.

Basierend auf den ausgewählten Parametern des Pipettenabziehers würde die folgende ...

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Diskussion

Während der Regenwurm in 10%igem Ethanol enthalten ist, kann es bei einer Expositionszeit von mehr als 30 Minuten zu unerwünschten Wirkungen kommen, insbesondere wenn der Regenwurm älter ist. Der Darm beginnt sich zu verschlechtern, und wenn der Regenwurm chirurgisch geöffnet wird, breitet sich sein innerer Darm aus. Daher wird empfohlen, junge bis mittelalte Regenwürmer zu verwenden. Während des Schneidens durch die Haut des Regenwurms ist es zwingend erforderlich, dass kein vollständig...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das NSF-FDA Scholar-in-Residence Fellowship (NSF-FDA SIR, #1641221), den US Food and Drug Administration Office Chief Scientist Challenge Grant (FDA OCS), das National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (NSF IGERT, #1144646) finanziert und vom Office of Science and Engineering Laboratories (OSEL) der US Food and Drug Administration (FDA) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3M Vetbond Tissue Adhesive3M Vetbond084-1469SB3mL Flasche Vet Kleber - flüssiges Pflaster
40x StereomikroskopSutter Instrument Co.BV-10-DNicht erforderlich, kann auf andere Zielfernrohre hinzugefügt
werden 500 Große WürmerWindsor Großhandel Köder500 Große
Anfaser SockelölSutter Instrument Co.008
KlingenTed Pella, Inc121-2
Borosilikatglas mit FilamentSutter Instrument Co.BF150-86-10
KameraAmScopeMU500
KameraAmScopeMU1803-CK8MP USB3.0 Mikroskop Digitalkamera
Elektrode ImpedanzmessgerätSutter Instrument Co.BV-10-C
EthanolSigma AldrichE7023-1LReines
Ethanol Filament SutterInstrument Co.FT315Bdurch Filament
SchleifplatteSutter Instrument Co.104DFeinplatte
Kochsalzlösung in KrankenhausqualitätBaxter Healthcare Corporation2F71240,9 % Natriumchlorid-Bewässerungs-Joystick-Mikromanipulator
NarishigeMN-151
KimWipes Kimtech ScienceKimberly-Clark Professional34155
LeafgroLeafGro 5892521,5 Kubikfuß
Metall-NabennadelHamilton91024Luer-Lock-Metallnadel
Mikrogefäß-ClipsWPI501779-G
MikroinjektorTriTech ResearchMINJ-D
Mikropiettenabzieher Modell P-97Sutter Instrument Co.P-97
Mikropipette BevelerSutter Instrument Co.BV-10-B
MikroskopAmScopeSM-8TPW2-144S3,5X-225X Simul-Fokales Gelenkmikroskop
NadelhalterTriTech ResearchMINJ-4
NeverWetRost-OleumNeverWet
Pyrex GlasCorning08747AFisher Hersteller
Edelstahl MikrolinealTed Pella, Inc13635Mikrolineal montiert auf einem Griff, 10 mm Mensur, mit Linien im Abstand von 0,01 mm
Chirurgische GriffeTed Pella, Inc53073Pinzette, Blutstillung
Chirurgische SchereTed Pella, Inc1320Feine Irisschere, gerade
U.S.P. Mineralöl Schmiermittel AbführmittelSchwanMineralöl

Referenzen

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