Generierung von 3D-Ganzlungenorganoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen zur Modellierung der Lungenentwicklungsbiologie und -krankheit

Die Lunge ist ein kompliziertes, heterogenes, dynamisches Organ, das sich in sechs verschiedenen Stadien entwickelt - embryonaler, pseudoglandulärer, kanalikulärer, sackulärer, alveolärer und mikrovaskulärer ^Reifung1,2. Die beiden letztgenannten Phasen treten prä- und postnatal in der menschlichen Entwicklung auf, während die ersten vier Phasen ausschließlich während der fetalen Entwicklung auftreten, es sei denn, es tritt eine Frühgeburt ^auf3. Die embryonale Phase beginnt in der endodermalen Keimschicht und endet mit dem Austrieb der Luftröhre und der Lungenknospen. Die Lungenentwicklung erfolgt zum Teil über die Signalübertragung zwischen den Epithel- und Mesenchymzellen4. Diese Wechselwirkungen führen zu Lungenverzweigung, Proliferation, Bestimmung des zellulären Schicksals und zellulärer Differenzierung der sich entwickelnden Lunge. Die Lunge ist in leitende Zonen (Luftröhre zu den terminalen Bronchiolen) und Atemzonen (respiratorische Bronchiolen zu den Alveolen) unterteilt. Jede Zone enthält einzigartige Epithelzelltypen; einschließlich basaler, sekretorischer, flimmerförmiger, Bürsten-, neuroendokriner und Ionozytenzellen im leitenden ^Atemweg5, gefolgt von alveolären Typ-I- und -II-Zellen im respiratorischen ^Epithel6. Über die Entstehung und Reaktion auf Verletzungen der verschiedenen Zelltypen ist noch viel unbekannt. iPSC-abgeleitete Lungenorganoidmodelle ermöglichen die Untersuchung von Mechanismen, die die Entwicklung der menschlichen Lunge vorantreiben, der Auswirkungen genetischer Mutationen auf die Lungenfunktion und der Reaktion sowohl des Epithels als auch des Mesenchyms auf Infektionserreger, ohne dass primäres menschliches Lungengewebe erforderlich ist.

Zu den Markern, die den verschiedenen Stadien der embryonalen Differenzierung entsprechen, gehören CXCR4, cKit, FOXA2 und SOX17 für das definitive Endoderm (DE)⁷, FOXA2, TBX1 und SOX2 für das vordere Vorderdarmendoderm (AFE)⁸ und NKX2-1 für frühe Lungenvorläuferzellen9. Bei der embryonalen Lungenentwicklung teilt sich der Vorderdarm in die dorsale Speiseröhre und die ventrale Luftröhre. Die Knospen der rechten und linken Lunge erscheinen als zwei unabhängige Ausscheidungen um die Trachealknospe10. Während der Verzweigung der Morphogenese produziert das Mesenchym, das das Epithel umgibt, elastisches Gewebe, glatte Muskulatur, Knorpel und ^{Gefäßkulatur11}. Die Wechselwirkung zwischen Epithel und Mesenchym ist essentiell für eine normale Lungenentwicklung. Dazu gehört die Sekretion von ^FGF1012 durch das Mesenchym und ^SHH13, das vom Epithel produziert wird.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gerichteten Differenzierung von hiPS-Zellen in dreidimensionale (3D) ganze Lungenorganoide (WLO). Während es ähnliche Ansätze gibt, die die Isolierung von Lungenvorläuferzellen durch Sortierung im LPC-Stadium beinhalten, um alveolär-ähnliche ^14,15 (distale) Organoide oder ^Atemwege16 (proximale) Organoide herzustellen oder ventral-anteriore Vorderdarm-Sphäroide zu erzeugen, um menschliche Lungenorganoide herzustellen, die alveoläre Zell- und mesenchymale Marker und Knospenspitzen-Vorläuferorganoide ^{exprimieren17} Die Stärke dieser Methode ist die Einbeziehung sowohl von Lungenepithel- als auch von mesenchymalen Zelltypen, um die Morphogenese, Reifung und Expansion der Lunge in vitro zu strukturieren und zu orchestrieren.

Dieses Protokoll verwendet kleine Moleküle und Wachstumsfaktoren, um die Differenzierung pluripotenter Stammzellen durch definitive Endoderm-, vordere Vorderdarm-Endoderm- und Lungenvorläuferzellen zu steuern. Diese Zellen werden dann durch wichtige Entwicklungsschritte, einschließlich Verzweigung und Reifung, in 3D-Ganze Lungenorganoide induziert. Die Zusammenfassung des Differenzierungsprotokolls ist in Abbildung 1a mit repräsentativen Hellfeldbildern der endodermalen und organoiden Differenzierung in Abbildung 1b dargestellt. Abbildung 1c,d zeigt die Genexpressionsdetails der endodermalen Differenzierung sowie die Genexpression sowohl der proximalen als auch der distalen Populationen von Lungenepithelzellen nach Abschluss der Differenzierung.

Dieses Studienprotokoll wurde vom Institutional Review Board des Human Research Protections Program der UCSD (181180) genehmigt.

1. Definitive Endoderm-Induktion aus induzierten pluripotenten Stammzellen (Tag 1 - 3)

1. Langsames Auftauen des Wachstumsfaktors reduziert (GFR)-Basalmembran (BM) Matrixmedium auf Eis 30 Minuten vor Gebrauch. In kaltem DMEM/F12-Gemisch das GFR BM-Matrixmedium 1:1 so verdünnen, dass es 50% dieses Mediums ausmacht. Legen Sie die P1000-Pipettenspitzen in den Gefrierschrank, um sie vor gebrauchen zu kühlen.
2. Beschichten Sie jede Vertiefung einer 12-Well-Platte mit 500 μL 50% GFR-Basalmembranmatrixmedium, das in eiskaltem DMEM/F12 hergestellt wurde. Sobald die gewünschte Anzahl von Vertiefungen beschichtet ist, entfernen Sie überschüssiges Mediumsgemisch und/oder Blasen aus den Vertiefungen und stellen Sie die Platte bei 4 °C für 20 minuten auf Eis oder Kühlschrank. Dann die Platte über Nacht bei 37 °C zum Gelieren und Trocknen in den Inkubator bringen.
3. Sobald hiPSCs eine Konfluenz von 70-90% erreicht haben, fügen Sie eine Stunde vor der Dissoziation 10 μM Rho-assoziierten Kinase (ROCK) Inhibitor Y-27632 hinzu. Saugen Sie das Medium ab und waschen Sie es einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Dissoziieren Sie hiPS-Zellen durch Zugabe von Zellablösungsmedium (0,5 ml / Vertiefung einer 12-Well-Platte) und inkubieren Sie für 20 min bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator.
4. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und geben Sie 0,5 ml/12-Well Stammzell-Passaging-Medium (Tabelle 1) in die Vertiefungen; Zellen mit einer P1000-Spitze sanft verdrängen, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Übertragen Sie dissoziierte Zellen in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen; Zentrifuge für 5 min bei 300 x g.
5. Aspirieren Sie das Medium ab und resuspenieren Sie das Zellpellet mit 1 ml mTeSR Plus-Medium, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor (Y-27632). Führen Sie eine Zellenzählung durch. Fügen Sie 2,0 x ¹⁰⁵ hiPSCs in 1 ml mTeSR, ergänzt mit ROCK-Inhibitor Y-27632, pro Vertiefung einer 12-Well GFR-Basement-Membran medium coated Plate hinzu. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
   HINWEIS: Die Anzahl der Zellaussaatzellen muss pro Zelllinie optimiert werden. 24 h nach dem Plattieren sollten die Vertiefungen 50% -70% konfluent sein.
6. An Tag 1 das mTeSR Plus absaugen und definitive Endoderm (DE)-Induktionsmedien (Tabelle 1) hinzufügen, die mit 100 ng/ml humanem Aktivin A und 5 μM GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR99021 ergänzt werden.
   HINWEIS: DE-Medien mit GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR99021 sollten innerhalb von 20-24 h nach Tag 1 DE-Induktion für eine erfolgreiche Differenzierung entfernt werden.
7. Wechseln Sie an Tag 2 und Tag 3 zu DE-Induktionsmedien, die nur mit 100 ng /ml Aktivin A ergänzt werden.
   HINWEIS: Die DE-Differenzierung sollte insgesamt 72 h nicht überschreiten, da sonst die Wirksamkeit abnimmt. Wenn an Tag 4 ein Absterben großer Zellen beobachtet wird, verringern Sie die gesamte DE-Medienexpositionszeit um 6-12 h.
8. Um die DE-Effizienz zu analysieren, bestätigen Sie mehr als 90% CXCR4- und/oder cKit-Expression mittels Durchflusszytometrie oder Immunfluoreszenzanalyse von FOXA2 und/oder SOX17 (Abbildung 2a).

2. Induktion des vorderen Vorderdarmendoderms (AFE) (Tag 4 - 6)

1. Wechseln Sie an Tag 4 das Medium zu serumfreiem Basalmedium (SFBM) (Tabelle 1), ergänzt mit 10 μM SB431542 und 2 μM Dorsomorphin zur AFE-Induktion. Wechseln Sie die AFE-Medien täglich für 3 Tage (Tag 4, Tag 5 und Tag 6).
2. Um die AFE-Effizienz zu analysieren, bestätigen Sie die robuste Expression von SOX2, TBX1 und FOXA2 durch Immunfluoreszenzfärbung (Abbildung 2b).

3. Differenzierung der Lungenvorläuferzellen (LPC) (Tag 7 - 16)

1. An Tag 7 das GFR-Basalmembran-Matrixmedium auf Eis auftauen. Saugen Sie das AFE-Medium ab und waschen Sie es gut mit 1x PBS. 1 ml Zellablösung zugeben und 10 min bei 37 °C inkubieren.
2. 1 ml Abschreckmedium (2 % FBS in DMEM/F12) in die Vertiefungen geben, die Zellablösung enthalten. Halten Sie Zellen als Aggregate, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen entfernt und in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt werden. Zentrifuge für 5 min bei 300 x g.
3. Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in Quenching-Medium, ergänzt mit 10 ng/ml humanem rekombinantem knochenmorphogenem Protein-4 (BMP4), 0,1 μM All-trans-Retinsäure (RA), 3 μM GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR99021 und 10 μM Gesteinsinhibitor Y-27632.
4. Führen Sie eine Zellenzählung durch. Fügen Sie 2,5 x ¹⁰⁵ Zellen zu 100 μL kaltem GFR-Basement-Membranmatrixmedium hinzu, mischen Sie gut und geben Sie das Tröpfchen in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte. Die Platte bei 37 °C für 30-60 min inkubieren, damit das Medium polymerisieren kann. Fügen Sie 1 ml LPC-Medien, ergänzt mit 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632 pro Vertiefung, hinzu, um sicherzustellen, dass der mittlere Tropfen vollständig eingetaucht ist, und inkubieren Sie bei 37 ° C über Nacht.
5. Wechseln Sie am Tag 8, 24 h nach der LPC-Induktion, das LPC-Medium, um den ROCK-Inhibitor Y-27632 zu entfernen. Wechseln Sie das LPC-Medium jeden zweiten Tag für insgesamt 9-11 Tage.
   HINWEIS: Wenn das Medium innerhalb von 24 Stunden gelb wird, wechseln Sie das Medium jeden Tag.
6. Um die LPC-Effizienz zu analysieren, bestätigen Sie die robuste Expression des intrazellulären Transkriptionsfaktors NKX2-1 oder führen Sie eine Durchflusszytometrie für die Oberflächenmarker ^CD47hi/CD26low15 oder ^CPM18 durch (Abbildung 2c). Grob gesagt sollten die LPC-Sphäroide rund und transparent sein (Abbildung 2c).
   HINWEIS: Fahren Sie nicht mit der Differenzierung der Lungenorganoide fort, wenn die Effizienz von NKX2-1 unter 30% liegt.

4.3D Lungenorganoid-Induktion (Tag 16 - 22)

1. Am Tag 17 das GFR-Basalmembran-Matrixmedium auf Eis auftauen. Aspirieren Sie das LPC-Induktionsmedium. Anschließend werden 2 μg/ml Dispase (1 ml) in die Vertiefung gegeben und das Medium/Dispase-Gemisch mit einer P1000-Pipette resuspendiert. Bei 37 °C für 15 min inkubieren. Die Mischung erneut verdränken und bei 37 °C weitere 15 min inkubieren.
2. Übertragen Sie die Dispase und die Zellen in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie gekühltes PBS (2-3 ml), um den Brunnen zu waschen und die Dispase / Zell-Mischung wieder zu verstopfen. Zentrifuge für 5 min bei 400 x g. Entfernen Sie den Überstand manuell und achten Sie darauf, die Medium- / Zellpelletschicht nicht zu entstuben. Wiederholen Sie die gekühlte PBS-Wäsche und zentrifugieren Sie das konische Zentrifugenröhrchen für weitere 5 minuten bei 400 x g.
3. Entfernen Sie den Überstand manuell und geben Sie dann 2 ml Trypsin-basierte Dissoziationslösung in das konische Zentrifugenröhrchen. Bei 37 °C für 12 min inkubieren.
4. Nach der Inkubation resuspendieren Sie die Zellen mit einer P1000-Pipettenspitze. Dann ein gleiches Volumen Abschreckmittel in das konische Zentrifugenröhrchen geben und bei 400 x g für 5 min herunterdrehen. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie Zellen in Löschmedium + 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632.
   HINWEIS: Eine erfolgreiche Lungenorganoidinduktion tritt auf, wenn Zellen als Aggregate eingebettet sind, nicht einzelne Zellen, passen Sie das Pipettieren entsprechend an.
5. Führen Sie eine Zellenzählung durch. Berechnen Sie das Volumen, das benötigt wird, um 5,0-8,0 x ¹⁰⁴ Zellen pro Bohrloch zu erhalten. Aliquot aggregiert die LPC-Zelle zu 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiert für 5 min bei 400 x g. Entfernen Sie überschüssigen Überstand und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu rühren. Lassen Sie nur 10 μL Restmedien.
6. Suspendieren Sie das Zellpellet in 200 μL kaltem GFR-Basalmembranmatrixmedium erneut und fügen Sie sie den Zellkulturmembraneinsätzen hinzu (6,5 mm Durchmesser, 0,4 μm Pore, Polyestermembran). Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 30-60 min, damit das GFR-Basalmembranmatrixmedium polymerisieren kann.
7. 1 ml 3D-Organoid-Induktionsmedium (Tabelle 1), ergänzt mit Fibroblasten-Wachstumsfaktor-7 (FGF7) (10 ng/ml), FGF10 (10 ng/ml), GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR (3 μM), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) (10 ng/ml) und 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632 in die basolaterale Kammer des Membraneinsatzes geben. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag für 6 Tage.

5.3D Lungenorganoidverzweigung (Tag 23 - 28)

1. Am Tag 23 Wechsel zu 3D-Verzweigungsmedium (Tabelle 1), ergänzt mit FGF7 (10 ng/ml), FGF10 (10 ng/ml), GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR99021 (3 μM), RA (0,1 μM), EGF (10 ng/ml) und vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) / Plazentawachstumsfaktor (PlGF) (10 ng/ml). Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag für 6 Tage.
   HINWEIS: An Tag 6 der 3D-Verzweigungsdifferenzierung sollten mehrere verzweigte Organoide vorhanden sein (Abbildung 2).

6.3D Reifung der Lungenorganoide (Tag 29 - 34)

1. Wechseln Sie am Tag 29 zu einem 3D-Reifungsmedium (Tabelle 1), das mit dem 3D-Verzweigungsmedium identisch ist, jedoch mit dem Zusatz von Dexamethason (50 nM), cAMP (100 μM) und 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), einem Phosphodiesterase-Inhibitor, der auch isobutylxanthin (100 μM) genannt wird. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag für 6 Tage.
   HINWEIS: Innerhalb von 24 h nach der 3D-Reifung sollten sich die verzweigten Organoide ausdehnen und in transparente Kugeln übergehen.

7.3D Immunzytozytochemie des Lungenorganoids

1. Für die 3D-Analyse des gesamten Lungenorganoids das GFR-Basalmembranmatrixmedium in den Membraneinsätzen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 1 h bei 4 °C fixieren. In Paraffinwachs einbetten und gemäß den standardmäßig veröffentlichten Protokollen auf Objektträger montieren.
2. Führen Sie vor der Färbung einen Antigenabruf durch. Zu den Atemwegsmarkierungen gehören KRT5, MUC5AC und SCGB3A2. Alveolare Marker umfassen SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 und HOPX (Abbildung 3).

8. Entfernung ganzer Lungenorganoide aus dem GFR-Basalmembranmatrixmedium für Passage, FACS oder Kryokonservierung

1. Um die Organoide vom GFR-Basalmembranmatrixmedium zu dissoziieren, entfernen Sie Medien aus der Basalkammer und fügen Sie 2 μg/ml Dispase (1 ml) in die apikale Kammer hinzu.
2. Das Medium/Dispase-Gemisch mit einer P1000-Pipette vorsichtig verdrängen und für 15 min in den Inkubator geben. Die Mischung noch einmal vorsichtig veredeln und weitere 15 min inkubieren.
3. 1 mL gekühltes PBS (4 °C) zugeben und Organoide mit dem Matrixmedium in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen übertragen. Bei 400 x g für 5 min drehen. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, um das Zellpellet nicht zu stören.
4. Noch einmal mit 1 ml gekühltem PBS waschen und bei 400 x g für 5 min herunterdrehen. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, um das Medium/Zell-Gemisch nicht zu stören.
5. 1 ml Zellablösung in das konische Zentrifugenröhrchen geben, vorsichtig verdreinigen und das GFR-Basement-Membranmatrix-Medium/Zell-Gemisch vorsichtig resuspendieren. Für 12 min in den Inkubator geben, um Zellen als Aggregate oder zur Kryokonservierung zu überreichen) oder 20 min für Einzelzellsuspensionen.
6. Fügen Sie das gleiche Volumen an Löschmedien hinzu und drehen Sie es bei 400 x g für 5 min herunter. Resuspend in Abschreckmedium + 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632.
   HINWEIS: Bei diesem Schritt sollte kein Restmedium der Basalmembran im Rohr zu sehen sein. Wenn das Restmedium übrig bleibt, wiederholen Sie die Schritte 8.5 und 8.6.
7. Führen Sie eine Zellenzählung durch. Berechnen Sie das für nachgelagerte Anwendungen benötigte Volumen.

24 Stunden nach dem Plattieren, Tag 1, sollten iPS-Zellen 50% -90% konfluent sein. An Tag 2 sollte DE zu 90%-95% konfluent sein. Während der DE-Induktion ist es üblich, am Tag 4 einen signifikanten Zelltod zu beobachten, aber die angeschlossenen Zellen behalten eine kompakte Kopfsteinpflastermorphologie bei (Abbildung 2b). Brechen Sie die Differenzierung ab, wenn sich die Mehrheit der adhärenten Zellen löst, und erwägen Sie, die Exposition gegenüber DE-Medien mit Activin A um 6-12 h zu verkürzen. Während der AFE-Induktion ist der Zelltod minimal und die Zellen bleiben adhärent, erscheinen aber kleiner und heterogener. Das Passieren der Zellen am Tag 7 darf nur erfolgen, wenn die Ausbeute von doppelt positivem SOX2 und FOXA2 >80% beträgt. Nach dem Übergang in die Basalmembranmatrix für die 3D-LPC-Induktion erscheinen zuerst kleine Sphäroide, wachsen dann und einige können sich verzweigen. Genexpressionsprofile für eine erfolgreiche endodermale Differenzierung umfassen erhöhtes SOX17 bei DE, erhöhtes FOXA2 und SOX2 mit abnehmendem SOX17 und dem ersten Auftreten von NKX2-1 und erhöhtem NKX2-1 zusammen mit dem Vorhandensein von SOX2 und FOXA2. Im Einklang mit der frühen Embryonalentwicklung erfolgt die Ventralisierung von AFE für die Entwicklung der Lungenknospen (NKX2-1+) und die Dorsalisierung von AFE für die gastrointestinale Entwicklung (SOX2+). Kulturen bei LPC haben eine Mischung aus Lungen- und Magenvorläufern.

Die Lungenorganoidinduktion von LPC wurde mit verschiedenen Methoden durchgeführt. Einige Gruppen sortieren die Zellen mit NKX2-1 Fluoreszenzreportern oder einem Oberflächenantigen-Proxy (CPM, CD26lowCD47high). Aber diese Lungenorganoide enthalten alveoläre Typ-II-ähnliche Zellen ohne alveoläre Typ-I-Zellen oder Mesenchym. Andere Gruppen haben Zellklumpen gesammelt, die von der AFE / LPC-Monoschicht knospen, und sie in die Basalmembranmatrix eingebettet. Diese Organoide enthalten eine gemischte Population von Lungenepithel- und mesenchymalen Zellen, brauchen aber Monate bis zur Kultivierung19. Unser Protokoll umfasst sowohl das Vorhandensein von Epithel- als auch mesenchymalen Zellen. Die WLOs exprimieren die proximalen Epithelzellmarker p63 und KRT5 (Basalzellen) und SCGB3A2 (Clubzellen) sowie die distalen Epithelzellmarker HOPX (ATI) und proSPC, SPB und NKX2-1 (ATII). Sie exprimieren auch den mesenchymalen Marker Vimentin im LPC-Stadium sowie in den gesamten Lungenorganoiden. PDGFRα ist ein Marker für Fibroblasten, die während der Sakkulation und Alveolarisation20 eine wichtige Funktion in der Lunge haben und mit dem für die distale Zelldifferenzierung wichtigen Transkriptionsfaktor SOX9 koexprimiert werden (Abbildung 3).

Unsere Methode erzeugt effizient NKX2-1-exprimierende LPC-3D-Kulturen unter Verwendung von Signalmolekülen, die in der fetalen Lungenentwicklung auftreten, um frühe Lungenorganoide zu bilden. Bei der Übertragung von LPCs in das GFR-Basalmembranmatrixmedium zur Induktion von Lungenorganoiden ist es unerlässlich, nicht in eine einzelne Zellsuspension zu dissoziieren, sondern stattdessen kleine Zellklumpen (10 Zellen / Klumpen) zurückzuhalten. Die Zellzählung wird nicht vollständig genau sein, aber immer noch notwendig, um eine Überkonfluenz während der 3-wöchigen Lungenorganoiddifferenzierung zu vermeiden.

Die Lungenorganoidinduktion sollte bis zum Tag 6 der Induktion (Tag 23 der Differenzierung) kleine, verzweigte Organoide ergeben. Diese sollten während des Organoidverzweigungsschritts und des Reifeschritts weiter wachsen. Vierundzwanzig Stunden nach der Einführung von Dexamethason, cAMP und IBMX sollten sich die Zweige zu transparenten Kugeln ausdehnen. Die Analyse des gesamten Lungenorganoids kann am Ende der Differenzierung durchgeführt werden, oder die WLOs können mit GFR in eine frische Basalmembranmatrix übergehen oder durch Einfrieren in 10% DMSO kryokonserviert werden.

Abbildung 1: Gesamtschema der Differenzierung des gesamten Lungenorganoids (WLO) von hiPS-Zellen und repräsentativen Daten. (a) Schematische Darstellung der WLO-Differenzierung von hiPS-Zellen. Kreise stellen den endodermalen Zelltyp mit identifizierenden Markern dar. Die Zeitleiste der Differenzierung ist in schwarzen Balken angezeigt. Wachstumsfaktoren und/oder kleine Moleküle zur Induktion von endodermalen und lungenorganoiden Populationen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Stammzellen in etwa 16 Tagen in ein definitives Endoderm, ein vorderes Vorderdarmendoderm und in Lungenvorläuferzellen differenziert werden. Diese Zellen werden dann in das GFR-Basalmembranmatrixmedium mit Mediumseinsätzen überführt und durchlaufen eine Lungenorganoidinduktion, Verzweigung und Reifung. Die gesamte Differenzierung dauert ca. 35 Tage. (b) Repräsentative Phasenkontrastbilder der Zellen in den wichtigsten endodermalen Stadien und 3D-Bilder ganzer Lungenorganoide. Skalieren Sie die Größe der Leiste wie im Bedienfeld angegeben. (c) qRT-PCR-Analyse von Lungenentwicklungsmarkern während des Endoderms und (d) Differenzierung des gesamten Lungenorganoids von proximalen und distalen Zellmarkern. Alle Daten stellen durchschnittlich 3-5 biologische Replikate dar. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar und werden zu Aktin normalisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Charakterisierung der Endodermdifferenzierung durch Durchflusszytometrie und Immunzytochemie. (a) Durchflusszytometrie des definitiven Endodermmarkers CXCR4. Das linke Feld zeigt das Gating gegen die nicht gefärbte Population, während das mittlere Feld die CXCR4-positive Population zeigt. Das rechte Feld zeigt das immunzytochemische Bild von SOX17 (rot), das mit Kernen (blau) überlagert ist. (b) Immunzytochemisches Bild der AFE-Marker FOXA2 und SOX2, die mit Kernen überlagert sind (blau). (c) Endogene Expression von NKX2-1-GFP in einer Reporterzelllinie in 3D LPC. Bilder aus lebender Zellkultur in Hellfeld und GFP. Durchflusszytometrie des intrazellulären Lungenvorläufers NKX2-1 nach Fixierung und Permeabilisierung. Maßstabsleistengröße = 50 μM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Charakterisierung von 3D-Ganzlungenorganoiden nach 3-wöchiger Differenzierung durch Immunzytochemie. (a) Proximale Lungenmarker. Das linke Feld zeigt SOX2 (weiß) und SOX9 (rot), überlagert von Kernen (blau). Diese Marker sind wichtig für die verzweigte Morphogenese und repräsentieren die proximalen und distalen Epithelpopulationen. Die mittleren Felder zeigen P63 (rot) und KRT5 (rot), beides Marker von Basalzellen. Das rechte Feld zeigt SCGB3A2, einen Marker für Clubzellen. b) Distale Lungenmarker. Das linke Feld zeigt Pro-SPC (PSPC), (grün) und HOPX (rot), Marker von alveolären Typ-II-Ad-I-Zellen, die mit Kernen (blau) überlagert sind. Das mittlere Feld zeigt Pro-SPC (PSPC) (grün) und SPB (rot), Marker von alveolären Typ-II-Zellen, die mit Kernen (blau) überlagert sind. Das rechte Feld zeigt NKX2-1 (rot) und ZO1 (grün) mit Kernen überlagert (blau). c) Marker des Lungenmesenchyms. Das linke Feld zeigt PDGFRA (rot) und SOX9 (weiß), die das distale Mesenchym darstellen. Das rechte Bild zeigt Vimentin (rot), das in der Lunge verteilt ist. Maßstabsleistengröße = 50 μM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Tabelle der Medien.

Tabelle 2: Problembehandlung.

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