Analyse der Lebermikroumgebung während des frühen Fortschreitens des nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung-assoziierten hepatozellulären Karzinoms im Zebrafisch

Zusammenfassung

Hier stellen wir vor, wie ein nicht-alkoholisches Fettlebererkrankung (NAFLD)-assoziiertes Hepatozelluläres Karzinom (HCC) Zebrafischmodell generiert werden kann, um die Auswirkungen von Cholesterinüberschuss auf die Lebermikroumgebung und die Immunzelllandschaft zu untersuchen.

Zusammenfassung

Leberkrebs ist derzeit die dritthäufigste krebsbedingte Todesursache weltweit, und das hepatozelluläre Karzinom (HCC) macht 75-90% aller Leberkrebsfälle aus. Mit der Einführung wirksamer Behandlungen zur Vorbeugung und Behandlung von Hepatitis B / C werden die nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) und die aggressivere Form, die als nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) bekannt ist, schnell zu den Risikofaktoren Nummer eins für die Entwicklung von HCC in modernen Gesellschaften. Um die Rolle von NASH bei der Entwicklung von HCC besser zu verstehen, haben wir einen NASH-assoziierten HCC-Zebrafisch entwickelt. Die optische Klarheit und genetische Nachvollziehbarkeit der Zebrafischlarven machen sie zu einem attraktiven und leistungsstarken Modell, um die Mikroumgebung der Leber und die Zusammensetzung der Immunzellen mit nicht-invasiver fluoreszierender Live-Bildgebung zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt, wie ein NASH-assoziiertes HCC-Zebrafischmodell verwendet werden kann, um die Wirkung von Cholesterinüberschuss in der Lebermikroumgebung und seine Auswirkungen auf die Zusammensetzung der Immunzellen in frühen Stadien der Krankheit zu untersuchen. Zuerst füttern wir HCC-Larven (s704Tg), die Hepatozyten-spezifisches aktiviertes Beta-Catenin exprimieren, mit einer 10% cholesterinreichen Diät für 8 Tage, um ein NASH-assoziiertes HCC-Modell zu entwickeln. Hier beschreiben wir, wie verschiedene transgene Linien verwendet werden können, um verschiedene frühe Malignitätsmerkmale in der Leber durch nicht-invasive konfokale Mikroskopie zu bewerten, wie Leberbereich, Zell- und Kernmorphologie (Hepatozytenbereich, Kernbereich, Kern-Zytoplasma-Verhältnis (N:C-Verhältnis), Kernzirkularität, Mikrokerne / Kernhernien-Scoring) und Angiogenese. Dann zeigen wir anhand transgener Linien mit markierten Immunzellen (Neutrophile, Makrophagen und T-Zellen), wie die Zusammensetzung von Leberimmunzellen in NASH-assoziierten HCC-Larven analysiert werden kann. Die beschriebenen Techniken sind nützlich, um die Lebermikroumgebung und die Immunzellzusammensetzung in frühen Hepatokarzinogenese-Stadien zu bewerten, aber sie können auch modifiziert werden, um solche Merkmale in anderen Lebererkrankungsmodellen zu untersuchen.

Einleitung

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist eine aggressive Krebserkrankung mit begrenzten therapeutischen Möglichkeiten. Es wurde festgestellt, dass mehr als 30% aller Patienten mit HCC fettleibig sind und NASH, eine aggressive Form von NAFLD 1,2,3,4^, haben. Der Verzehr von kalorienreichen Diäten erhöht die Fettsäureverfügbarkeit drastisch, was lokale und systemische Stoffwechselverschiebungen verursacht und Steatose, Hepatozytenverletzungen, Entzündungen und Fibrose auslöst - alles Schlüsselmerkmale von NASH. Die NASH-Progression zu HCC beinhaltet die Ansammlung von Lipiden in der Leber, die Entzündungen und eine veränderte Immunzellzusammensetzung auslöst ^5,6,7. Es ist von besonderem Interesse und Bedeutung zu verstehen, wie die Lebermikroumgebung und die Immunzelllandschaft während des Fortschreitens der Lebererkrankung verändert werden und wie sie sich aufgrund bestimmter ätiologischer Faktoren verändert. Um die Auswirkungen des Cholesterinüberschusses auf die Mikroumgebung der Leber und die Immunzelllandschaft besser zu identifizieren, haben wir ein einzigartiges Zebrafischmodell für NASH-assoziiertes HCC entwickelt. Die Verwendung dieses Modells hat uns ein besseres Verständnis der Auswirkungen von Ernährung und Überernährung auf die Mikroumgebung der Leber und das Fortschreiten der Lebererkrankung gegeben.

Säugetiermodelle, wie Mäuse und menschliche Gewebeproben, waren wesentlich für das Verständnis der Pathogenese von Steatohepatitis und Steatose⁸. Mäuse sind das bevorzugte Modell für Lebererkrankungen und Krebs, aber es fehlt ihnen an optischer Klarheit auf zellulärer Ebene, während menschlichen Gewebeproben oft die 3D-Umgebung fehlt, die Tiermodelle imitieren können. Diese Hindernisse haben Zebrafische zu einem leistungsstarken Modell in der Forschungsgemeinschaft gemacht. Zebrafische haben bemerkenswerte Ähnlichkeiten mit Menschen, mit mindestens 70% Generhaltung. Sie erhalten die Mikroumgebung der Leber, die zelluläre Zusammensetzung, Funktion, Signalübertragung und Reaktion auf Verletzungen ^9,10. Unter Verwendung einer cholesterinreichen Diät (HCD) in Kombination mit einem etablierten transgenen Zebrafischmodell von HCC haben wir ein Zebrafischmodell von NASH-assoziiertem HCC entwickelt.

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das erklärt, wie man ein NASH-assoziiertes HCC-Zebrafischmodell generiert und wie man die Mikroumgebung der Leber untersucht und frühe Malignitätsmerkmale in vivo behandelt. Mit nicht-invasiver konfokaler Mikroskopie in Kombination mit transgenen Zebrafischlinien mit fluoreszenzmarkierter Hepatozytenmembran und -kern können wir frühe Malignitätsmerkmale durch die Analyse der Lebermorphologie (Fläche, Volumen und Oberfläche), der Zell- und Kernmorphologie (Hepatozytenbereich, Kernbereich, N:C-Verhältnis, Kernzirkularität, Mikrokerne / Kernhernienbewertung) und Angiogenese (Gefäßdichte) untersuchen. Die Mikroumgebung von Immunzellen ist auch ein wichtiges Merkmal der Hepatokarzinogenese^11,12,13,14, daher zeigen wir auch, wie die Zusammensetzung von Leberimmunzellen in NASH-assoziierten HCC-Larven unter Verwendung transgener Zebrafischlinien mit markierten Immunzellen (Neutrophile^, Makrophagen und T-Zellen) analysiert werden kann. Die beschriebenen Techniken sind einzigartig für das Modell und äußerst nützlich, um die Lebermikroumgebung und die Immunzellzusammensetzung beim Fortschreiten der Lebererkrankung zu bewerten.

Protokoll

Tierversuche werden nach Verfahren durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Albert Einstein College of Medicine genehmigt wurden. Rezepturen für Puffer und Lösungen, die im Protokoll verwendet werden, entnehmen Sie bitte der Zusatztabelle 1.

1. Vorbereitung von 10% Cholesterin-angereicherte Diät für akuten Cholesterinüberschuss.

1. Wiegen Sie 2 x 4 g Golden Pearl Diet 5-50 nm Active Spheres (GPAS) in zwei 25-ml-Glasbechergläsern - eines für die normale Diät (ND) und das andere für die 10% High Cholesterol Diät (HCD).
   HINWEIS: Jede kommerzielle Trockenfutterdiät für Zebrafischlarven kann verwendet werden.
2. Wiegen Sie 0,4 g Cholesterin in einem 10 ml Glasbecherglas. Decken Sie das Becherglas mit etwas Folie ab.
3. Messen Sie 5 ml Diethylether mit einer 10-ml-Spritze mit einer 20-G-Nadel. Als nächstes den Diethylether in das ND-Becherglas geben und sofort mit einem Spatel mit dem Trockenfutter vermischen.
   ACHTUNG: Diethylether verursacht Augen-, Haut- und Atemwegsreizungen. Nur in einem chemischen Abzug verwenden.
4. Messen Sie erneut 5 ml Diethylether mit einer 10-ml-Spritze mit einer 20-G-Nadel und geben Sie es in das 10-ml-Becherglas mit Cholesterin, mischen Sie es sofort mit der Spritze auf und ab.
5. Geben Sie die Cholesterinlösung schnell in das HCD-Becherglas und mischen Sie sie sofort mit einem Spatel, bis die Lösung gleichmäßig ist.
6. Lassen Sie die Becher bis zu 24 h in der Haube, um den Diethylether vollständig zu verdampfen. Am nächsten Tag mahlen Sie GPAS-Diäten mit einem Stößel und Mörser zu feinen Partikeln.
   HINWEIS: Das Mahlen der Diäten ist ein entscheidender Schritt, Larven können keine Partikel größer als 50 nm essen.
7. Jede Diät in einen kleinen, beschrifteten Plastikbeutel oder in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben und bei -20 °C lagern.

2. NASH-Induktion mit kurzfristiger Larvenfütterung mit cholesterinangereicherter Diät - statische Bedingungen.

1. Richten Sie an Tag -1 transgene Fischschnüre ein (Tabelle 1). Am nächsten Morgen (Tag 0), nachdem die Fische gelaicht haben, sammeln Sie Eier in einem Maschensieb.
2. Spülen Sie die Eier gründlich mit einer Waschflasche mit Embryowasser (E3) aus und geben Sie die Eier vorsichtig in eine 10 cm große Petrischalen mit E3-Medium.
3. Reinigen Sie die Platten von allen Trümmern, die sich in den Zuchtboxen angesammelt haben könnten, einschließlich toter oder unbefruchteter Eier.
   HINWEIS: Das Spülen der Eier und das Reinigen der Platten ist entscheidend, um unkontrolliertes Wachstum von Mikroorganismen und daraus resultierende Defekte bei der Larvenentwicklung zu vermeiden.
4. Teilen Sie die Eier in einer Dichte von 70/80 pro 10 cm Petrischalen (in 25 ml E3). An Tag 1 werden tote Embryonen oder Embryonen mit Entwicklungsstörungen unter einem mit einer Transilluminationsbasis ausgestatteten Sezierfernrohr überprüft und gereinigt.
   HINWEIS: Verwenden Sie den Transilluminationsbasis-Dunkelfeldmodus, um Embryonen mit Entwicklungseffekten zu identifizieren und das Wachstum von Mikroorganismen in den Platten zu überprüfen. Verschiedene Anlagen haben unterschiedliche Mikroorganismenausbeute in ihren Systemen. Wechseln Sie bei Bedarf das E3-Medium und/oder das Geschirr, um negative Auswirkungen zu vermeiden.
5. An Tag 5 Larven aus allen Gerichten in einer 15 cm Petrischale kombinieren, E3 ohne Methylenblau hinzufügen. Als nächstes teilen Sie die Larven wie folgt in die Futterboxen (Tabelle 2).
   HINWEIS: Um gesunde Larven zu erzeugen, ohne eine systemische chronische Entzündung auszulösen, sollten Larven unter Kontrollbedingungen mit etwa 0,1 mg Nahrung pro Larve und Tag gefüttert werden. Beachten Sie, dass die Gesamtmenge an Nahrung (Tabelle 2) gleichmäßig in zwei Fütterungen pro Tag aufgeteilt wird.
6. Halten Sie die Larven in einem Inkubator bei 28 °C, in einem Dunkel-Hell-Zyklus (z. B. 14 h hell / 10 h dunkel zyklisch) und füttern Sie die Larven zweimal täglich von Tag 5 bis Tag 12.
7. Saugen Sie täglich Speisereste sowie 90-95% des Mediums mit einem Vakuumsystem ab, das an einer 1-ml-Pipettenspitze befestigt ist. Als nächstes gießen Sie vorsichtig neues E3 ohne Methylenblau in eine Ecke der Futterbox, um die Larven nicht zu beschädigen.
   HINWEIS: Die tägliche Reinigung der Futterboxen ist entscheidend, um das unkontrollierte Wachstum von Mikroorganismen zu vermeiden.

3. Sammlung von Larven 13 Tage nach der Befruchtung aus Futterboxen.

1. Bereiten Sie an Tag 13 das Sammelgeschirr entsprechend der Anzahl der Versuchsbedingungen vor, die eingerichtet wurden. Machen Sie mit einem Permanentmarkerstift eine Markierung an der Seite des Geschirrs (Deckel und Boden), um ein Wechseln von Proben zu vermeiden, zum Beispiel einen schwarzen Streifen für normale Ernährung (ND) und zwei schwarze Streifen für HCD.
2. Gießen Sie genug E3 ohne Methylenblau, um den Boden jeder Schale zu bedecken. Saugen Sie das Wasser vorsichtig mit dem Vakuumsystem aus den Futterboxen ab, versuchen Sie, Ablagerungen oder tote Larven vom Boden abzusaugen, um zu vermeiden, dass diese Materialien in die Auffangschalen übertragen werden.
3. Wenn der Wasserstand niedrig wird, heben Sie die Futterbox langsam an, damit die Larven zu einer der Ecken schwimmen, und saugen Sie dann in die entgegengesetzte Richtung ab.
   HINWEIS: Verwenden Sie 1 ml Pipette mit geschnittenen Spitzen in verschiedenen Höhen, um unterschiedliche Durchmesser beim Ansaugen des Wassers zu ermöglichen. Wechseln Sie zwischen den verschiedenen Größen, beginnen Sie mit einem größeren Durchmesser und wechseln Sie zu einem kleineren, wenn das Wasservolumen abnimmt und die Larvendichte zunimmt.
4. Sobald nur etwa 20-30 ml Flüssigkeit vorhanden sind, dekantieren Sie die Larven vorsichtig in die in Schritt 1 vorbereitete Auffang-Petrischale. Legen Sie das beschriftete Klebeband aus dem Futterkasten auf den Deckel der Schale.
5. Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.4 für alle Futterboxen.

4. Kontrolltest für diätinduzierte Lebersteatose - Ölrot O (ORO) Färbung, Bildgebung und Scoring.

1. Mit einer Pasteur-Glaspipette 15-20 Larven in ein 2 ml rundes Bodenrohr überführen und ca. 15-30 min auf Eis legen. Entfernen Sie die meisten Medien aus dem Röhrchen.
2. Fügen Sie 2 ml von 4% Paraformaldehyd (PFA) hinzu, um Larven zu fixieren, und inkubieren Sie bei 4 ° C über Nacht.
3. Am nächsten Morgen entfernen Sie 4% ige PFA-Lösung und waschen Sie die Larven dreimal mit 2 ml 1x PBS.
4. Bereiten Sie eine 12-Well-Platte (Abbildung 2A) pro Bedingung mit einem Netzvertiefungseinsatz vor.
5. Übertragen Sie die Larve mit einer Glaspipette aus dem 2-ml-Röhrchen in den zuvor im Brunnen platzierten Einsatz und fügen Sie 5 ml 1x PBS hinzu. Bewahren Sie die 2-ml-Röhrchen für die Probenlagerung nach der Färbung auf.
   VORSICHT: Larven sind in diesem Stadium extrem klebrig Verwenden Sie keine Plastikpipetten.
6. Transfer mit Larven in eine andere Vertiefung mit 5 ml 60% iger Isopropanollösung. Larven für 30 min Raumtemperatur (RT) inkubieren.
7. In der Zwischenzeit bereiten Sie ein 0,3% Ölrot-O in 60% iger Isopropanol-Lösung vor. Filtern Sie die 0,3%ige Ölrotlösung zweimal mit einem 0,45-μm-Spritzenfilter.
   HINWEIS: Bereiten Sie 5 ml Lösung pro Vertiefung vor, indem Sie 3 ml 0,5% Ölrot O in Isopropanol mit 2 ml destilliertem Wasser mischen. Das 0,3% Oil Red O in 60% Isopropanol Lösung muss frisch zubereitet werden.
8. Als nächstes wird der Netzeinsatz mit Larven in eine andere Vertiefung mit 5 ml frisch hergestelltem 0,3% Ölrot-O in 60% Isopropanol-Lösung überführt. Inkubierte Larven für 3 h bei RT mit leichtem Schaukeln.
9. Nach der ORO-Färbung die Larven abspülen, indem Sie sie mit 60% Isopropanol in eine andere Vertiefung bringen. Waschen Sie die Larven zweimal in 60% Isopropanol für jeweils 30 Minuten, indem Sie nacheinander mit 60% Isopropanol in Vertiefungen einsetzen.
10. Larven dreimal für 5 min in 1x PBS-0,1% Tween waschen, indem nacheinander mit 1x PBS-0,1% Tween in Vertiefungen eingesetzt werden.
11. Übertragen Sie Larven in die 2 ml Röhrchen. PBST entfernen, 1 ml 80% Glycerin hinzufügen und bei 4 °C bis zur Bildgebung lagern.
12. Für eine bessere Bildgebung übertragen Sie Larven auf 1x PBS-0,1% Tween und unter einem Sezierbereich sezieren Lebern, indem Sie vorsichtig Gewebe mit zwei # 55 Pinzetten ziehen.
    HINWEIS: Bei Verwendung eines Casper-Hintergrundbildes kann die gesamte Larve verwendet werden.
13. Mit einer Glaspipette die Leber vorsichtig in eine Vertiefung einer Porzellan-Spotplatte mit 50% Glycerin geben. Positionieren Sie Lebern mit einem kleinen Werkzeug, um Larven zu manipulieren (z. B. Wimpernwerkzeug - Abbildung 2B). Bildleber in einem Stereomikroskop, das mit einer Farbkamera ausgestattet ist.
14. Score Lebersteatose (keine ORO-Färbung = keine; hellrote ORO-Färbung = mild; rot-dunkelrote ORO-Färbung = mittel/schwer).

5. Nicht-invasive konfokale Bildgebung mit dem Zebrafisch-Verwundungs- und Einklemmgerät für Wachstum und Bildgebung (zWEDGI).

1. Bereiten Sie eine 10 cm große Petrischale mit 15-20 ml 1x Tricain-E3 vor, gerade genug, um den Boden zu bedecken.
   HINWEIS: Eine 1x Tricain-E3-Arbeitslösung (0,16 mg/ml) kann durch Verdünnen von 2 ml einer 25-fachen Tricain-Stammlösung (4 mg/ml) in 48 ml E3 erhalten werden. Die Tricainkonzentration darf 0,16 mg/ml nicht überschreiten, da Larven in diesem Entwicklungsstadium extrem empfindlich auf die Narkose reagieren.
2. 15-20 Larven mit einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff in die Petrischale mit 1x Tricain-E3 geben und Larven 5 min anästhesieren.
3. Bereiten Sie eine 6-Well-Platte mit 2-3 ml E3 ohne Methylenblau pro Vertiefung vor.
4. Screenen Sie die betäubten Larven auf einem fluoreszierenden Stereomikroskop auf gewünschte Fluoreszenzmarker (Tabelle 1). Übertragen Sie gescreente Larven in der minimalen Menge an Tricain in E3 und lassen Sie sie in der 6-Well-Platte erholen, bis es Zeit ist, Bilder zu machen.
   HINWEIS: Das Screening von doppelten, dreifachen und vierfachen transgenen Larven braucht Zeit, platziert Larven in E3 und wechselt häufig das Medium von der 6-Well-Platte, um eine unnötige Exposition gegenüber Tricain zu verringern. Auch Larven in diesem Entwicklungsstadium schwimmen, also verwenden Sie ein Wimpernwerkzeug, um Larven für das Screening zu positionieren, ohne Gewebeschäden zu verursachen.
5. Bereiten Sie nach dem Screening eine 10 cm große Petrischale mit 25 ml 1x Tricain-E3 vor. 15-20 Larven mit einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff in die Petrischale mit 1x Tricain-E3 geben und Larven 5 min anästhesieren.
6. In der Zwischenzeit wird unter dem Stereomikroskop 1x Tricain-E3 in die Kammern des Verwundungs- und Einklemmgeräts (z.B. zWEDGI)^15,16 gegeben. Entfernen Sie Luftblasen aus den Kammern und dem Rückhaltetunnel mit einer P200-Mikropipette. Entfernen Sie alle überschüssigen 1x Tricain-E3, so dass nur genug Volumen übrig bleibt, um die Kammern zu füllen.
7. Eine betäubte Larve wird in die Ladekammer des zWEDGI überführt und mit einem Wimpernwerkzeug unter dem Stereomikroskop positioniert. Klopfen Sie vorsichtig auf den Kopf der Larven und drücken Sie ihn so, dass der Schwanz in den Rückhaltetunnel eintritt. Zusätzlich entfernen Sie mit der Mikropipette 1x Tricain-E3 aus der Wundkammer, um der Larve zu helfen, in den Tunnel einzudringen. Stellen Sie sicher, dass die Larve für die Bildgebung des linken Lappens angemessen positioniert ist - Inverses Mikroskop: linke Seite nach unten; Aufrechtes Mikroskop: linke Seite nach oben.
   HINWEIS: Wenn kein zWEDGI verfügbar ist, können Fische montiert und in 1% niedriger Schmelzpunktagarose in 1x Tricain-E3 positioniert werden, jedoch kann die Agarose-Immersion nur für eine schnelle Bildgebung (bis zu 15 min) verwendet werden.
8. Für die Hepatozyten- und Kernmorphologieanalyse werden die Bildleber mit einem konfokalen Mikroskop unter Verwendung eines 40-fachen Luftobjektivs und z-Stapeln von 2 μm optischen Schnitten aufgenommen. Für Lebermorphologie, Angiogenese und Immunzellrekrutierungsassays Bildleber unter Verwendung eines 20-fachen Luftobjektivs und Z-Stacks von 5 μm optischen Schnitten. Für Larven mit großen Lebern sollten 2 x 2 Kachelbilder gemacht werden, um eine Bildgebung der gesamten Leber und Umgebung von 75 μm zu gewährleisten.
9. Verwenden Sie nach der Bildgebung eine Pasteur-Pipette aus Kunststoff mit 1x Tricain-E3, um die Larve aus dem Rückhaltetunnel zu ziehen und in eine Petrischale mit E3 ohne Methylenblau zu überführen.

6. Analyse der morphologischen Variationen der Leber.

HINWEIS: Die unten aufgeführten Schritte werden für die Quantifizierung der Leberoberfläche und des Lebervolumens durchgeführt:

1. Öffnen Sie die Imaging-Software. Fügen Sie einen Ordner mit den zu analysierenden Bilddateien zu Arena hinzu, indem Sie das Symbol Ordner beobachten auswählen. Als nächstes wählen Sie mit einem Rechtsklick auf die Miniaturansichten In natives Imaris-Dateiformat konvertieren, um Dateien in das Format (.ims) zu konvertieren.
2. Passen Sie im Untermenü Übergeben Helligkeit und Kontrast für jeden Kanal an. Als nächstes erstellen Sie eine Oberfläche aus Leber, indem Sie auf die blaue Schaltfläche Neue Oberflächen hinzufügen klicken.
3. Wählen Sie anschließend im Bereich Oberflächenerstellung die Option Segmentieren Sie nur einen Bereich von Interesse , um manuell eine Oberfläche der Leber zu erstellen.
4. Klicken Sie auf Automatische Erstellung überspringen | Option manuell bearbeiten. Wählen Sie "Kontur" und deaktivieren Sie die Option "Lautstärke" im Szenenfenster.
   HINWEIS: Die Option Volume-Ansicht muss deaktiviert werden, da sonst die Auswahl der Region von Interesse in verschiedenen Z-Stacks nicht möglich ist.
5. Navigieren Sie durch Z-Stacks und zeichnen Sie den gewünschten Bereich in jeder Ebene, indem Sie Modus auswählen und den gewünschten Zeichenmodus auswählen. Um mit dem Zeichnen zu beginnen, wechseln Sie den Zeiger in den Auswahlmodus und nicht in den Navigationsmodus, klicken Sie anschließend auf Zeichnen und ziehen Sie den Mauszeiger durch die Leber, um einen ROI zu zeichnen.
6. Nachdem Sie einen ROI in den verschiedenen Fokusebenen ausgewählt haben, wählen Sie Oberfläche erstellen, um alle ausgewählten ROIs zusammenzuführen und eine Leberoberfläche zu erstellen .
7. Als nächstes erstellen Sie mit der neu erstellten Oberfläche eine Maske des Hepatozytensignals. Klicken Sie auf die Fläche und wählen Sie auf der Registerkarte Bearbeiten (der Bleistift) die Option Alle maskieren. Wählen Sie im angezeigten Fenster den Kanal aus, den Sie maskieren möchten, der zur Quantifizierung des Lebervolumens und der Leberoberfläche verwendet wird. Wählen Sie dann Voxel außerhalb der Fläche auf 0 setzen und aktivieren Sie die Option Kanal duplizieren , bevor Sie die Maske anwenden.
8. Verwenden Sie Leberoberflächen- und Lebervolumenwerte aus dem statistischen Analysemenü für die Analyse.

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte zur Quantifizierung des Leberbereichs durch.

9. Öffnen Sie die Fidschi-Software. Wählen Sie im Menü Plugins die Option Bio-Formate gefolgt von Bioformat-Importer, aktivieren Sie die Option Kanäle teilen , um die Bilddatei zu öffnen.
10. Wählen Sie im Menü Bild die Option Eigenschaften , um zu überprüfen, ob das Bild die richtige Pixelgröße und Voxeltiefe aufweist, wenn nicht die richtigen Werte. Gehen Sie anschließend zum Menü Bilder, klicken Sie auf Anpassen , gefolgt von Helligkeit und Kontrast, um die Helligkeit und den Kontrast des Bildes anzupassen.
11. Als nächstes erzeugt die Verwendung von Hepatozytenkanälen eine Projektion der Leber mit maximaler Intensität. Gehen Sie zum Menü Bilder, klicken Sie auf Stapel gefolgt von Z-Projekt. Wählen Sie Projektion mit maximaler Intensität.
12. Erstellen Sie mit dem Freihand-Auswahlwerkzeug manuell eine Region von Interesse (ROI) um die Larvenleber. Klicken Sie anschließend im Menü Analysieren auf Messen , um den Leberbereich zu erhalten. Speichern Sie die Ergebnisse zur weiteren Analyse als Tabelle.

7. Hepatozyten- und Kernmorphologische Analyse.

1. Öffnen Sie die Fidschi-Software. Wählen Sie im Menü Plugins die Option Bio-Formate aus, gefolgt von Bioformate Importeur aktivieren Sie die Option Kanäle teilen , um die Bilddatei zu öffnen.
2. Wählen Sie im Menü Bild die Option Eigenschaften , um zu überprüfen, ob das Bild die richtige Pixelgröße und Voxeltiefe aufweist, wenn nicht die richtigen Werte. Gehen Sie anschließend zum Menü Bilder, klicken Sie auf Anpassen , gefolgt von Helligkeit und Kontrast, passen Sie die Helligkeit und den Kontrast des Bildes an.
3. Wählen Sie im Menü Analysieren die Option Messungen festlegen und aktivieren Sie alle Parameter, die Sie analysieren möchten (z. B. Flächen-, Umfangs- und Formdeskriptoren). Wählen Sie den Fluoreszenzkanal der Hepatozytenmembran. Navigieren Sie durch Z und verwenden Sie das Freihand-Auswahlwerkzeug, um einen perfekten ROI um einen Hepatozyten zu zeichnen. Klicken Sie anschließend im Menü Analysieren auf Messen , um die Hepatozytenfläche zu berechnen.
4. Wiederholen Sie Schritt 7.3 für 15-30 Hepatozyten. Speichern Sie die Ergebnisse zur weiteren Analyse als Tabelle.
5. Als nächstes wählen Sie den Kernfluoreszenzkanal aus. Navigieren Sie durch Z und verwenden Sie das Freihand-Auswahlwerkzeug, um einen perfekten ROI um den Hepatozytenkern zu zeichnen. Klicken Sie anschließend im Menü Analysieren auf Messen , um die Kernfläche und die Zirkularität zu berechnen.
6. Wiederholen Sie Schritt 7.5 für 15-30 Hepatozyten. Speichern Sie die Ergebnisse als Tabelle für weitere Analysen, einschließlich der Quantifizierung des Kern-Zytoplasma-Verhältnisses.
7. Bewerten Sie die Proben für das Vorhandensein von Mikrokernen und Hernien wie folgt (Tabelle 3).

8. Angiogenese-Analyse.

1. Erstellen Sie manuell eine Oberfläche für die Leber, wie in Abschnitt 6 dieses Protokolls beschrieben. Nennen Sie diese Oberfläche als "Leberoberfläche".
2. Erstellen Sie eine Maske für das Signal der Endothelzellen in der Leber. Klicken Sie auf die Oberfläche und wählen Sie unter der Registerkarte "Bearbeiten" (dem Bleistift) die Option "Alle maskieren". Wählen Sie im angezeigten Fenster den Kanal der Endothelzellen, um Gefäßsignale nur von der Leber zu isolieren. Wählen Sie Voxel outside surface auf 0 setzen und aktivieren Sie die Option Duplicate channel (Kanal duplizieren ), bevor Sie Maske anwenden.
3. Benennen Sie den neuen maskierten Kanal der Endothelzellen in Lebergefäße um.
4. Um Gefäßvolumen und Oberfläche zu messen, erstellen Sie eine zweite Oberfläche. Klicken Sie auf die blaue Schaltfläche Neue Flächen hinzufügen . Stellen Sie im ersten Schritt der Flächenerstellung sicher, dass alle Optionen deaktiviert sind, um automatisch eine Fläche zu erstellen.
5. Im zweiten Schritt wählen Sie Lebergefäßkanal, um eine Oberfläche zu erstellen. Deaktivieren Sie die Glättungsoption, um so viele Details wie möglich von Gefäßen zu erkennen und die Hintergrundsubtraktion in der Schwellenwertoption zu aktivieren.
6. Stellen Sie den Schwellenwert so ein, dass die erkannte Oberfläche mit dem Lebergefäßsignal kolokalisiert. Verwenden Sie Oberflächen- und Volumenwerte aus dem Menü für statistische Analysen. Berechnen Sie den Gefäßdichteindex mit den folgenden Gleichungen:
   Gefäßdichteindex (durch Leber μm 2) = (Gefäßoberfläche (μm 2)) / (Leberoberfläche (μm²))
   Gefäßdichteindex (durch Leber μm 3) = (Gefäßvolumen (μm 3)) / (Lebervolumen (μm³))

9. Analyse der Rekrutierung von Immunzellen.

1. Öffnen Sie die Fidschi-Software. Wählen Sie im Menü Plugins die Option Bio-Formate aus, gefolgt von Bioformate Importeur aktivieren Sie die Option Kanäle teilen , um die Bilddatei zu öffnen.
2. Wählen Sie im Menü Bild die Option Eigenschaften, um zu überprüfen, ob das Bild die richtige Pixelgröße und Voxeltiefe aufweist, wenn nicht die richtigen Werte. Als nächstes gehen Sie zum Menü Bilder, klicken Sie auf Anpassen, gefolgt von Helligkeit und Kontrast, passen Sie die Helligkeit und den Kontrast des Bildes an (z. B. Makrophagen - mCherry oder dTomato; Neutrophile - BFP; T-Zellen - EGFP; Hepatozyten - EGFP oder mCherry).
3. Erstellen Sie als Nächstes Projektionen mit maximaler Intensität für jeden Kanal.
4. Wie in Abschnitt 6 (Schritte 6.9-6.12) beschrieben, erstellen Sie einen ROI um die Larvenleber und messen Sie den Leberbereich. Erstellen Sie einen zweiten ROI einschließlich Leberfläche und 75 μm Umgebung ("Rekrutierungsbereich").
5. Wählen Sie anschließend im Menü Bearbeiten die Option Auswahl und anschließend Zum Manager hinzufügen. Wenn Sie einen angeborenen Immunzellkanal Maximum Intensity Projection auswählen, klicken Sie im ROI-Manager-Fenster auf den Leber-ROI, um den Rekrutierungsbereich festzulegen.
6. Wählen Sie im Menü Plugins die Option Analysieren , gefolgt von Zellzähler und zählen Sie Immunzellen im Rekrutierungsbereich. Rekordzahl der rekrutierten Immunzellen im Leberbereich in einer Tabelle.
7. Berechnen Sie Neutrophile, Makrophagen- und T-Zell-Dichten, indem Sie die Anzahl der Immunzellen pro Leberbereich normalisieren.

Ergebnisse

Durch die Einführung einer kurzfristigen cholesterinreichen Diät in ein hepatozelluläres Karzinom (HCC) Zebrafischmodell, das eine hepatozytenspezifische konstitutiv aktive Form von Beta-Catenin (s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)¹⁷ sind wir in der Lage, ein Nicht-Säugetier-Wirbeltiermodell von NASH-assoziiertem HCC zu erstellen. Das Fortschreiten der Lebererkrankung kann frühzeitig überwacht werden, indem Lebersteatose, Lebergröße, Hepatozyten, Kernmorphologie, Angiogenese und Immunzellinfiltration gemessen werden (Abbildung 1).

HCC-Larven, die mit normaler Ernährung gefüttert werden, zeigen keine bis leichte Lebersteatose, gemessen durch Ölrot-O-Färbung. HCC-Larven, die mit einer cholesterinreichen Diät gefüttert werden, zeigen jedoch einen signifikanten Anstieg der Lebersteatose (Abbildung 2).

Ein bekannter Marker für Lebererkrankungen ist Hepatomegalie¹⁷. Um die Lebergröße zu bewerten, können HCC-Larven mit einer transgenen Linie ausgekreuzt werden, die spezifisch einen fluoreszierenden Marker auf Hepatozyten exprimiert, wie die Tg (fabp10a: H2BmCherry). Zur Beurteilung der Hepatomegalie wird eine Beurteilung des Leberbereichs (2D), der Leberoberfläche und des Lebervolumens (3D) durchgeführt. Nach 8 Tagen Exposition gegenüber einem Cholesterinüberschuss wurde bei HCC-Larven eine Lebervergrößerung beobachtet (Abbildung 3).

Mit nicht-invasiver Live-Bildgebung können transgene Fischlinien, die fluoreszierende Proteine in Hepatozytenmembranen (wie Tg(fabp10a:Life-actin-EGFPP) und in Hepatozytenkernen (wie Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) exprimieren, verwendet werden, um zelluläre und nukleäre morphologische Veränderungen im Zusammenhang mit Malignität in Hepatozyten zu beurteilen. Die Hepatozytenfläche war sowohl im NASH-assoziierten HCC (Abbildung 4A,B,D) als auch im Kernbereich (Abbildung 4C,E) und im Kern-Zytoplasma-Verhältnis (Abbildung 4F) erhöht. Eine signifikante Abnahme der Kernzirkularität wurde auch in der HCD+HCC-Gruppe beobachtet (Abbildung 4G). Lipotoxizität löst DNA-Schäden aus, ein Merkmal der Karzinogenese in Gegenwart von Mikrokernen. Unter Verwendung des H2B-mCherry-Markers beobachteten wir eine größere Inzidenz von Mikrokernen in den HCC-Larven, die mit einer cholesterinreichen Diät gefüttert wurden (Abbildung 4H).

Das hepatische Gefäßsystem kann in Zebrafischmodellen leicht mit einer transgenen markierten Linie wie Tg (kdrl:mCherry oder Tg(fli:EGFP) bewertet werden, die das Gefäßsystem kennzeichnen. Ein signifikanter Anstieg der Gefäßdichte wurde bei HCC+HCD-Larven beobachtet (Abbildung 5).

Um die früh ausgelöste Entzündungsreaktion im NASH-assoziierten HCC zu beobachten, wurde eine transgene Fischlinie, die fluoreszierende Proteine in Makrophagen und Neutrophilen wie Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP) exprimiert, mit der transgenen HCC-Linie ausgekreuzt. Die Infiltration von Neutrophilen und Makrophagen tritt sowohl bei HCC als auch bei HCC auf, die mit HCD gefüttert werden, was durch Quantifizierung der Anzahl und Dichte von Neutrophilen/Makrophagen in der Leber und Umgebung (Umgebung bis zu 75 μm) beurteilt wurde (Abbildung 6A-H). Dennoch zeigte das HCC+HCD einen signifikanten Anstieg der Neutrophilenzahl und -dichte (Abbildungen 6F-H). 13 Tage nach der Befruchtung ist das adaptive Immunsystem bereits funktionsfähig. Verwendung einer transgenen Fischlinie, die fluoreszierendes Protein in T-Zellen exprimiert, wie die Tg (lck: EGFP), und in Kombination mit der HCC-transgenen Linie; Wir bewerteten den Einfluss eines Cholesterinüberschusses auf die Rekrutierung von T-Zellen in die Leber. Eine signifikante Abnahme der T-Zelldichte und der Gesamtzahl wurde bei HCC-Larven beobachtet, die mit HCD gefüttert wurden (Abbildung 6I-K).

Transgene Zebrafischlinien	ZFIN-Referenz	Probe
Casper	RoyA9; MitfaW2	Lebersteatose
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus / fabp10a:H2B-mCherry )	s704Tg / uwm41Tg	Lebermorphologie
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP)	s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg	Hepatozyten und Kernmorphologie
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ cryaa:Venus; fli:EGFP)	s704Tg / y1Tg	Angiogenese
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus;  mfap4:Tomaten-CAAX; lyzC:BFP)	s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg	Rekrutierung von Makrophagen und Neutrophilen
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; lck:EGFP)	s704Tg / cz1Tg	T-Zellen Rekrutierung

Tabelle 1: Transgene Zebrafischlinien zur Verwendung in verschiedenen Assays.

Anzahl der Larven	Größe der Futterbox	Menge der Nahrung pro Tag (mg)	E3 Volumen (ml)
30-40	Kleine Zuchtbox	3-4	200
60-80	Kleine/große Zuchtbox	6-8	400
100-150	Große Zuchtbox	10-15	500

Tabelle 2: Richten Sie die Bedingungen für Fütterungsboxen ein.

Phänotyp	Scoring-Methode
Nichts	Normale Kerne, keine Mikrokerne oder Hernien
Leicht	Geringe Anzahl von Mikrokernen (weniger als 5 pro Sichtfeld) und/oder Hernienvorfall
Mittelschwer/ Schwer	Mittlere bis hohe Anzahl von Mikrokernen (mehr als 5 pro Sichtfeld) und/oder Hernien

Tabelle 3: Mikrokerne und nukleare Hernienbewertung.

Abbildung 1: Protokolldiagramm, das die wichtigsten experimentellen Schritte und den Analyseansatz zusammenfasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Kontrolltest für Lebersteatose - ORO-Färbung. HCC-Larven wurden mit normaler oder cholesterinreicher Diät gefüttert und eine Ölrot-O-Färbung (ORO) wurde durchgeführt, um die Lebersteatose zu beurteilen. (A) Diagramm der 12-Well-Platte zur Durchführung einer sequentiellen ORO-Färbung unter Verwendung der Netzvertiefungseinsätze. (B) Bild eines Wimpernwerkzeugs, das zur Manipulation von Larven verwendet wird. (C) repräsentative Bilder von Lebern, die mit Ölrot gefärbt sind; HCC und HCC + HCD Larven. (D) Chi-Quadrat-Diagramm, das den Prozentsatz der Larven mit unterschiedlicher Bewertung der Lebersteatose zeigt. Maßstabsbalken= 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Repräsentative Bilder der Lebergröße. Transgene HCC-Larven, die einen Lebermarker exprimierten (Tg(fabp10a:H2B-mCherry)) wurden live und nicht-invasiv auf einem konfokalen inversen Spinning-Disk-Mikroskop mit einem zWEDGI abgebildet. (A) Repräsentative 3D-Rekonstruktionen von Lebern in HCC- und HCC+HCD-Larven. (B-D) Grafik mit morphologischen Veränderungen der Leber einschließlich Leberfläche (B), Leberoberfläche (C) und Lebervolumen (D) bei HCC- und HCC+HCD-Larven. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Repräsentative Bilder aus Hepatozyten und Zellkernmorphologie. Transgene HCC-Linien, die fluoreszierende Proteine in Hepatozytenmembranen (Tg(fabp10a:Life-actin-EGFP) und in Hepatozytenkernen (Tg(fabp10a:H2B-mCherry) exprimieren, wurden abgebildet. (A-C) Repräsentative 3D-Rekonstruktionen von F-Aktin- und Hepatozytenkernen von HCC- und HCC+HCD-Larven. Offene Pfeilspitzen zeigen vergrößerte Kerne; weiße Pfeilspitzen zeigen Kern mit veränderter Form; und rote Pfeile zeigen Mikrokerne und Kernhernien. (D-G) Grafiken, die Mittelwerte von Zell- und Kernparametern in HCC und HCC+HCD 13 Tage alten Larven zeigen. (D) Hepatozytenbereich. e) Nukleargebiet. (F) Kern-Zytoplasma-Verhältnis. g) Kernzirkularität. Jeder Punkt stellt den Durchschnitt pro Larve dar. Punktdiagramme zeigen mittlere ±SEM (H) Chi-Quadrat-Diagramme, die den Prozentsatz der Larven mit unterschiedlicher Bewertung von Mikrokernen und Kernhernien zeigen. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Repräsentative Bilder aus dem hepatischen Gefäßsystem. Transgene HCC-Linien, die fluoreszierende Proteine in Hepatozytenkernen (Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) und in Endothelzellen (Tg)fli:EGFP)) exprimieren. (A) Repräsentative 3D-Rekonstruktionen des Lebergefäßsystems in HCC- und HCC+HCD-Larven. (B-C) Grafik mit Gefäßdichteindex nach Leberoberfläche (B) Volumen (C) in HCC und HCC + HFCD Larven. Punktdiagramme zeigen den Mittelwert ±REM. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Repräsentative Bilder aus der Leber-Immunzelllandschaft. Transgene HCC-Linie, die fluoreszierende Proteine in Makrophagen und Neutrophilen (Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP) oder in T-Zellen (Tg(lck-EGFP) exprimiert. (A,C,F) Repräsentative 3D-Rekonstruktionen von Lebern und Leukozytenrekrutierung in den Leberbereich in 13 Tage alten HCC- und HCC+HCD-Larven. (B) Diagramm des abgebildeten Leberbereichs. (D-E) Grafik mit Makrophagendichte (D) und Anzahl (E) im Leberbereich bei HCC- und HCC+HCD-Larven. (G-H) Grafik mit Neutrophilendichte (G) und Anzahl (H) im Leberbereich bei HCC- und HCC+HCD-Larven. (G) Repräsentative 3D-Rekonstruktionen der T-Zell-Rekrutierung in den Leberbereich in HCC- und HCC+HCD-Larven. (H-I) Grafik mit T-Zelldichte (H) und Anzahl (I) im Leberbereich bei HCC- und HCC+HCD-Larven. Punktdiagramme zeigen den Mittelwert ±REM. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Zusatztabelle 1: Tabelle der Puffer und Lösungen Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Mit einer erhöhten Inzidenz von HCC, insbesondere NASH-induziertem HCC, ist es von großer Bedeutung, effizientere Modelle zu haben, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die an NASH-assoziiertem HCC beteiligt sind. Die Dekonvolution von Zell-Zell-Interaktionen in der Leber ist entscheidend, um das Fortschreiten der Lebererkrankung und die Hepatokarzinogenese besser zu verstehen. Der in diesem Protokoll beschriebene Ansatz bietet eine einzigartige Möglichkeit, das Fortschreiten der Lebererkrankung in vivo und nicht-invasiv zu analysieren.

Die Vorbereitung der Diät ist entscheidend für den Erfolg der Etablierung eines NASH-assoziierten HCC-Modells. Es ist wichtig, Diethylether vollständig im Abzug verdampfen zu lassen, um schädliche Auswirkungen zu vermeiden, während Futter für Zebrafische zubereitet wird. Um diese Diäten mit Larven (5-12 Tage nach der Befruchtung) zu verwenden, ist es äußerst wichtig, die Diäten in feine Partikel zu mahlen, um die Nahrungsaufnahme durch die Larven sicherzustellen. Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Fettsäureanaloga kann verwendet werden, um die Nahrungsaufnahme in Larven zu bewerten.

Bevor die Larven in die Zuchtboxen gelegt und mit dem Fütterungsvorgang begonnen wird, ist es wichtig, sicherzustellen, dass die experimentelle Probenahme durch Mischen von Larven aus verschiedenen Platten einheitlich ist. Dieser Schritt ist wichtig, da verschiedene Mikroumgebungen, beginnend mit Tag 0, in jeder der Platten gefördert werden und die Entzündungsreaktion beeinflussen können.

Ein weiterer wichtiger Schritt besteht darin, die Larven zu zählen, um zu wissen, wie viel Nahrung für jede Futterbox benötigt wird. Wenn die Menge an Nahrung nicht für die Anzahl der in jeder Box vorhandenen Larven ausreicht, tritt eines der beiden Szenarien ein: 1) Larven werden unterernährt; 2) Larven werden überfüttert. Eine ungenaue Fütterung führt zu ungesunden Bedingungen im Zusammenhang mit Unterernährung oder Überernährung, wie z. B. Entzündungen, die die Mikroumgebung der Leber drastisch beeinträchtigen. Wenn eine ungenaue Fütterung auftritt, zeigen Larven Bewegungsprobleme. In diesem Entwicklungsstadium sollten Larven intensiv schwimmen, daher wurden Larven unter ungesunden Bedingungen (Unterernährung oder Exposition gegenüber toxischen Cholesterindosen aufgrund von Überfütterung) aufgezogen, wenn Bewegungsprobleme festgestellt werden. Aus diesem Grund müssen die Fütterungsverfahren für beide Diäten, normale und cholesterinangereicherte Diäten, streng kontrolliert werden. Einige Assays können durchgeführt werden, um die Genauigkeit der Fütterung und Gesundheit von Larven schnell zu verbessern, einschließlich des Vorhandenseins von Hepatomegalie (Lebergröße) und Entzündungen von Geweben und Organen, insbesondere Leber und Darm (sichtbare erhöhte Infiltration von Neutrophilen und Makrophagen).

Die tägliche Reinigung und der Austausch von 95% von E3 ist entscheidend, um das Wachstum von Mikroorganismen in den Futterboxen zu reduzieren und die Gesundheit und das Überleben der Larven zu verbessern. Alternativ können Larven in einem Stand-alone-Rack-System platziert werden. Für beste Ergebnisse legen Sie 60-80 Larven in einen 3-Liter-Tank. Halten Sie den Wasserfluss auf einem minimalen Niveau, indem Sie den Fluss auf einen schnell tropfenden Modus einstellen und die Larven zweimal täglich (morgens und nachmittags) mit 3-4 mg füttern. Der Wasserfluss sollte regelmäßig überprüft werden, um einen korrekten Durchfluss in jedem Tank zu gewährleisten. In unserem Labor gibt uns diese Methode 95-100% Überleben bei kurzfristiger Fütterung von 10% HCD. Darüber hinaus reduzierte diese Methode den Arbeitsaufwand für die tägliche Reinigung und den Wasseraustausch, die im beschriebenen statischen Fütterungsprotokoll erforderlich sind, erheblich.

Während wir eine 10% cholesterinangereicherte Diät verwendeten, um NASH in einer kurzfristigen Exposition zu induzieren (5 Tage reichen aus, um Steatohepatitis zu induzieren), können Ernährungsumstellungen durchgeführt und erweitert werden, um Fructose ¹⁸, Fettsäuren (wie Palmitinsäure)¹⁹ oder Fütterungsprotokolle zu verwenden, die mit einer 4% cholesterinangereicherten Diät erweitert werden können²⁰. Derzeit gibt es nur wenige erfolgreiche therapeutische Ziele für HCC und keine für NASH. Die Verwendung von Zebrafischmodellen bietet eine einzigartige Gelegenheit, unser Wissen über die Hepatokarzinogenese zu erweitern, aber auch ein beispielloses Wirbeltiersystem, um Medikamentenscreenings mit großem Durchsatz durchzuführen. Die in diesem Protokoll beschriebenen Techniken werden zukünftige Erkenntnisse und therapeutische Ziele für Lebererkrankungen und Hepatokarzinogenese erleichtern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Cholesterin	Sigma	C8667-25G	Leicht abbaubar. Lagern -20°C.
Corning Netwells Trägerkit 15 mm	Fisher	07-200-223
Corning Netwells Einsätze	Fisher	07-200-212
Diethylether	Fisher	60-046-380	Leicht flüchtig.
Dumont Pinzette #55 dumostar	Fisher	NC9504088
Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in	Fisher	22-183624
4% Paraformaldehyd (PFA)	Elektronenmikroskopie Wissenschaft	15710
Golden Pearl Diät 5– 50 nm Active Spheres	Brine Shrimp Direct	-	Jedes handelsübliche Trockenfutter in Pulverform für Larven kann verwendet werden.
Graduierte Transferpipetten	Fisher	22-170-404
Isopropanol	Fisher	BP26181
PBS, pH7.4, 10X, 10er Pack	Crystalgen	221-1422-10
Petrischalen 100X20MM	Fisher	08-747D
Tricain	Sigma	A-5040
Tween 20	Fisher	BP337-500
Öl Rot O Lösung 0,5% Isopropanol	Sigma	O1391-500ML
Tricain	Sigma	A-5040
Tween 20	Fisher	BP337-500
Vactrap	VWR	76207-630	Vakuumsystem zum Sammeln von Larven
Mikroskopen
Fluoreszierendes Stereomikroskop	Leica	M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large
Spinning Disk Konfokales Mikroskop	Nikon	Nikon CSU-W1
Stereomikroskop	Leica	S9i mit durchleuchteter Basis
Software
Fiji	Open-Source-Java-Bildverarbeitungsprogramm.
Imaris 9.6	Bitplane; Oxford Instrumente.