Der Artikel beschreibt die schrittweise gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zu dreidimensionalen ganzen Lungenorganoiden, die sowohl proximale als auch distale epitheliale Lungenzellen zusammen mit Mesenchym enthalten.
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Methodenartikel
Generierung von 3D-Ganzlungenorganoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen zur Modellierung der Lungenentwicklungsbiologie und -krankheit
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Entwicklung und Erkrankung der menschlichen Lunge war aufgrund des Mangels an biologisch relevanten In-vitro-Modellsystemen schwer zu untersuchen. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPS-Zellen) können schrittweise in mehrzellige 3D-Lungenorganoide differenziert werden, die sowohl aus epithelialen als auch aus mesenchymalen Zellpopulationen bestehen. Wir rekapitulieren embryonale Entwicklungssignale, indem wir zeitlich eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen einführen, um effizient definitive Endoderm-, anteriore Vorderdarm-Endoderm- und anschließend Lungen-Vorläuferzellen zu erzeugen. Diese Zellen werden dann in ein wachstumsfaktorreduziertes (GFR)-Basalmembranmatrixmedium eingebettet, so dass sie sich als Reaktion auf externe Wachstumsfaktoren spontan zu 3D-Lungenorganoiden entwickeln können. Diese ganzen Lungenorganoide (WLO) durchlaufen frühe Entwicklungsstadien der Lunge, einschließlich verzweigter Morphogenese und Reifung nach Exposition gegenüber Dexamethason, zyklischem AMP und Isobutylxanthin. WLOs besitzen Atemwegsepithelzellen, die die Marker KRT5 (basal), SCGB3A2 (Club) und MUC5AC (Kelch) exprimieren, sowie alveoläre Epithelzellen, die HOPX (alveolarer Typ I) und SP-C (alveolarer Typ II) exprimieren. Mesenchymalzellen sind ebenfalls vorhanden, einschließlich Aktin der glatten Muskulatur (SMA) und des von Thrombozyten abgeleiteten Wachstumsfaktorrezeptors A (PDGFRα). iPSC-abgeleitete WLOs können unter 3D-Kulturbedingungen für viele Monate aufbewahrt und nach Oberflächenmarkern sortiert werden, um eine bestimmte Zellpopulation zu reinigen. iPSC-abgeleitete WLOs können auch verwendet werden, um die menschliche Lungenentwicklung zu untersuchen, einschließlich der Signalübertragung zwischen dem Lungenepithel und dem Mesenchym, um genetische Mutationen auf die Funktion und Entwicklung menschlicher Lungenzellen zu modellieren und die Zytotoxizität von Infektionserregern zu bestimmen.
Einleitung
Die Lunge ist ein kompliziertes, heterogenes, dynamisches Organ, das sich in sechs verschiedenen Stadien entwickelt - embryonaler, pseudoglandulärer, kanalikulärer, sackulärer, alveolärer und mikrovaskulärer Reifung1,2. Die beiden letztgenannten Phasen treten prä- und postnatal in der menschlichen Entwicklung auf, während die ersten vier Phasen ausschließlich während der fetalen Entwicklung auftreten, es sei denn, es tritt eine Frühgeburt auf3. Die embryonale Phase beginnt in der endodermalen Keimschicht und endet mit dem Austrieb der Luftröhre und der Lungenknospen. Die Lungenentwicklu....
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Protokoll
Dieses Studienprotokoll wurde vom Institutional Review Board des Human Research Protections Program der UCSD (181180) genehmigt.
1. Definitive Endoderm-Induktion aus induzierten pluripotenten Stammzellen (Tag 1 - 3)
- Langsames Auftauen des Wachstumsfaktors reduziert (GFR)-Basalmembran (BM) Matrixmedium auf Eis 30 Minuten vor Gebrauch. In kaltem DMEM/F12-Gemisch das GFR BM-Matrixmedium 1:1 so verdünnen, dass es 50% dieses Mediums ausmacht. Legen Sie die P1000-Pipettenspitzen in den Gefrierschrank, um sie vor gebrauchen zu kühlen.
- Beschichten Sie jede Vertiefung einer 12-Well-Platte mit 500 μL 50% GFR-Basalmembranmatrixmedi....
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Ergebnisse
24 Stunden nach dem Plattieren, Tag 1, sollten iPS-Zellen 50% -90% konfluent sein. An Tag 2 sollte DE zu 90%-95% konfluent sein. Während der DE-Induktion ist es üblich, am Tag 4 einen signifikanten Zelltod zu beobachten, aber die angeschlossenen Zellen behalten eine kompakte Kopfsteinpflastermorphologie bei (Abbildung 2b). Brechen Sie die Differenzierung ab, wenn sich die Mehrheit der adhärenten Zellen löst, und erwägen Sie, die Exposition gegenüber DE-Medien mit Activin A um 6-12 h zu verkü.......
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Diskussion
Die erfolgreiche Differenzierung von 3D-Ganzlungenorganoiden (WLO) beruht auf einem mehrstufigen, 6-wöchigen Protokoll mit Liebe zum Detail, einschließlich der Zeit der Exposition gegenüber Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen, der Zelldichte nach dem Passieren und der Qualität der hiPS-Zellen. Informationen zur Problembehandlung finden Sie in Tabelle 2. hiPS-Zellen sollten etwa 70%-80% konfluent sein, mit weniger als 5% spontaner Differenzierung vor der Dissoziation. Dieses Protokoll erfordert das Me.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Diese Forschung wurde vom California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Cell Culture12-Well-Platten | |||
| Corning | 3512 | ||
| 12-Well-Einsätze, 0,4 μm, durchscheinend | VWR | 10769-208 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| Ascorbinsäure | Sigma | A4544 | |
| B27 ohne Retinsäure | ThermoFisher | 12587010 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) Fraktion V, 7,5% ige Lösung | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologien | 35050061 | |
| Ham' s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove' s Modifizierter Dulbecco" s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Ersatz (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/Karton) | Stammzelle Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/Strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Gesteinsinhibitor) | R& D Systems | 1254/1 | |
| Wachstumsfaktoren/Kleine Moleküle | |||
| Activin A | F& D Systems | 338-AC | |
| All-trans-Retinsäure (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R& D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethason | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R& D Systems | 3093 | |
| EGF | F& T D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | F& Technik D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | F& T & T D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthin) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | F& Forschung D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | F& Technik D Systems | 297-VP/CF | |
| strong>Primärantikörper | Verdünnungsrate | ||
| CXCR4-PE | R& D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0,215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0,25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0,1805555556 |
| SOX9 | R& D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (ausgereift) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (ausgereift) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
Referenzen
- Ten Have-Opbroek, A. A. Lung development in the mouse embryo. Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M.
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Nachdrucke und Genehmigungen
