Methodenartikel

Ein schneller Multiplex-Dual-Reporter-IgG- und IgM-SARS-CoV-2-Neutralisationsassay für ein multiplexed Bead-basiertes Durchflussanalysesystem

DOI:

10.3791/62487

⸱

6. April 2021

 ,  ,  , 
1Luminex Corporation, 2Departments of Pathology and Laboratory Medicine, Clinical Microbiology, University of Rochester Medical Center, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ein Flow-Analysesystem für perlenbasierte Multiplex-Assays, das eine Zwei-Reporter-Ablesung ermöglicht, wurde für die Entwicklung von multiplex-serologischen und Antikörper-Neutralisationsassays verwendet, die gleichzeitig neutralisierende IgG- und IgM-Antikörper für SARS-CoV-2 messen können.

Zusammenfassung

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Die COVID-19-Pandemie hat die Notwendigkeit schneller Hochdurchsatzmethoden für den sensitiven und spezifischen serologischen Nachweis von Infektionen mit neuartigen Krankheitserregern wie SARS-CoV-2 unterstrichen. Multiplex-serologische Tests können besonders nützlich sein, da sie gleichzeitig Antikörper gegen mehrere Antigene analysieren können, die die Pathogenabdeckung optimieren und die Variabilität im Organismus und die individuelle Wirtsreaktion steuern. Hier beschreiben wir einen SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluoreszierenden Mikrosphären-basierten Assay, der sowohl IgM- als auch IgG-Antikörper gegen drei wichtige SARS-CoV-2-Antigene nachweisen kann - das Spike(S)-Protein, die Spike-Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE2)-Rezeptor-Bindungsdomäne (RBD) und das Nukleokapsid (Nc). Es wurde gezeigt, dass der Assay eine vergleichbare Leistung wie ein SARS-CoV-2-Referenzassay für IgG im Serum aufweist, der nach ≥21 Tagen nach Symptombeginn erhalten wurde, aber eine höhere Empfindlichkeit mit Proben aufwies, die nach ≤5 Tagen nach Symptombeginn gesammelt wurden. Darüber hinaus wurde unter Verwendung von löslichem ACE2 in einem Neutralisationsassay-Format eine Hemmung der Antikörperbindung für S und RBD nachgewiesen.

Einleitung

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Die COVID-19-Pandemie hat die Bedeutung der schnellen Entwicklung und Implementierung schneller, leistungsstarker serologischer Tests mit hohem Durchsatz und derEntstehung unterstrichen, die zur Diagnose und Überwachung neuartiger Krankheitserreger wie SARS-CoV-2 eingesetzt werden können. Multiplex-serologische Tests können in einer Pandemie äußerst nützlich sein, da sie gleichzeitig Antikörper gegen mehrere Antigene analysieren können, was eine breite Pathogenabdeckung und Kontrollen für die Variabilität im Organismus und die Reaktion des Wirts auf Infektionen ermöglicht. Die Entwicklung eines multiplex-fluoreszierenden Perlen-basierten Assays, des SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), der Antikörper gegen das Spike(S)-Protein, die Spike-Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE2) Rezeptor-bindende Domäne (RBD) und Nukleokapsid (Nc) von SARS-CoV-2 nachweisen kann1. 3Flex zeigte eine vergleichbare Leistung wie ein SarS-CoV-2-IgG-Referenzassay für Serum, das nach ≥21 Tagen nach Symptombeginn erhalten wurde, hatte jedoch eine höhere Empfindlichkeit mit Proben, die nach ≤5 Tagen nach Symptombeginn gesammelt wurden. Zusätzlich wurde die Hemmung der Antikörperbindung für S- und RBD-Antigene unter Verwendung von löslichem ACE2 in einem Neutralisationsassay-Format nachgewiesen. Die auf Multiplex-Perlen basierende Technologie wurde weithin als bewährte Technologie für serologische Multiplex-Tests eingesetzt und hat deutliche Vorteile für das großflächige Screening, einschließlich kurzer Zeit bis zu den Ergebnissen, geringem Probenbedarf und reduziertem Arbeitsaufwand2,3,4.

Vor kurzem ist ein neues Durchflussanalysegerät verfügbar, das die gleiche High-Plex-Hochdurchsatzfähigkeit des Systems bietet, die in früheren Arbeiten1demonstriert wurde, jedoch mit dem zusätzlichen Vorteil von zwei Reporterkanälen. Die Fähigkeit, zwei fluoreszierende Reportersignale in einer einzigen Reaktion zu messen, ermöglicht die Bewertung von zwei Ergebnissen pro Analyt für jede Probe und ist ideal für Isotypisierungsanwendungen, die typischerweise in separaten Reaktionsbohrungen durchgeführt werden müssen5. Die Dual-Reporter-Fähigkeit liefert doppelt so viele Daten für jede Probe in halb so vielen Reaktionsbohrungen mit der Hälfte des Probenvolumenbedarfs und hat damit einen klaren Vorteil gegenüber Einzel-Reporter-Systemen. Diese Studie beschreibt das serologische Standard-Assay-Protokoll und beschreibt die Anpassung an einen Neutralisationsassay. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht die Umwandlung des Einzelreporter-Assays in einen serologischen Dual-Reporter-Assay und anschließend in einen Dual-Reporter-Neutralisierungsassay, um gleichzeitig neutralisierende Antikörper sowohl der IgG- als auch der IgM-Isotypen gegen die SARS-CoV-2 S-, RBD- und Nc-Antigene zu messen. Eine visuelle Übersicht über das Assay-Protokoll finden Sie in Abbildung 1.

Protokoll

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Restproben von humanem Serum, die zuvor auf SARS-CoV-2-Diagnoseanalysen getestet wurden, wurden in dieser Studie verwendet, die vom Institutional Review Board der University of Rochester genehmigt wurde.

1. Reagenzien und Ausrüstung

  1. Erhalten Sie Coronavirus-Antigene und menschliches IgG und IgM aus kommerziellen Quellen.
  2. Beziehen Sie Assay Control (AC) Perlensets (45 und 220) vom Gerätehersteller. Das AC-Perlenset 45 überwacht die MFI-Sammlung (Median Fluorescence Intensity) auf RP1-Instrumenten (Single Reporter Channel). Das AC-Perlenset 220 überwacht die MFI-Sammlung auf dem zweiten Reporterkanal (RP2).
  3. Erhalten Sie Nachweisantikörper und antigenspezifische Kaninchenseren und Antikörper, die zur Kopplungsbestätigung verwendet werden.
  4. Führen Sie den Nachweis mit Biotin-markierten Antikörpern entweder mit einem Streptavidin-, R-Phycoerythrin-Konjugat (SAPE) oder einem Streptavidin-Konjugat des Fluorophors Super Bright 436 (SASB; Anregung bei 405 Nanometern (nm) und Emission bei 436 nm) durch.
  5. Erhalten Sie menschliches ACE2-Protein (d. H. Der SARS-Rezeptor). Vor der Anwendung lyophilisiertes ACE2-Protein rehydrieren, indem es in nukleasefreiem Wasser (nicht DEPC-behandelt, autoklaviert und 0,2 μm sterilfiltriert) auf eine Konzentration von 1 mg/ml auflöst und bei 4 °C lagern.
  6. Führen Sie alle Reaktionen in schwarzen Flachbodenplatten (NBS) mit 96 Well nonbinding surface (NBS) durch. Versiegeln Sie die Platten mit 96-Well-Mikroplatten-Aluminium-Dichtband für Assay-Inkubationsschritte. Verwenden Sie einen magnetischen Plattenabscheider für die Assay-Waschschritte.

2. Antigen-gekoppelte und Antikörper-gekoppelte Kontrollperlen-Herstellung

  1. Kovalente Kopplung magnetischer, Polystyrol- und farbcodierten Mikrosphärensätze (6,5-μm-Durchmesser) mit S-, RBD- und Nc-Antigenen, wie in Cameron et al.1beschrieben. Coronavirus-Antigene sind mit 10 pmol/106 Perlen (S) und 100 pmol/106 Perlen (RBD und Nc) gekoppelt. Kontrollperlen in Verbindung mit menschlichem IgG oder IgM werden wie zuvor beschrieben erzeugt1. IgG und IgM sind mit 5 μg/106 Perlen gekoppelt.
  2. Nach der Kopplung die Perlenkonzentrationen bestimmen und jede Brühe mit den beschriebenen Verfahren6auf 1 x10 6 Perlen/ml verdünnen.
  3. Bestätigung der Antigenkopplung mit antigenspezifischen Antikörpern von Kaninchen oder mit positiven menschlichen Seren, wie in Cameron et al.1beschrieben.
    1. Bestätigen Sie die humane IgG-Kopplung mit den biotinylierten anti-humanen IgG/SAPE-Nachweisreagenzien des Assays und die IgM-Kopplung mit einem Phycoerythrin (PE)-markierten Ziegen-Anti-Human-IgM.
      HINWEIS: Die Kopplungsbestätigung erfolgt mit einer Titration von proteinspezifischem Serum oder Antikörper, da die optimale Konzentration für diese Reagenzien nicht bekannt ist. Für Serum werden serielle Faltenverdünnungen verwendet, während für Antikörper, die als mg/ml-Vorräte geliefert werden, serielle μg/ml-Verdünnungsreihen verwendet werden.
  4. Verdünnte Assay Control (AC)-Perlen, die die MFI-Sammlung in den beiden Reporterkanälen überwachen, bis zu einer Konzentration von 1 x10 6 Perlen/ml vor der Verwendung in Multiplex-Perlenmischungen.

3. Frische Multiplex-Perlenmischungszubereitung

  1. Bereiten Sie Multiplex-Perlenmischungen jeden Tag frisch aus den einzelnen gekoppelten Perlen vor und kontrollieren Sie die Perlenbestände bei 1 x10 6 Perlen / ml.
    HINWEIS: Multiplex-Perlenmischungen sind so vorbereitet, dass sie 2.500 Perlen für jede Perlenregion in einem Volumen von 50 μL liefern. Berechnungen zur Herstellung von Multiplex-Perlenmischungen für eine beliebige Anzahl von Reaktionen sind im Blog von Angeloni (2020)6beschrieben.

4. Probenverdünnung

  1. Bereiten Sie eine 1:100 Serumprobenverdünnung vor, indem Sie 10 μL Serum in 990 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mischen, die 0,05% Tween 20, 0,02% Natriumazid und 1% Rinderserumalbumin (BSA) (PBS-TBN-Puffer) enthält.
  2. Verdünnen Sie die Proben erneut 10-fach, indem Sie 20 μL der 1:100-Verdünnung auf 180 μL PBS-TBN geben.
    HINWEIS: Serumproben bestehen aus negativen Seren von Proben, die 2019 vor der COVID-19-Pandemie gesammelt wurden, und positiven Seren von SARS-CoV-2 PCR-positiven Patienten, die niedrige und hohe Antikörpertiter darstellen. Positive Proben wurden zwischen ≈3 und >60 Tage nach Symptombeginn (DFSO) gesammelt. Alle Serumproben und IgG-entfernten Negativkontrollseren werden wie unten beschrieben auf 1:1000 verdünnt. Für Neutralisationsassays werden Seren 1:500 verdünnt, wie in den folgenden Neutralisationsprotokollen (Abschnitte 6 und 8) beschrieben.

5. Serologisches Assay-Protokoll mit einem einzigen Reporter

  1. Fügen Sie 50 μL Multiplex-Perlenmischung zu jeder zugewiesenen Vertiefung einer 96-Well-nicht bindenden Mikrotiterplatte hinzu.
  2. Pipetten Sie 50 μL 1:1000 Serum oder PBS-TBN in die entsprechenden Vertiefungen; die endgültige Verdünnung des Serums in der Vertiefung beträgt 1:2000.
  3. Decken Sie die Platte mit einer Mikroplattenfoliendichtung ab und inkubieren Sie sie auf einem beheizten Plattenschüttler bei 37 °C für 15 min mit Schütteln bei 600 U /min.
  4. Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenschüttler und legen Sie sie für 2 min auf den Magnetplattenabscheider, um die Perlen vom Reaktionsgemisch zu trennen.
  5. Entfernen Sie die Folienversiegelung, kehren Sie die Platte vorsichtig über einen Abfallbehälter um und streichen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen.
  6. Die Platte auf saugfähigem Papier abtloten, während Sie die Platte noch auf dem Magneten halten.
  7. Waschen Sie die Reaktionsschächte wie unten beschrieben (erste Inkubationswäsche nach der Probe).
    1. Entfernen Sie die Platte vom Plattenmagneten und fügen Sie 150 μL PBS-TBN zu jeder Vertiefung hinzu.
    2. Die Platte mit einer frischen Folienversiegelung abdecken und bei 37 °C für 2 min bei 600 U/min schütteln.
    3. Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenschüttler und legen Sie sie für 2 min auf den Plattenmagneten, um die Perlen von der Reaktionsmischung zu trennen.
    4. Entfernen Sie die Folienversiegelung, kehren Sie die Platte vorsichtig über einen Abfallbehälter um und streichen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen.
    5. Die Platte auf saugfähigem Papier abtloten, während Sie die Platte noch auf dem Magneten halten.
  8. Waschen Sie die Reaktionsschächte wie unten beschrieben (zweite Inkubationswäsche nach der Probe).
    1. Entfernen Sie die Platte vom Plattenmagneten und fügen Sie 150 μL PBS-TBN zu jeder Vertiefung hinzu.
    2. Die Platte mit einer frischen Folienversiegelung abdecken und bei 37 °C für 2 min bei 600 U/min schütteln.
    3. Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenschüttler und legen Sie sie für 2 min auf den Plattenmagneten, um die Perlen von der Reaktionsmischung zu trennen.
    4. Entfernen Sie die Folienversiegelung, kehren Sie die Platte vorsichtig über einen Abfallbehälter um und streichen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen.
    5. Entfernen Sie die Platte vom Magneten.
  9. Machen Sie eine frische Mischung aus Biotin-Anti-Human-IgG mit SAPE, indem Sie den Antikörper auf 0,62 μg / ml und den SAPE auf 1 μg / ml verdünnen. Fügen Sie 100 μL zu jeder Vertiefung hinzu.
  10. Decken Sie die Platte mit einer Mikroplattenfoliendichtung ab und inkubieren Sie sie auf einem beheizten Plattenschüttler bei 37 °C für 15 min mit Schütteln bei 600 U /min.
  11. Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenschüttler und legen Sie sie für 2 min auf den Magnetplattenabscheider, um die Perlen vom Reaktionsgemisch zu trennen.
  12. Entfernen Sie die Folienversiegelung, kehren Sie die Platte vorsichtig über einen Abfallbehälter um und streichen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen.
  13. Die Platte auf saugfähigem Papier abtloten, während Sie die Platte noch auf dem Magneten halten.
  14. Waschen Sie die Reaktionsschächte wie unten beschrieben (erste Antikörper-Inkubationswäsche nach dem Nachweis).
    1. Entfernen Sie die Platte vom Plattenmagneten und fügen Sie 150 μL PBS-TBN zu jeder Vertiefung hinzu.
    2. Die Platte mit einer frischen Folienversiegelung abdecken und bei 37 °C für 2 min bei 600 U/min schütteln.
    3. Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenschüttler und legen Sie sie für 2 min auf den Plattenmagneten, um die Perlen von der Reaktionsmischung zu trennen.
    4. Entfernen Sie die Folienversiegelung, kehren Sie die Platte vorsichtig über einen Abfallbehälter um und streichen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen.
    5. Die Platte auf saugfähigem Papier abtloten, während Sie die Platte noch auf dem Magneten halten.
  15. Waschen Sie die Reaktionsschächte wie unten beschrieben (zweite Antikörper-Inkubationswäsche nach dem Nachweis).
    1. Entfernen Sie die Platte vom Plattenmagneten und fügen Sie 150 μL PBS-TBN zu jeder Vertiefung hinzu.
    2. Die Platte mit einer frischen Folienversiegelung abdecken und bei 37 °C für 2 min bei 600 U/min schütteln.
    3. Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenschüttler und legen Sie sie für 2 Minuten auf den Magnetplattenabscheider, um die Perlen vom Reaktionsgemisch zu trennen.
    4. Entfernen Sie die Folienversiegelung, kehren Sie die Platte vorsichtig über einen Abfallbehälter um und streichen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen.
    5. Entfernen Sie die Platte vom Magneten.
  16. Fügen Sie 100 μL PBS-TBN zu jeder Vertiefung hinzu.
  17. Mit Folienversiegelung abdecken und 2 min bei 37 °C schütteln.
  18. Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenschüttler. Entfernen Sie dann die Foliendichtung und lesen Sie 50 μL jeder Vertiefung auf dem Durchflussanalysator gemäß der Bedienungsanleitung ab. Eine kurze Beschreibung finden Sie unten.
    1. Wählen Sie das Dropdown-Menü in der oberen linken Ecke des Bildschirms und navigieren Sie zu Plattenkonfiguration.
    2. Wählen Sie Run Plate(
    3. Wählen Sie das Symbol Auswerfen aus, um den Plattenträger auszuwerfen.
    4. Laden Sie die Platte auf den Plattenträger und wählen Sie das Symbol Zurückziehen, um den Plattenträger einzuziehen.
    5. Wählen Sie das Symbol Ausführen aus, um die Platte auszuführen.

6. Einzelreporter-Neutralisations-Assay-Protokoll

  1. Bereiten Sie eine frische Multiplex-Perlenmischung vor, wie in Abschnitt 3 oben beschrieben.
  2. Verdünnen Sie die Patienten- und Kontrollseren 1:500 wie folgt.
    1. Serum 1:100 verdünnen, indem 10 μL Serum in 990 μL PBS-TBN gemischt werden.
    2. Serum um das weitere 5-fache verdünnen, indem Sie 40 μL 1:100 Serum in 160 μL PBS-TBN geben.
  3. Fügen Sie 50 μL Multiplex-Perlenmischung zu jeder zugewiesenen Vertiefung einer 96-Well-nicht bindenden Mikrotiterplatte hinzu.
  4. Jeder Vertiefung werden 25 μL ACE2-Verdünnung von 2 μg/ml zufügig.
  5. Decken Sie die Platte mit einer Mikroplattenfoliendichtung ab und inkubieren Sie sie auf einem beheizten Plattenschüttler bei 37 °C für 2 min mit Schütteln bei 600 U /min.
  6. Entfernen Sie die Platte vom Plattenschüttler und entfernen Sie die Folienversiegelung.
  7. Fügen Sie 25 μL 1:500 Serum oder PBS-TBN zu den zugewiesenen Vertiefungen hinzu.
  8. Decken Sie die Platte mit einer Mikroplattenfoliendichtung ab und inkubieren Sie sie auf einem beheizten Plattenschüttler bei 37 °C für 15 min mit Schütteln bei 600 U /min.
  9. Führen Sie für den Rest des Untersuchungsverfahrens die Schritte 5.4 bis 5.18.5 wie oben beschrieben aus.

7. Umstellung auf einen dualen IgG- und IgM-serologischen Assay

  1. Bereiten Sie antigengekoppelte Perlen wie in Abschnitt 2 oben beschrieben vor.
    HINWEIS: Ein zusätzliches Perlenset, gekoppelt mit menschlichem IgM, ist enthalten, um die Zugabe von Anti-IgM-Erkennungsreagenzien zu überwachen, sowie ein zusätzliches AC-Perlenset (220) zur Überwachung der MFI-Sammlung für RP2. Alle Perlenbestände liegen bei 1 x 106 Perlen / ml für die Aufnahme in Multiplex-Perlenmischungen, wie unten beschrieben.
  2. Bereiten Sie frische Multiplex-Perlenmischungen wie in Abschnitt 3 oben beschrieben vor.
  3. Verdünnen Sie Serumproben und IgG-gestreifte Negativkontrollseren 1:1000, wie in Abschnitt 4 oben beschrieben.
  4. Fügen Sie 50 μL Multiplex-Perlenmischung zu jeder zugewiesenen Vertiefung einer 96-Well-nicht bindenden Mikrotiterplatte hinzu.
  5. Pipette 50 μL 1:1000 Serum oder PBS-TBN an die entsprechenden Vertiefungen. Die endgültige Verdünnung des Serums im Brunnen beträgt 1:2000.
  6. Decken Sie die Platte mit einer Mikroplattenfoliendichtung ab und inkubieren Sie sie auf einem beheizten Plattenschüttler bei 37 °C für 15 min mit Schütteln bei 600 U /min.
  7. Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenschüttler und legen Sie sie für 2 min auf den Magnetplattenabscheider, um die Perlen vom Reaktionsgemisch zu trennen.
  8. Entfernen Sie die Folienversiegelung, kehren Sie die Platte vorsichtig über einen Abfallbehälter um und streichen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen.
  9. Die Platte auf saugfähigem Papier abtloten, während Sie die Platte noch auf dem Magneten halten.
  10. Waschen Sie die Reaktionsschächte wie unten beschrieben (erste Inkubationswäsche nach der Probe).
    1. Entfernen Sie die Platte vom Plattenmagneten und fügen Sie 150 μL PBS-TBN zu jeder Vertiefung hinzu.
    2. Die Platte mit einer frischen Folienversiegelung abdecken und bei 37 °C für 2 min bei 600 U/min schütteln.
    3. Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenschüttler und legen Sie sie für 2 min auf den Plattenmagneten, um die Perlen von der Reaktionsmischung zu trennen.
    4. Entfernen Sie die Folienversiegelung, kehren Sie die Platte vorsichtig über einen Abfallbehälter um und streichen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen.
    5. Die Platte auf saugfähigem Papier abtloten, während Sie die Platte noch auf dem Magneten halten.
  11. Waschen Sie die Reaktionsbrunnen erneut mit PBS-TBN (zweite Inkubationswäsche nach der Probe), genau wie oben in den Schritten 7.10.1-7.10.5 beschrieben.
  12. Entfernen Sie die Platte vom Magneten.
  13. Machen Sie eine frische Erkennungsreagenzmischung mit der erforderlichen Kombination von Reagenzien und fügen Sie 50 μL oder 100 μL zu jeder Vertiefung hinzu.
    HINWEIS: Nachweisreagenzmischungen, die das anti-humane IgG enthalten, das mit dem Brilliant Violet 421 Reporterfarbstoff (BV; Anregung bei 405 nm und Emission bei 421 nm) konjugiert ist, wurden bei 50 μL/Well verwendet, da die Mengen der verfügbaren Stammreagenzien begrenzt waren. Alle anderen Detection Reagent Mischungen werden bei 100 μL/Well verwendet.
  14. Decken Sie die Platte mit einer Mikroplattenfoliendichtung ab und inkubieren Sie sie auf einem beheizten Plattenschüttler bei 37 °C für 15 min mit Schütteln bei 600 U /min.
  15. Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenschüttler und legen Sie sie für 2 min auf den Magnetplattenabscheider, um die Perlen vom Reaktionsgemisch zu trennen.
  16. Entfernen Sie die Folienversiegelung, kehren Sie die Platte vorsichtig über einen Abfallbehälter um und streichen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen.
  17. Die Platte auf saugfähigem Papier abtloten, während Sie die Platte noch auf dem Magneten halten.
  18. Waschen Sie die Reaktionsschächte wie unten beschrieben mit PBS-TBN (erstes Waschen nach Nachweis der Antikörperinkubation).
    1. Entfernen Sie die Platte vom Plattenmagneten und fügen Sie 150 μL PBS-TBN zu jeder Vertiefung hinzu.
    2. Die Platte mit einer frischen Folienversiegelung abdecken und bei 37 °C für 2 min bei 600 U/min schütteln.
    3. Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenschüttler und legen Sie sie für 2 min auf den Magnetplattenabscheider, um die Perlen vom Reaktionsgemisch zu trennen.
    4. Entfernen Sie die Folienversiegelung, kehren Sie die Platte vorsichtig über einen Abfallbehälter um und streichen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen.
    5. Die Platte auf saugfähigem Papier abtloten, während Sie die Platte noch auf dem Magneten halten.
  19. Waschen Sie die Reaktionsschächte erneut mit PBS-TBN (zweite Wäsche nach Nachweis der Antikörperinkubation), genau wie oben in den Schritten 7.17.1-7.17.5 beschrieben.
  20. Entfernen Sie die Platte vom Magneten.
  21. Fügen Sie 100 μL PBS-TBN zu jeder Vertiefung hinzu.
  22. Mit Folienversiegelung abdecken und 2 min bei 37 °C schütteln.
  23. Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenschüttler. Entfernen Sie dann die Foliendichtung und lesen Sie 50 μL jeder Vertiefung auf dem Durchflussanalysator ab, wie oben in den Schritten 5.18.1-5.18-5 beschrieben.

8. Umstellung auf Dual-Reporter-Neutralisierungsassay

  1. Verwenden Sie die gekoppelten Perlen wie in Schritt 7.1 oben beschrieben.
  2. Bereiten Sie eine frische Multiplex-Perlenmischung vor, wie in Schritt 7.2 beschrieben.
  3. Serumproben und IgG-gestreifte Negativkontrollseren werden wie folgt 1:500 verdünnt.
    1. Bereiten Sie eine 1:100-Verdünnung vor, indem Sie 10 μL Serum in 990 μL PBS-TBN mischen.
    2. Verdünnen Sie die 1:100-Proben um das weitere 5-fache, indem Sie 40 μL der 1:100-Verdünnungen auf 160 μL PBS-TBN geben.
  4. Fügen Sie 50 μL Multiplex-Perlenmischung zu jeder zugewiesenen Vertiefung einer 96-Well-nicht bindenden Mikrotiterplatte hinzu.
  5. Jeder Vertiefung werden 25 μL ACE2-Verdünnung von 2 μg/ml zufügig.
  6. Decken Sie die Platte mit einer Mikroplattenfoliendichtung ab und inkubieren Sie sie auf einem beheizten Plattenschüttler bei 37 °C für 2 min mit Schütteln bei 600 U /min.
  7. Entfernen Sie die Platte vom Plattenschüttler und entfernen Sie die Folienversiegelung.
  8. Fügen Sie 25 μL 1:500 Serum oder PBS-TBN zu den zugewiesenen Vertiefungen hinzu.
  9. Decken Sie die Platte mit einer Foliendichtung ab und inkubieren Sie sie auf einem beheizten Plattenschüttler bei 37 °C für 15 min mit Schütteln bei 600 U/min.
  10. Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenschüttler und legen Sie sie für 2 min auf den Magnetplattenabscheider, um die Perlen vom Reaktionsgemisch zu trennen.
  11. Entfernen Sie bei auf dem Magneten gehaltener Platte die Folienversiegelung, kehren Sie die Platte vorsichtig über einen Abfallbehälter um und streichen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen.
  12. Die Platte auf saugfähigem Papier abtloten, während Sie die Platte noch auf dem Magneten halten.
  13. Waschen Sie die Reaktionsschächte wie unten beschrieben (erste Inkubationswäsche nach der Probe).
    1. Entfernen Sie die Platte vom Plattenmagneten und fügen Sie 150 μL PBS-TBN zu jeder Vertiefung hinzu.
    2. Die Platte mit einer frischen Folienversiegelung abdecken und bei 37 °C für 2 min bei 600 U/min schütteln.
    3. Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenschüttler und legen Sie sie für 2 min auf den Magnetplattenabscheider, um die Perlen vom Reaktionsgemisch zu trennen.
    4. Entfernen Sie bei auf dem Magneten gehaltener Platte die Folienversiegelung, kehren Sie die Platte vorsichtig über einen Abfallbehälter um und streichen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen.
    5. Die Platte auf saugfähigem Papier abtloten, während Sie die Platte noch auf dem Magneten halten.
  14. Waschen Sie die Reaktionsbrunnen erneut mit PBS-TBN (zweite Inkubationswäsche nach der Probe), genau wie oben in den Schritten 8.13.1-8.13.5 beschrieben.
  15. Entfernen Sie die Platte vom Magneten.
  16. Machen Sie eine frische Erkennungsreagenzmischung mit der erforderlichen Kombination von Reagenzien und fügen Sie 50 μL oder 100 μL zu jeder Vertiefung hinzu.
    HINWEIS: Nachweisreagenzienmischungen, die das mit dem BV-Reporterfarbstoff konjugierte anti-humane IgG enthielten, wurden aufgrund begrenzter Mengen der verfügbaren Stammreagenzien bei 50 μL/Well verwendet (siehe Materialtabelle). Alle anderen Detection Reagent Mischungen werden bei 100 μL/Well verwendet.
  17. Decken Sie die Platte mit einer Mikroplattenfoliendichtung ab und inkubieren Sie sie auf einem beheizten Plattenschüttler bei 37 °C für 15 min mit Schütteln bei 600 U /min.
  18. Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenschüttler und legen Sie sie für 2 min auf den Magnetplattenabscheider, um die Perlen vom Reaktionsgemisch zu trennen.
  19. Entfernen Sie bei auf dem Magneten gehaltener Platte die Folienversiegelung, kehren Sie die Platte vorsichtig über einen Abfallbehälter um und streichen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen.
  20. Die Platte auf saugfähigem Papier abtloten, während Sie die Platte noch auf dem Magneten halten.
  21. Waschen Sie die Reaktionsschächte wie unten beschrieben (zuerst nach nachweisbarer Antikörperinkubation).
    1. Entfernen Sie die Platte vom Plattenmagneten und fügen Sie 150 μL PBS-TBN zu jeder Vertiefung hinzu.
    2. Die Platte mit einer frischen Folienversiegelung abdecken und bei 37 °C für 2 min bei 600 U/min schütteln.
    3. Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenschüttler und legen Sie sie für 2 min auf den Magnetplattenabscheider, um die Perlen vom Reaktionsgemisch zu trennen.
    4. Entfernen Sie bei auf dem Magneten gehaltener Platte die Folienversiegelung, kehren Sie die Platte vorsichtig über einen Abfallbehälter um und streichen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen.
    5. Die Platte auf saugfähigem Papier abtloten, während Sie die Platte noch auf dem Magneten halten.
  22. Waschen Sie die Reaktionsschächte erneut mit PBS-TBN (zweite Wäsche nach Nachweis der Antikörperinkubation), genau wie oben in den Schritten 8.21.1-8.21.5 beschrieben.
    1. Entfernen Sie die Platte vom Plattenmagneten und fügen Sie 150 μL PBS-TBN zu jeder Vertiefung hinzu.
    2. Die Platte mit einer frischen Folienversiegelung abdecken und bei 37 °C für 2 min bei 600 U/min schütteln.
    3. Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenschüttler und legen Sie sie für 2 Minuten auf den Magnetplattenabscheider, um die Perlen vom Reaktionsgemisch zu trennen.
    4. Entfernen Sie bei auf dem Magneten gehaltener Platte die Folienversiegelung, kehren Sie die Platte vorsichtig über einen Abfallbehälter um und streichen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen.
    5. Entfernen Sie die Platte vom Magneten.
  23. Fügen Sie 100 μL PBS-TBN zu jeder Vertiefung hinzu.
  24. Mit Folienversiegelung abdecken und 2 min bei 37 °C schütteln.
  25. Entfernen Sie die Platte aus dem Plattenschüttler. Entfernen Sie dann die Foliendichtung und lesen Sie 50 μL jeder Vertiefung auf dem Durchflussanalysator ab, wie oben in den Schritten 5.18.1-5.18-5 beschrieben.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optimierung des Single Reporter Serological Assays.
Die Kopplungsstrategie für alle SARS-CoV-2-Antigene wird in Cameron et al., 20201 und in Schritt 2.1 oben beschrieben. Die Strategie zur Kopplungsbestätigung wird in Schritt 2.3 oben beschrieben. Für eine effiziente Kopplung sollten die werte der medianen Fluoreszenzintensität (MFI) signifikant höher sein als die negative Kontrollreaktion(en) ohne Serum/keine Antikörper und eine Dosisreaktion mit abnehmendem MFI-Signal mit abnehmenden Mengen an Nachweisreagenz aufweisen. MFIs von etwa 1.000 MFI-Einheiten oder mehr über Hintergrund-MFI weisen im Allgemeinen auf eine effiziente Proteinkopplung hin und sind abhängig von der Konzentration und Spezifität des verwendeten Nachweisreagenzes. Mit dieser Methode wurde die Bestätigung der S-, RBD- und Nc-Antigenkopplung für zwei Perlenlose getestet(Abbildung 2). Die MFI-Signale für alle Antigene waren signifikant höher als die Hintergrund-MFI und zeigten eine Dosisreaktion mit Titration der Nachweisreagenzien. Die Daten zeigten auch eine gute Reproduzierbarkeit der MFI-Werte zwischen den beiden verschiedenen Losen gekoppelter Perlen.

Die Optimierung des Einzelreporter-Assays wurde wie in Cameron, et al., 20201beschrieben durchgeführt. Jedes Antigen wurde bei unterschiedlichen Kopplungskonzentrationen mit unterschiedlichen Verdünnungen mehrerer Serumproben getestet, die hohe, mittlere, niedrige und negative Proben darstellen. Da der Assay IgG-Titer misst, wurde außerdem ein IgG-gestreiftes Serum als zusätzliche negative Probe verwendet. Die Ergebnisse einer repräsentativen Probenverdünnungsreihe mit unterschiedlichen Antigenkopplungsstufen sind in Abbildung 3 dargestellt. Diese erste Verdünnungsserie wurde mit einer festen Konzentration von Nachweisreagenzien getestet, um einen potenziellen Bereich repräsentativer antigenspezifischer und Hintergrund-MFI-Werte zu erhalten. Aus diesen Daten wurden zusätzliche Probenverdünnungsbereiche und Antigenkopplungswerte bestimmt und mit zusätzlichen Proben weiter getestet (Daten nicht gezeigt).

Als nächstes wurde die Konzentration des Nachweisreagenzes für die Verwendung mit den verschiedenen Serumverdünnungen und Antigenkopplungsstufen optimiert. Repräsentative Daten mit 6 positiven und 2 negativen Proben sind in Abbildung 4 dargestellt. Nach zusätzlichen Tests mit mehreren hundert negativen Prä-COVID-19-Serumproben wurden die endgültigen optimalen Antigenkopplungsniveaus und Nachweisregentkonzentrationen für das endgültige Assay-Protokoll ausgewählt, wie in Abschnitt 5 beschrieben.

Umstellung auf einen einzigen Reporter-Neutralisationsassay
Die Umwandlung des serologischen Einzelreporter-Assays in einen Neutralisationsassay wurde durch Zugabe eines Inkubationsschritts mit ACE2 (als konkurrierendes Reagenz) mit den Perlen vor der Zugabe der Serumprobe erreicht. Durch Titrieren der zugesetzten ACE2-Menge wurde eine Hemmung der IgG-Bindung an die S- und RBD-Antigene beobachtet, wie in Abbildung 5gezeigt. Während die 11 Patientenseren unterschiedliche IgG-Titer aufwiesen, zeigte jede eine signifikante Abnahme des MFI-Signals mit zunehmender ACE2-Konzentration. Wie erwartet, beeinflusst ACE2 nur die MFI-Signale von S und RBD, nicht aber das Nc-Antigen.

Das prozentuale Rest-MFI-Signal relativ zu 0 μg/ml ACE2 für alle Proben ist in Abbildung 6 dargestellt. Für die meisten Proben wurde ein Signalverlust >30% für S und RBD mit steigender ACE2-Konzentration beobachtet. Wie erwartet, gab es keinen Einfluss von ACE2 auf das Nc-Signal.

Umstellung auf einen dualen Reporter IgG und IgM serologischen Assay
Für den Dual-Reporter-IgG- und IgM-Assay wurden die Standard-Single-Reporter-Assay-Bedingungen verwendet, um verschiedene Antikörper- und Reporter-Kombinationen für die beiden Reporterkanäle zu testen. Der RP1-Kanal ähnelt früheren Strömungsanalysegeräten mit detektion von "oranger" Fluoreszenz für Reporterfarbstoffe wie PE. Der zweite Kanal, RP2, verwendet einen violetten Anregungslaser, der zum Nachweis der "blauen" Fluoreszenz von Farbstoffen verwendet werden kann, die bei 402 nm mit Emissionsspektrenspitzen im Bereich von 421-441 nm angeregt werden.

Mehrere verschiedene anti-humane IgG- und IgM-Antikörperkombinationen wurden in verschiedenen Konzentrationen mit den in Abschnitt 6 beschriebenen Standard-2.000-fachen Probenverdünnungs- und Inkubationsbedingungen getestet. Ein erster Test von Anti-IgM, konjugiert mit dem DyLight 405 Reporterfarbstoff (DL 405; Anregung bei 400 nm und Emission bei 420 nm) für den RP2-Kanal wurde mit einem Satz von 11 PCR-positiven Proben mit DFSO im Bereich von 5 bis >60 Tagen und einer IgG-gestreiften Serumprobe durchgeführt. Dieses Detektionsreagenz erzeugte kein hohes Signal im RP2-Kanal, wie in Abbildung 7A,B, C dargestellt. Bei Proben mit dem hohen IgM RP2 MFI wurden die höchsten Signale für RBD und Nc beobachtet (Abbildung 7B,C). Während die IgM-Titer zu diesem Zeitpunkt in einigen Proben erhöht sein sollten, überschritten die beobachteten MFI-Werte mit dem IgM-Nachweisreagenz 140 MFI-Einheiten nicht. Darüber hinaus fehlte der Kontrollperle für IgM ein signifikanter Dynamikbereich für MFI, wenn DL 405 verwendet wurde, konjugiert mit Anti-IgM im Vergleich zu einem PE-markierten Anti-IgM RP1-Reporter, der bei den gleichen Konzentrationen verwendet wurde (Abbildung 7D).

Da kein geeignetes RP2-Reporter-markiertes Nachweisreagenz für IgM verfügbar war, wurde das ursprüngliche Biotin-Anti-IgG mit SASB für den Einsatz im RP2-Kanal getestet. Das Signal für IgG im RP2-Kanal mit SASB hatte nicht den gleichen Dynamikbereich wie bei SAPE, aber es hatte immer noch einen geeigneten Bereich zur Messung von IgG-Titern für S, RBD und Nc (Abbildung 8). Diese Daten führten zum Testen verschiedener RP1 IgM- und RP2 IgG-Erkennungsreagenzienkombinationen, wie unten beschrieben.

Umstellung auf Dual-Reporter-Neutralisationsassay
Der serologische Dual-Reporter-Assay wurde in einen Neutralisationsassay umgewandelt, indem ein Inkubationsschritt mit ACE2 und Perlen hinzugefügt wurde, bevor die Serumprobe hinzugefügt wurde. Eine 2-fache Verdünnungsserie von ACE2 ab 16 μg/ml wurde verwendet und dann mit Sätzen von 11 Proben und entfernten Seren wie oben beschrieben getestet. Darüber hinaus wurden 3 verschiedene Kombinationen von RP1 IgM und RP2 IgG Nachweisantikörpermischungen an einem Satz von 11 Proben und entfernten Serumkontrollen getestet. Die endgültigen Kombinationen und Reagenzkonzentrationen, die als optimal bestimmt wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Für den IgG-Nachweis wurde das Biotin-Anti-Human-IgG / SASB, das im ursprünglichen Einzelreporter-Assay verwendet wurde, zusammen mit einem anderen Anti-IgG getestet, das mit dem BV-Reporterfarbstoff konjugiert wurde. Während das BV-Konjugat hohe RP2-MFI-Signale aufweist, variierte die MFI-Signalintensität für den IgG-Titer über die ACE2-Titrationen hinweg (Abbildung 9A, C, E). Die Biotin-Anti-Human-IgG/SASB-Kombination hatte eine konsistentere MFI-Signalabnahme über die ACE2-Titration im Vergleich zum BV-Konjugat, was eine Dosisreaktion zeigte, obwohl die MFI-Spiegel niedriger waren. Die Signalfluktuation durch das BV-Konjugat über ACE2-Konzentrationen hinweg störte auch die Bestimmung der prozentualen Hemmung durch ACE2 im Bereich der IgG-Titer im Vergleich zur Biotin-Anti-Human-IgG/SASB-Kombination (Abbildung 9B, D , F). Proben mit niedrigen MFI-Signalen, wie die DFSO 3-Probe, haben nicht genügend Titer, um die Leistung dieser Reagenzien zu bewerten oder die IgG-Neutralisierungskapazität zu messen.

Zur Bestimmung von IgM-Titern im RP1-Kanal wurde ein PE-konjugiertes Anti-IgM mit einem anti-humanen IgM verglichen, das mit dem DyLight 549-Reporterfarbstoff (DL 549; Anregung bei 562 nm und Emission bei 576 nm) in den in Tabelle 1aufgeführten Konzentrationen konjugiert wurde. Von diesen beiden Reagenzien zeigte das PE-Anti-IgM höhere MFIs als die von DL 549 Anti-Human-IgM für die getesteten Proben erzeugten(Abbildung 9A,C, E). Die IgM-Kontrollperle, die die Zugabe dieser Reagenzien misst, hatte unterschiedliche durchschnittliche MFIs von ≈17.000 für das PE-Anti-IgM und 2.723 für das DL 549-Konjugat. Trotz dieser Unterschiede war der Einfluss der verschiedenen ACE2-Konzentrationen auf MFI mit dem DL 549-Konjugat messbar. Zur Bestimmung der ACE2-prozentigen Hemmung der IgM-Bindung gab es einen leichten, aber unbedeutenden Unterschied zwischen den beiden IgM-Nachweisreagenzien (Abbildung 9B, D, F).

KombinationReporterEndkonzentration im Bohrbrunnen (μg/ml)
RP1RP2
1PE Anti-IgM2-
Biotin-Ig-0.62
SASB-4
2DyLight 549 Anti-Human IgM1-
Brilliant Violet 421 Anti-Human IgG-1
3DyLight 549 Anti-Human IgM1-
Biotin-Ig-0.62
SASB-4

Tabelle 1: Liste der getesteten RP1- und RP2-Reporterfarbstoffkombinationen. Für die Messung von IgG- und IgM-Titern wurden mehrere verschiedene RP1- und RP2-Reporterfarbstoffe bewertet. Die drei oben gezeigten Kombinationen wurden in verschiedenen RP1-Detektionsmodi und zur Optimierung des Neutralisationsassays getestet. Für RP2-Kombinationen mit SASB werden Konzentrationen für den biotinylierten Nachweisantikörper und SASB gezeigt. *Die Endkonzentration stellt die Endkonzentration in der Reaktionsbohrung dar.

figure-results-1
Abbildung 1: Flussdiagramm, in dem die wichtigsten Assay-Protokollschritte hervorgehoben werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Bestätigung der Antigenkopplung. Antigene wurden bei 100, 10 und 1 pmol/106 Perlen gekoppelt. Für S- und RBD-Antigene wurde Kaninchen-Anti-Seren verwendet und mit PE-Anti-Kaninchen-IgG nachgewiesen. Für Nc wurde ein Protein G-gereinigtes Kaninchen polyklonales Anti-Nc verwendet. Die Titrationskurven für Perlen gekoppelt mit 10 pmol S (A), 100 pmol RBD (B) und 100 pmol Nc (C) sind dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3: Optimierung der Serumverdünnung mit verschiedenen Antigenkopplungsstufen. Serumproben, die hohe, mittlere, niedrige und negative Proben darstellen, wurden mit den verschiedenen pmol-Antigen/10 6-Perlenkupplungen getestet. Eine 4-fache Serumtitration wurde mit einer Multiplexmischung aus Antigen-gekoppelten Perlen unter Verwendung des in Abschnitt 5 beschriebenen Assay-Protokolls getestet. Die MFI-Werte der Titrationskurven für S (A), RBD (B) und Nc (C) werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 4: Bestimmung der optimalen Serumverdünnung und Der Nachweisreagenzkonzentration. Acht Serumproben, darunter negative Patienten (2 Proben) und niedrig- bis hochpositive (6 Proben), wurden an zusätzlichen Serumverdünnungen mit drei verschiedenen Rektivkonzentrationen getestet. Die MFI-Ergebnisse werden für S (A), RBD (B) und Nc ( C )angezeigt. Basierend auf diesen und anderen Daten (nicht gezeigt) wurde eine Probenverdünnung von 1:2.000 und eine Biotin-Nachweisantikörperkonzentration von 0,62 μg/ml ausgewählt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-5
Abbildung 5: Optimierung des Einzelreporter-Neutralisationstests. Die Modifikation des serologischen Einzelreporter-Assays zu einem neutralisierenden Antikörper-Nachweisassay wurde durch Hinzufügen eines Inkubationsschritts mit ACE2 als Wettbewerber durchgeführt, wie in Abschnitt 6 beschrieben. Ein Satz von 11 Proben, die von niedrigen bis zu hochpositiven Titerseren reichten, und eine IgG-gestreifte Serumprobe wurden mit einer zweifachen Verdünnungsserie von ACE2 ab 4 μg/ml unter Verwendung von Standard-Assay-Bedingungen getestet. Über diesen Bereich der ACE2-Konzentrationen ist eine Abnahme des MFI bei erhöhtem ACE2 für S (A) und RBD (B) zu sehen, nicht jedoch für Nc (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-6
Abbildung 6: Prozentuale Signalhemmung mit ACE2. Die prozentualen Restsignale für den Satz von 11 Proben (aus Abbildung 4)sind dargestellt. Für jede Probe wurde unabhängig von ihrem IgG-Titer eine maximale Abnahme von ≥30% MFI-Signal für S (A) und RBD (B) bei der höchsten ACE2-Konzentration erreicht. Für das Nc-Antigen (C) gab es keine signifikante Signalhemmung mit einer beliebigen Menge an ACE2 getestet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Test von DyLight 405 Anti-IgM als RP2 IgM-Erkennungsreagenz. Ein Satz von 11 Proben und IgG-gestreiften Seren wurde verwendet, um DL 405-konjugiertes Anti-IgM als RP2-Nachweisreagenz zu testen. Die RP2 IgM MFI Signale für S (A), RBD (B) und Nc (C) werden angezeigt. Das höchste MFI-Signal für jedes Antigen mit einer Probe betrug ungefähr 140 MFI-Einheiten für RBD mit Probe H (B). Selbst das Signal auf dem IgM-Kontrollperlensatz betrug weniger als 1.000 MFI im RP2-Kanal über den gesamten Antikörpertiterbereich und zeigte nicht den erhöhten Dynamikbereich, der mit dem PE-Anti-IgM-Nachweisantikörper im RP1-Kanal beobachtet wurde (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 8: Optimierung von SASB als RP2-Reporter mit Biotin Anti-IgG. Ein Satz von 11 Proben und IgG-gestreiften Seren wurde verwendet, um eine Verdünnungsserie von SASB mit dem Standard 0,62 μg / ml Biotin Anti-IgG zu testen. Die resultierenden IgG-MFIs im RP2-Kanal für S (A), RBD (B) und Nc (C) werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 9: Vergleich von drei verschiedenen Kombinationen von RP1 IgM und RP1 IgG Detektionsmischungen. Drei verschiedene Nachweisantikörpermischungen wurden an 11 Proben und IgG-entfernten Seren getestet. Die verwendeten Kombinationen und Endkonzentrationen sind in Tabelle 1beschrieben. Alle Proben wurden mit einer 2-fachen ACE2-Verdünnung ab 16 μg/ml getestet. Es werden Daten für Proben am DFSO von 3, 12 und 30 Tagen angezeigt. Die MFI-Signale für RP1 IgM (orange) und RP2 IgG (blau) sind in A (DFSO 3), C (DFSO 12) und E (DFSO 30) dargestellt. Die ACE2-Prozent-Rest-MFIs sind in B (DFSO 3), D (DFSO 12) und F (DFSO 30) dargestellt. Signale, die eine Abnahme von >30 % im Vergleich zu No ACE2-Steuerelementen darstellen, werden hellgrün hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

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Diese Studie erweiterte die Funktionalität eines Multiplex-Fluoreszenz-Mikrosphärenassays, 3Flex, der die IgG-Reaktion auf eine Infektion mit SARS-CoV-21qualitativ bewertet. Während viele serologische Assays für COVID-19 ein einzelnes Antigen nachweisen, bewertet dieser Assay gleichzeitig S-, RBD- und Nc-Antigene und enthält eine interne Antikörper-Isotypkontrolle7. Darüber hinaus wird ACE2 als Indikator zum Nachweis neutralisierender Antikörpertiter gegen SARS-CoV-2 verwendet.

Multi-Antigen-Assays könnten in Zukunft besonders nützlich sein, um Immunantworten zwischen infizierten und geimpften Personen zu unterscheiden. Wenn bei SARS-CoV-2 nur S- und RBD-Antikörper ausgewertet werden, wäre es unmöglich zu erkennen, ob dies auf eine frühere Infektion oder auf eine Impfantikörperreaktion zurückzuführen ist. Keiner der derzeit verwendeten Impfstoffe zielt auf das Nc-Antigen ab, so dass es durch die Bewertung von S/RBD- und Nc-Antigenen möglich ist, vergangene Virusinfektionen (Nc- und S/RBD-positiv) von einer Impfreaktion (nur S/RBD-positiv; Nc-negativ).

In der aktuellen Studie wurden die serologischen und Neutralisationsassays 3Flex (Abschnitte 5 und 6) auf ein neues Dual-Reporter-Flow-Analysegerät (Abschnitte 7 und 8) übertragen. Typische Immunoassay-Protokolle für perlenbasierte Multiplex-Assays ähneln Standard-ELISA-Protokollen und folgen vergleichbaren Schritten für die Probeninkubation, die Nachweisantikörper-/Reporterinkubation und die Analyse der Ergebnisse8. Frühere Studien haben auch gezeigt, wie Standard-ELISA-Assays auf eine perlenbasierte Multiplexing-Plattform übertragen werden können9.

Die Assay-Protokolle konnten nahtlos vom Vorgänger-Einzel-Reporter-Instrument auf das neue Dual-Reporter-System übertragen werden, wie die Ergebnisse für die Testproben und Kontrollen zeigen (Abbildung 4 und Abbildung 5). Im serologischen Assay zeigten alle positiven Serumproben eine charakteristische dosisabhängige Signalabnahme, die sowohl einer höheren Probenverdünnung als auch einer niedrigeren Antikörperkonzentration entsprach, während die Signale für die negativen Proben auf Hintergrundniveau blieben. In ähnlicher Weise entsprachen für den Neutralisationsassay abnehmende Signale für S und RBD, aber nicht Nc, steigenden Konzentrationen des ACE2-Konkurrenten, während das IgG-gestreifte Serum durch die Zugabe von ACE2 viel weniger beeinflusst wurde. Die Vorinkubation der Perlen mit ACE2 für 2 min vor der Zugabe der Serumprobe (wie in den Abschnitten 6 und 8 beschrieben) wurde auch mit der gleichzeitigen Kombination der Perlen mit ACE2 und Serum verglichen und führte zu geringen Unterschieden in den Ergebnissen (Daten nicht gezeigt). Da die mit den Perlen plus ACE2-Vorinkubationsschritt erzielten Ergebnisse jedoch konsistenter waren, war dies das endgültige Verfahren für das Neutralisationsassayprotokoll (Abschnitte 6 und 8).

Da das duale Reportersystem einen zweiten fluoreszierenden Reporterkanal enthält, wurden beide Assays in Isotypisierungsassays umgewandelt, um gleichzeitig IgG- und IgM-Reaktionen zu messen. Die Dual-Reporter-Funktionalität des Durchflussanalysators ermöglicht die Erfassung von fluoreszierenden Signalen von zwei Reporter-Detektionsreagenzien für jeden Analyten im Multiplex für jede Probe, wodurch die pro Probe in einem Assay generierten Daten effektiv verdoppelt werden. Für die Entwicklung und Optimierung der Dual-Reporter-Assay-Protokolle wurden mehrere kommerziell erhältliche Reporterfarbstoffe und Nachweisantikörper für den neuen RP2-Kanal (Abbildung 7 und Abbildung 8) evaluiert, um die besten verfügbaren Optionen zu bestimmen. Der mit dem DL 405-Reporterfarbstoff konjugierte Anti-IgM-Antikörper funktionierte im RP2-Kanal nicht gut (Abbildung 7), so dass Biotin-Anti-IgG mit SASB anschließend für den Nachweis im RP2-Kanal bewertet wurde (Abbildung 8). Drei Kombinationen von RP1- und RP2-Nachweisreagenzien wurden im Dual-Reporter-Neutralisationsassay (Tabelle 1 und Abbildung 9) verglichen, um die leistungsstärksten Kombinationen für den gleichzeitigen Nachweis von IgG- und IgM-neutralisierenden Antikörpern zu bestimmen. Während es signifikante Unterschiede in der Signalintensität zwischen dem RP1-Kanal mit PE-anti IgM und dem RP2-Kanal mit DL 549 anti-IgM gab, gab es keinen signifikanten Unterschied bei der Messung der prozentualen Bindungshemmung durch ACE2.

Mehrere Einschränkungen der aktuellen Methode und dieser Studie werden anerkannt. Zunächst wurden die getesteten und in der Methodenentwicklung und -optimierung verwendeten Proben auf Sätze von 8-11 Proben beschränkt. Weitere Proben werden in erweiterten Studien getestet, um zu überprüfen, ob die Methode vollständig optimiert ist. Zweitens wurde eine begrenzte Anzahl von Reporterfluorophoren und Reporterpaaren getestet. Weitere Tests aller verfügbaren Reporter in allen möglichen Kombinationen werden bestimmen, welche Reagenzien bei dieser Methode erfolgreich eingesetzt werden können. Der mit Biotin konjugierte Anti-IgG-Antikörper unterschied sich von dem Anti-IgG-Antikörper, der mit dem BV 421-Reporter konjugiert wurde. Obwohl also variabel in der Signalintensität für das BV 421 Anti-IgG existierte, könnte dies auf die Spezifität des Antikörpers zurückzuführen sein und nicht mit dem Reporterfarbstoff zusammenhängen. Das Testen anderer verfügbarer BV 421-konjugierter Antikörper kann einen anderen Antikörper identifizieren, der im RP2-Kanal gut funktionieren würde. Zukünftige Studien werden auch die Kombination von PE-Anti-IgM mit BV 421 Anti-Human-IgG für den Nachweis in RP1 bzw. RP2 bewerten. Schließlich sind die Assays selbst bei der Dual-Reporter-Fähigkeit des Instruments auf zwei Isotypen (zwei Parameter) pro Reaktion beschränkt. Wenn zusätzliche Isotypen gemessen werden sollen oder eine vollständige Isotypisierung gewünscht wird, müssten zusätzliche Reaktionen mit den gleichen zwei Reporterkanälen in separaten Bohrkanälen durchgeführt werden.

Die perlenbasierte Multiplexing-Technologie ermöglicht ein schnelles und flexibles Assay-Design mit einfacher Implementierung in routinemäßige Laborabläufe3,4,10. Diese Studie zeigte die Einfache Übertragung der zuvor beschriebenen serologischen und Neutralisationsassays von 3Flex für SARS-CoV-2 auf ein Strömungsanalysesystem zur Messung von IgG mit einem einzigen Reporter oder mit leichter Modifikation, wobei gleichzeitig sowohl IgG- als auch IgM-Reaktionen mit zwei Reportern gemessen wurden. Die Dual-Reporter-Option hat klare Vorteile gegenüber Einzel-Reporter-Plattformen, da sie doppelt so viele Daten pro Probe liefern kann, wobei das halbe Probenvolumen und die Hälfte der Anzahl der Reaktionsbohrungen verwendet werden. Mit den entsprechenden Reporterfarbstoffen und Nachweisantikörpern können Isotypisierungsassays einfach entwickelt und auf dem Dual-Reporter-Flow-Analysegerät durchgeführt werden.

Offenlegungen

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Stephen Angeloni und Sherry Dunbar sind Mitarbeiter der Luminex Corporation, die einige der Reagenzien und Instrumente herstellt, die in dieser Studie verwendet wurden. Die Open-Access-Veröffentlichung dieses Artikels wurde von der Luminex Corporation gesponsert

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Bericht wurde von der Luminex Corporation (Austin, TX) finanziert. Die Autoren danken Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) für die wissenschaftliche Unterstützung bei der Redaktion.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ACE2 (human) (rec.)AdipoGen Life SciencesAG-40B-0192-3050
Biotin-SP (langer Spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragmentspezifischJackson ImmunoResearch Laboratories109-065-098
RinderserumalbuminMilliporeSigmaA7888Sigma-Aldrich
Branson 1800 Reiniger/Wasserbad-UltraschallgerätVerschiedenes
Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human-IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories709-675-149
Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrol NBS MicroplateCorning3650
Corning 96-well Microplate Aluminium-Dichtungsband, unsterilCorning6570
DyLight 405 AffiniPure Ziege Anti-Human IgM, Fc5μ   fragmentspezifischJackson ImmunoResearch Laboratories109-475-043
DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ spezifischJackson ImmunoResearch Laboratories109-506-129Nicht mehr erhältlich, aber von mehreren Anbietern erhältlich
eBioscience Streptavidin Super Bright 436 KonjugatThermoFisher Scientific62-4317-82
Fisherbrand Inkubations-MikroplattenschüttlerThermoFisher Scientific02-217-757Fisher Scientific
Ziege Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, PEThermoFisher ScientificP-2771MP
Luminex MagnetplattenseparatorLuminex CorporationCN-0269-01
MagPlex-KügelchenLuminex CorporationMC100XX-ID
PE AffiniPure F(ab')2 Ziege Anti-Human IgM Fc5μ spezifischJackson ImmunoResearch Laboratories109-116-129
Phosphatgepufferte KochsalzlösungMilliporeSigmaP3813Sigma-Aldrich
SARS Nukleokapsid Protein AntikörperNovos BiologicalsNB100-56683Unkonjugiert, Kaninchen, polyklonal, Protein G gereinigt
SARS Nukleokapsid Protein AntikörperNovos BiologicalsNB100-56049Unkonjugiert, Kaninchen, polyklonal, Protein A gereinigt
SARS Spike ProteinAntikörper Novos BiologicalsNB100-56047Unkonjugiert, Kaninchen, polyklonal, Protein G gereinigt
SARS Spike Protein AntikörperNovos BiologicalsNB100-56048Unkonjugiert, Kaninchen, polyklonal, Protein G gereinigt
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antikörper, Kaninchen MAbSinoBiological40150-R007
Natriumazid-MilliporeSigmaS2002Sigma-Aldrich
Streptavidin, R-Phycoerythrin-Konjugat (SAPE)ThermoFisher ScientificS21388Premium-Grade-Röhrenrevolver
/ RotatorThermoFisher Scientific88881001
TWEEN 20MilliporeSigmaP9416Sigma-Aldrich
xMAP Antikörper-Couplng-KitLuminex Corporation40-50016
xMAP INTELLIFLEX DR-SELuminex CorporationINTELLIFLEX-DRSE-RUO

Referenzen

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  7. EUA Authorized Serology Test Performance. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance (2020).
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  10. Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).

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Multiplex Bead AssayIgG IgM NachweisDurchflusszytometrieDual Reporter AssaySpike Protein Antik rperACE2 RezeptorbindungNukleokapsid Antigenserologische TestsAntik rperinhibition

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