Das skizzierte Protokoll beschreibt das Verfahren zur Herstellung des HiBiT-Rezeptor-bindenden Domänenproteinkomplexes und seine Anwendung für den schnellen und sensitiven Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern.
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Methodenartikel
Nachweis eines SARS-CoV-2-Rezeptor-bindenden Domänenantikörpers mit einem HiBiT-basierten Bioreporter
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Auftreten der COVID-19-Pandemie hat den Bedarf an besseren serologischen Nachweismethoden erhöht, um die epidemiologischen Auswirkungen des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) zu bestimmen. Die steigende Zahl von SARS-CoV-2-Infektionen erhöht den Bedarf an besseren Antikörper-Nachweis-Assays. Aktuelle Antikörper-Nachweismethoden beeinträchtigen die Empfindlichkeit in Bezug auf Geschwindigkeit oder sind empfindlich, aber zeitaufwendig. Ein großer Teil der SARS-CoV-2-neutralisierenden Antikörper zielt auf die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) ab, eines der primären immunogenen Kompartimente von SARS-CoV-2. Wir haben kürzlich ein hochempfindliches, biolumineszenz-markiertes RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) zum Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern entworfen und entwickelt. Der folgende Text beschreibt das Verfahren zur Herstellung des HiBiT-RBD-Komplexes und eines schnellen Assays zur Bewertung des Vorhandenseins von RBD-Targeting-Antikörpern mit diesem Tool. Aufgrund der Haltbarkeit des HiBiT-RBD-Proteinprodukts über einen weiten Temperaturbereich und des kürzeren experimentellen Verfahrens, das innerhalb von 1 h abgeschlossen werden kann, kann das Protokoll als effizientere Alternative zum Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern in Patientenserumproben angesehen werden.
Einleitung
Das jüngste Auftreten eines neuen Coronavirus, SARS-CoV21, hat bis zum 30. März 20212 mehr als 2.800.000 Todesfälle und 128 Millionen Infektionen verursacht. Aufgrund des Fehlens eines zuverlässigen und gut etablierten Behandlungsverfahrens für klinische SARS-CoV-2-Therapien wurden viele Anstrengungen unternommen, um die weitere Virusübertragung einzuschränken und vor allem eine wirksame und robuste Behandlung oder einen Impfstoff zu entwickeln3. Bis heute gibt es mehr als 50 COVID-19-Impfstoffkandidaten in Studien, die von der Weltgesundheitsorganisation gemeldet wurd....
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Protokoll
HINWEIS: Das unten beschriebene Protokoll entspricht allen Ethikrichtlinien gemäß Protokollcode 20200371-01H.
1. Erstellung und Auswertung des HiBiT-RBD Bioreporters
- Herstellung einer ausreichenden Menge HiBiT-RBD-Bioreporter
- Bereiten Sie sich auf die Zellkultur vor
- Bereiten Sie ein komplettes modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco vor, das 10% fötales Rinderserum und 1% Penicillin/Streptomycin enthält. Anschließend erwärmen Sie das Medium in einem 37 °C warmen Wasserbad.
- Schalten Sie die biologische Sicherheitswerkbank (BSC) ein und verwenden Sie 70% v / v Ethanol für die Sterilisation der Schr....
- Bereiten Sie sich auf die Zellkultur vor
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Ergebnisse
Die Signale sowohl des HiBit-RBD-haltigen Zelllysats als auch des Überstandes der transfizierten Zellen wurden aufgezeichnet (Abbildung 2), um die geeignete Proteinquelle zu bewerten. HiBiT-RBD und LgBit wurden separat als Steuerelemente verwendet, und die Daten zeigten einen niedrigen Hintergrund im Vergleich zu einem starken Signal, wenn beide Teile kombiniert wurden. Daher ist die HiBiT-RBD-Interaktion mit LgBiT notwendig, um ein aktives Enzym für die Substratverdauung und die Bioluminesz.......
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Diskussion
Die steigende Zahl von Menschen, die mit SARS-CoV-2 infiziert sind, und die anhaltenden Bemühungen um eine globale Impfung erfordern empfindliche und schnelle serologische Tests, die in groß angelegten Serosurveys eingesetzt werden können. Jüngste Forschungen zeigen, dass Split-Nanoluciferase-basierte Bioreporter verwendet werden können, um solche Assays zu entwickeln. Wir haben kürzlich den HiBiT-RBD-Bioreporter entwickelt, um einen Test zu entwickeln, mit dem SARS-CoV-2-spezifische Antikörper im Patientenserum schnell .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Danksagungen
Wir schätzen und danken der technischen Unterstützung von Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin und Christiano Tanese De Souza. Wir danken auch Mina Ghahremani für Grafikdesign. Wir möchten uns auch bei allen Personen bedanken, die teilgenommen und ihre Blutproben für diese Studie gespendet haben. DWC wird zum Teil von der uOttawa Fakultät und abteilung für Medizin unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 5x Passiver Lysepuffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL Kit |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgtgtgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgggatgtacgggagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagtccatcccat atggagttccgccggttakataacttacggtaa atggcccgcctccccccaccc ccgcccattgacgcaacccccccaataatgacgtgttctccc Atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtttt ggcagtacatcaatgggggaagggatagcggtttg actcacggggatttccaagtccaccaccattg acgtcaatgggagttttccaccaaaatc aacgggactttccaaaatccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatggaatggggcggagagtcgtga ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA 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attattgaagcatttatcagggtgtc tcatgagcggatacatatttgaatattt agaaaaaaaaaaaaaatagggtccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc | ||
| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | ||
| Pierce Protein G Magnetische Kügelchen | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In-vitro-DNA-Transfektionsreagenz | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralisierender Antikörper, Maus Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Mikroplatten-Reader | BioTek | 96-Well-Plattenleser Lumimeter | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0,25 |
Referenzen
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer. , Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021).
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F.
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Nachdrucke und Genehmigungen
