Der Mechanismus, der mit Phagozytose bei Leishmanien-Infektionen verbunden ist, ist noch wenig verstanden. Hier beschreiben wir Methoden, um die frühen Ereignisse zu bewerten, die während der Leishmania-Interaktion mit den Wirtszellen auftreten.
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Methodenartikel
Untersuchung der Phagozytose der Leishmanie mittels konfokaler Mikroskopie
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Phagozytose ist ein orchestrierter Prozess, der verschiedene Schritte umfasst: Erkennen, Binden und Verinnerlichen. Professionelle Phagozyten nehmen Leishmanien-Parasiten durch Phagozytose auf, die aus der Erkennung von Liganden auf Parasitenoberflächen durch mehrere Wirtszellrezeptoren besteht. Die Bindung von Leishmanien an Makrophagenmembranen erfolgt durch Komplementrezeptor Typ 1 (CR1) und Komplementrezeptor Typ 3 (CR3) und Mustererkennungsrezeptoren. Lipophosphoglycan (LPG) und 63 kDa Glykoprotein (gp63) sind die Hauptliganden, die an Makrophagen-Leishmanien-Interaktionen beteiligt sind. Nach der ersten Erkennung von Parasitenliganden durch Wirtszellrezeptoren werden Parasiten internalisiert, überleben und vermehren sich in parasitophoren Vakuolen. Der Reifungsprozess von Leishmanien-induzierten Vakuolen beinhaltet den Erwerb von Molekülen aus intrazellulären Vesikel, einschließlich des monomeren G-Proteins Rab 5 und Rab 7, des lysosomalen assoziierten Membranproteins 1 (LAMP-1), des lysosomalen assoziierten Membranproteins 2 (LAMP-2) und des Mikrotubuli-assoziierten Proteins 1A / 1B-Lichtkette 3 (LC3).
Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der frühen Ereignisse, die während der Leishmania-Interaktion mit den Wirtszellen auftreten, mittels konfokaler Mikroskopie, einschließlich (i) Bindung, (ii) Internalisierung und (iii) Phagosomenreifung. Durch die Erweiterung des Wissens über diese Determinanten des Infektionsergebnisses hoffen wir, das Verständnis der Pathogenese der Leishmanien-Infektion zu verbessern und die Suche nach neuen chemotherapeutischen Zielen zu unterstützen.
Einleitung
Leishmaniose ist eine vernachlässigte Tropenkrankheit, die durch Protozoenparasiten der Gattung Leishmanien verursacht wird und zu einem breiten Spektrum klinischer Manifestationen im Wirbeltierwirt führt, einschließlich kutaner Leishmaniose, mukokutaner Leishmaniose und viszeraler Leishmaniose 1. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) schätzt, dass über eine Milliarde Menschen gefährdet sind, wobei mehr als eine Million neue Fälle pro Jahr gemeldetwerden 2.
Leishmania spp. sind obligate intrazelluläre Protozoen, die in Wirtszellen überleben, einschließlich Monozyten, Makropha....
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Protokoll
Die Zellen wurden von gesunden Spendern nach Genehmigung der Verfahren durch die Nationalen Forschungsethikkommissionen gewonnen (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. Zellkulturen
- Humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen
HINWEIS: Um humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen für die In-vitro-Differenzierung in Makrophagen zu erhalten, sammeln Sie Blut von gesunden Spendern und reinigen Sie periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC), wie von D. English und B. R. Andersen beschrieben21.- Nachdem Sie peripheres Blut (50 ml) gesammelt haben, gießen Sie es in ein heparinisiertes Röhrchen und verdünnen Sie....
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Ergebnisse
Dieser Bericht zielt darauf ab, die frühen Ereignisse zu bewerten, die während der Phagozytose von L. braziliensis auftreten, die von Patienten mit L. braziliensis-LCL- oder L. braziliensis-DL-Form von CL isoliert wurden. Mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie untersuchten wir die wichtigsten Ereignisse, die mit der Phagozytose von Parasiten verbunden sind: Bindung, Internalisierung und Phagosomenreifung. Wir untersuchten zuerst die L. braziliensis-LCL- oder L. braziliensis-DL-Bindung un.......
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Diskussion
Leishmanien-Makrophagen-Interaktion ist ein komplexer Prozess und umfasst mehrere Schritte, die die Krankheitsentwicklung beeinflussen können5. Um die Mechanismen der Interaktion von nicht opsonisierten Leishmanien und Wirtszellen besser zu verstehen, haben wir ein Protokoll beschrieben, das konfokale Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Phagozytose vom frühen bis zum späten Stadium der Leishmanien-Infektion zu beurteilen. Die Verwendung von Fluoreszenztechniken mit .......
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Offenlegungen
Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung oder -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts. Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.
Danksagungen
Wir danken dem Gonçalo Moniz Institut, Fiocruz Bahia, Brasilien und der Abteilung für Mikroskopie für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde von INOVA-FIOCRUZ Nummer 79700287000 unterstützt, P.S.T.V. hält einen Zuschuss für Produktivität in der Forschung von CNPq (305235/2019-2). Plasmide wurden freundlicherweise von Mauricio Terebiznik, University of Toronto, CA, zur Verfügung gestellt. Die Autoren danken Andris K. Walter für die Überarbeitung der englischen Sprache und die Unterstützung beim Manuskriptlektorat.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios keine Stelle | |
| Anti-LC3-Antikörper | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Rot (CMTPX) Farbstoff | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Zentrum; fuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2-Inkubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Konfokales Fluoreszenzmikroskop (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluoreszenzmikroskop (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamin | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normales Ziegenserum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Gerät Lonza | AAB-1001 | ||
| Nukleofector | Lösung Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyd | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol Myristatacetat (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphatpufferlösung (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insektenmedium | Sigma | S0146 | |
| Natriumbicarbonat | Sigma | S5761 | |
| Natriumpyruvat | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
Referenzen
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
- World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1(201....
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Nachdrucke und Genehmigungen
