Nachweis eines SARS-CoV-2-Rezeptor-bindenden Domänenantikörpers mit einem HiBiT-basierten Bioreporter

Zusammenfassung

Das skizzierte Protokoll beschreibt das Verfahren zur Herstellung des HiBiT-Rezeptor-bindenden Domänenproteinkomplexes und seine Anwendung für den schnellen und sensitiven Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern.

Zusammenfassung

Das Auftreten der COVID-19-Pandemie hat den Bedarf an besseren serologischen Nachweismethoden erhöht, um die epidemiologischen Auswirkungen des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) zu bestimmen. Die steigende Zahl von SARS-CoV-2-Infektionen erhöht den Bedarf an besseren Antikörper-Nachweis-Assays. Aktuelle Antikörper-Nachweismethoden beeinträchtigen die Empfindlichkeit in Bezug auf Geschwindigkeit oder sind empfindlich, aber zeitaufwendig. Ein großer Teil der SARS-CoV-2-neutralisierenden Antikörper zielt auf die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) ab, eines der primären immunogenen Kompartimente von SARS-CoV-2. Wir haben kürzlich ein hochempfindliches, biolumineszenz-markiertes RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) zum Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern entworfen und entwickelt. Der folgende Text beschreibt das Verfahren zur Herstellung des HiBiT-RBD-Komplexes und eines schnellen Assays zur Bewertung des Vorhandenseins von RBD-Targeting-Antikörpern mit diesem Tool. Aufgrund der Haltbarkeit des HiBiT-RBD-Proteinprodukts über einen weiten Temperaturbereich und des kürzeren experimentellen Verfahrens, das innerhalb von 1 h abgeschlossen werden kann, kann das Protokoll als effizientere Alternative zum Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern in Patientenserumproben angesehen werden.

Einleitung

Das jüngste Auftreten eines neuen Coronavirus, SARS-CoV21, hat bis zum 30^. März 20212 mehr als 2.800.000 Todesfälle ^{und 128} Millionen Infektionen verursacht. Aufgrund des Fehlens eines zuverlässigen und gut etablierten Behandlungsverfahrens für klinische SARS-CoV-2-Therapien wurden viele Anstrengungen unternommen, um die weitere Virusübertragung einzuschränken und vor allem eine wirksame und robuste Behandlung oder einen Impfstoff zu ^entwickeln3. Bis heute gibt es mehr als 50 COVID-19-Impfstoffkandidaten in Studien, die von der Weltgesundheitsorganisation gemeldet ^wurden4. Der Nachweis von Antikörpern gegen SARS-CoV-2 ist von größter Bedeutung, um die langfristige Stabilität des humoralen Ansprechens bei Verabreichung des Impfstoffs sowie bei genesenen Patienten mit COVID-195 zu bestimmen. Einige Studien haben gezeigt, dass die Möglichkeit besteht, dass genesene SARS-CoV-2-Patienten nach 1 Jahr die meisten RBD-bindenden Antikörper verlieren5,6,7,8,9. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die dauerhafte Immunität besser zu verstehen, und empfindlichere Antikörpernachweisplattformen können dazu beitragen, diese Arbeit voranzutreiben. Berichte über eine anhaltende Immunität gegen leichte SARS-CoV-2-Infektionen, die auf langfristige Antikörperreaktionen hindeuten, sind ebenfalls ein interessantes und lohnendes Studiengebiet. Eine schnelle und genaue Nachweismethode ist für die Überwachung von Antikörpern in den Seren von Individuen unerlässlich, um mehr Informationen über die Immunität in der Bevölkerung zu erhalten.

Wie andere Coronaviren verwendet SARS-CoV-2 hervorstehendes Spike-Glykoprotein, um an das Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE2) zu binden, um eine Kaskade von Ereignissen auszulösen, die zur Fusion der Virus- und Zellmembranen ^führen6,7. Mehrere Studien haben kürzlich bewiesen, dass die RBD des Spike-Proteins eine entscheidende Rolle bei der Auslösung einer starken und spezifischen Antikörperantwort gegen SARS-CoV28,9,10,11 ^spielt. Insbesondere die von Premkumar et al. beobachteten Korrelationen zwischen dem Titer des RBD-bindenden Antikörpers und der SARS-CoV-2-Neutralisationskraft des Patientenplasmas stimmen mit RBD als immunogenem Kompartiment der Virusstruktur ^überein9. Vor diesem Hintergrund sind viele diagnostische Tests, die für den Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern verfügbar sind, zeit- und kostenintensiv, erfordern ein langwieriges Inkubations- und Waschverfahren (Enzym-Linked Immunosorbent Assay [ELISA]) oder es mangelt ihnen an Sensitivität und Genauigkeit (Lateral-Flow-Immunoassay [LFIA])¹². Daher würde eine quantitative und schnelle komplementäre serologische Methode des COVID-19-abgeleiteten Antikörpernachweises mit hoher Sensitivität, schnellem Ansprechen und relativ geringen Kosten die Notwendigkeit eines zuverlässigen serologischen Tests für die epidemiologische Überwachung von SARS-CoV-2 decken.

Insgesamt führten die Einschränkungen der aktuellen serologischen Assays zur Untersuchung des Biolumineszenz-Meldesystems als potenzielles Diagnostikum in zukünftigen Serosurveys. Biolumineszenz ist eine natürlich vorkommende Enzym/Substrat-Reaktion mit Lichtemission. Nanoluc-Luciferase ist das kleinste (19 kDa), aber das hellste System im Vergleich zu Renilla- und Glühwürmchen-Luciferase (36 kDa bzw. 61 kDa)^13,14. Darüber hinaus hat Nanoluc das höchste Signal-Rausch-Verhältnis und die höchste Stabilität unter den zuvor genannten Systemen. Die hohe Signalintensität von Nanoluc unterstützt den Nachweis selbst sehr geringer Mengen an ^{Reporterfusionen15}. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) ist eine splitte Version des Nanoluc-Systems, das aus zwei Segmenten besteht: kleine BiT (11 Aminosäuren; SmBiT) und große BiT (LgBiT) mit relativ affinitätsarmen Wechselwirkungen (_KD = 190 μM) zu einem Lumineszenzkomplex16. NanoBiT wird in verschiedenen Studien zur Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen15,17,18,19 und zellulären Signalwegen eingesetzt11,20,21.

Kürzlich wurde ein weiteres kleines Peptid mit einer deutlich höheren Affinität zu LgBiT (_KD = 0,7 nM) eingeführt, nämlich das HiBiT Nano-Glo-System anstelle von SmBiT. Die hohe Affinität und das starke Signal des Nano-Glo "add-mix-read"-Assays machen HiBiT zu einem geeigneten, quantitativen, lumineszierenden Peptid-Tag. Bei diesem Ansatz wird das HiBiT-Tag an das Zielprotein angehängt, indem ein Konstrukt entwickelt wird, das minimale strukturelle Interferenzen aufweist. Die HiBiT-Protein-Fusion würde aktiv an das LgBiT-Gegenstück binden und ein hochaktives Luciferase-Enzym produzieren, um in Gegenwart von Nachweisreagenzien nachweisbare Biolumineszenz zu erzeugen (Abbildung 1). In ähnlicher Weise haben wir ein HiBiT Nano-Glo-basiertes System entwickelt, um den neutralisierenden Antikörpertiter in den Seren von SARS-CoV-2-genesenen Individuen leicht zu messen, und kürzlich einen HiBiT-markierten SARS-CoV-2 RBD entwickelt. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll zur Herstellung des HiBiT-RBD-Bioreporters unter Verwendung von Standardlaborverfahren und -geräten und zeigt, wie dieser Bioreporter in einem schnellen und effizienten Assay zum Nachweis von SARS-CoV-2 RBD-Targeting-Antikörpern verwendet werden kann.

Protokoll

HINWEIS: Das unten beschriebene Protokoll entspricht allen Ethikrichtlinien gemäß Protokollcode 20200371-01H.

1. Erstellung und Auswertung des HiBiT-RBD Bioreporters

1. Herstellung einer ausreichenden Menge HiBiT-RBD-Bioreporter
   1. Bereiten Sie sich auf die Zellkultur vor
      1. Bereiten Sie ein komplettes modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco vor, das 10% fötales Rinderserum und 1% Penicillin/Streptomycin enthält. Anschließend erwärmen Sie das Medium in einem 37 °C warmen Wasserbad.
      2. Schalten Sie die biologische Sicherheitswerkbank (BSC) ein und verwenden Sie 70% v / v Ethanol für die Sterilisation der Schrankoberfläche.
   2. Kultur die Zelllinie.
      1. Nehmen Sie die Zelllinie von -80 °C oder flüssigem Stickstoff heraus und tauen Sie sie in einem 37 °C warmen Wasserbad auf.
         HINWEIS: Eine geeignete Zelllinie ist in Kultur leicht zu pflegen, hat eine hohe Transfektionseffizienz und eignet sich für die exogene Proteinproduktion. Für dieses Protokoll wurden menschliche embryonale Nierenzellen HEK293 verwendet.
      2. Mischen Sie die aufgetauten Zellen mit mindestens 10 ml vollständigem Medium, pipettieren Sie die Zellsuspension auf eine 10 cm lange Petrischale und schwenken Sie die Platte, um die Zellen gleichmäßig in der Schale zu verteilen. Stellen Sie die Schale bei 37 °C, 5% _CO2 und 85-95% Luftfeuchtigkeit in einen Zellkultur-Inkubator.
      3. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, bis der Konfluenzgrad 80-90% erreicht. Bei hoher Konfluenz das Medium entfernen, die Zellen mit warmer phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen und 1 ml 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure hinzufügen, um die Zellen von der Oberfläche zu lösen.
         HINWEIS: Die HEK293-Zellen lassen sich relativ leicht lösen. Daher sollte der Waschschritt sehr sanft durchgeführt werden, um ein versehentliches Ablösen und Verlieren von Zellen zu verhindern.
      4. Nach ca. 5 min betrachten Sie die Zellen unter einem Mikroskop. Wenn alle Zellen schwimmen, fügen Sie mindestens 4 ml Medium hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension in ein neues steriles Röhrchen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und fügen Sie 1 × ¹⁰⁶ Zellen in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte zur Transfektion hinzu.
         HINWEIS: Nach 24 h sollten die Zellen zu 80% oder mehr konfluent sein.
   3. Transfektion des HiBiT-RBD-Plasmids
      1. Verwenden Sie 1 μg des HiBiT-RBD-Expressionsplasmids mit einem geeigneten Transfektionsreagenz. Inkubieren Sie für 10-15 min bei Raumtemperatur und fügen Sie dann das Gesamtvolumen zu jeder Vertiefung der Platte hinzu, tropfenweise.
         HINWEIS: Befolgen Sie das Transfektionsprotokoll des Herstellers. In diesem Fall wurde dem verdünnten Plasmid (1 μg) in DMEM ein Gemisch (eine bestimmte Menge) des Transfektionsreagenzes mit DMEM zugesetzt (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie ein markerhaltiges (z. B. grün fluoreszierendes Protein [GFP]) Plasmid als Kontrolle, um die Transfektionseffizienz zu überwachen.
      2. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium, das die Transfektionsmischung enthält, durch ein vollständiges Medium. Beobachten Sie die Transfektionskontrolle 48 h nach der Transfektion gut.
         HINWEIS: Wenn die Transfektion positiv und effizient war (mehr als 80% GFP-positiv), sollten die Zellen für die Ernte des HiBiT-RBD-Bioreporters bereit sein. Das Konstrukt enthält auch His-Tag, mit dem gereinigtes Protein anstelle des gesamten Überstandes gewonnen werden kann.
      3. Sammeln Sie den Überstand in 1,5 ml Mikroröhrchen. Fügen Sie den Zellen 500 μL 1x passiven Lysepuffer (PLB) hinzu; Inkubieren und schütteln Sie die Platte für 15 min bei Raumtemperatur für die Zelllyse.
         HINWEIS: Der Überstand und die Lysatlösung können bei -20 °C mit geringem Integritätsverlust für mindestens 6 Monate konserviert werden. Laut Azad et ^al.22 ist der Reporter bei einem weiten Bereich von pH-Wert (4-12) und Temperatur (4-42 °C) stabil.
2. Auswertung des Lumineszenzsignals aus dem Bioreporter mittels Luciferase-Assay
   1. Vorbereitung der Reaktionskomponenten
      1. Verwenden Sie den Überstand als Quelle des Bioreporters.
         HINWEIS: Sowohl Überstand als auch Lysat enthalten den HiBiT-RBD-Bioreporter und können für den Assay verwendet werden. Der Überstand wird jedoch aus Gründen, die in den folgenden Anmerkungen erläutert werden, als Quelle empfohlen.
      2. Verdünnen Sie das LgBiT und das Substrat vor Gebrauch auf 1x (Die Stammkonzentration beträgt 100x).
         HINWEIS: Weitere Informationen zum LgBiT finden Sie in der Materialtabelle .
   2. Luciferase-Assay
      1. Übertragen Sie 50 μL des Überstands von jedem Bohrloch oder Röhrchen auf eine 96-Well-Platte und fügen Sie 50 μL 1x LgBiT zu jeder Vertiefung hinzu. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      2. Öffnen Sie die Luminometer-Software, fügen Sie 50 μL 1x Substrat (Furimazin) zu jeder Vertiefung hinzu, legen Sie die Platte in das Luminometer und führen Sie die Software aus.
         HINWEIS: Fügen Sie das Substrat unmittelbar vor dem Lesen der Platte hinzu, um den Verzehr des Substrats durch die aktiven Enzyme vor der Signalmessung zu verhindern.

2. Nachweis von Anti-RBD-Antikörpern mit einem schnellen und empfindlichen Assay

1. HiBiT-RBD Antikörper-Nachweis-Assay
   1. Bereiten Sie den HiBiT-RBD-Bioreporter wie in Abschnitt 1.1 des Protokolls beschrieben vor.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, den Überstand für den folgenden Assay zu verwenden, da er einfacher zu sammeln ist und die reife glykosylierte Version des Proteins enthält. Darüber hinaus hat das Lysat mehrere andere Proteine, die die HiBiT-RBD-Antikörper-Interaktion stören könnten.
   2. Kombinieren Sie 50 μL des HiBiT-RBD-haltigen Überstands mit 1 μg des kommerziellen SARS-CoV-2-RBD-Antikörpers in einer 1,5 ml Mikroröhre. 20 μL Immunglobulin-bindendes Protein (Protein G) in die Lösung geben. Erhöhen Sie das Gesamtvolumen auf 300 μL durch Hinzufügen von PBS.
      HINWEIS: Das Gesamtvolumen der Mischung kann auf 150 μL verringert werden. Niedrigere Gesamtvolumina werden nicht empfohlen, da dies zu einer unzureichenden Vermischung von Antikörpern mit dem Bioreporter führen könnte.
   3. Inkubieren Sie das Röhrchen (die Röhrchen) auf einem Röhrchenschüttler oder Rotator für 30 min. Zentrifugiere bei 12.000 × g für 30 s, entsorge den Überstand und wäsche ihn mit PBS. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal, um das freie HiBiT-RBD zu entfernen. Resuspendieren Sie 50 μL PBS und übertragen Sie es auf eine 96-Well-Platte.
   4. Fügen Sie 50 μL 1x LgBiT hinzu und warten Sie 5 min. Dann fügen Sie 50 μL 1x NanoLuc-Substrat hinzu. Sofort das Lumineszenzsignal mit einem Luminometer ablesen.

3. Hochdurchsatznachweis der SARS-CoV-2-spezifischen Antikörper aus Patientenserumproben

1. Bereiten Sie größere Mengen des HiBiT-RBD-Bioreporters für einen Hochdurchsatz-Assay vor, indem Sie Abschnitt 1.1 des Protokolls befolgen.
2. Kombinieren Sie 20 μL magnetisches Protein G mit 50 μL des HiBiT-RBD-Überstands in einer Vertiefung von 96-Well-Platte für jede Probe. Fügen Sie 10 μL der Serumprobe zu jeder Vertiefung hinzu und erhöhen Sie das Gesamtvolumen auf 150 μL durch Zugabe von PBS.
   HINWEIS: Verwenden Sie sowohl unspezifische IgG (Negativkontrolle) als auch neutralisierende SARS-CoV-2-Antikörper (Positivkontrolle) bei einer Konzentration von 1 μg/ml, wie in Schritt 2.1.2 beschrieben. Darüber hinaus können Serumproben von geimpften Mäusen auch auf Antikörper untersucht werden. Bei diesem Test wurden Serumproben vom Ottawa Hospital General Campus nach einem zugelassenen Verfahren und mit informierter Zustimmung von Einzelpersonen entnommen.
3. 30 min auf einem Shaker bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie die Platte auf eine magnetische Unterlegscheibe, um den Protein-G-Antikörperkomplex auszufällen.
   HINWEIS: Die spezifische Struktur der Magnetscheibe fällt den Komplex an den Seitenwänden jedes Bohrlochs aus.
4. Verwerfen Sie die Lösung im mittleren Abschnitt jeder Vertiefung und fügen Sie PBS zum Waschen hinzu. Wiederholen Sie den Waschschritt mindestens dreimal, um überschüssige HiBiT-RBD zu entfernen. Fügen Sie 50 μL 1x PBS und 50 μL 1x LgBiT hinzu. Mindestens 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Bereiten Sie die Luminometer-Software vor und fügen Sie dann 50 μL 1x Substrat hinzu. Legen Sie die Platte in die Maschine, führen Sie die Software aus und zeichnen Sie die Signale auf. Vergleichen Sie die Signale von Serumproben, Kontrollproben und Hintergrund (leere Vertiefungen).

Ergebnisse

Die Signale sowohl des HiBit-RBD-haltigen Zelllysats als auch des Überstandes der transfizierten Zellen wurden aufgezeichnet (Abbildung 2), um die geeignete Proteinquelle zu bewerten. HiBiT-RBD und LgBit wurden separat als Steuerelemente verwendet, und die Daten zeigten einen niedrigen Hintergrund im Vergleich zu einem starken Signal, wenn beide Teile kombiniert wurden. Daher ist die HiBiT-RBD-Interaktion mit LgBiT notwendig, um ein aktives Enzym für die Substratverdauung und die Bioluminesz...

Diskussion

Die steigende Zahl von Menschen, die mit SARS-CoV-2 infiziert sind, und die anhaltenden Bemühungen um eine globale Impfung erfordern empfindliche und schnelle serologische Tests, die in groß angelegten Serosurveys eingesetzt werden können. Jüngste Forschungen zeigen, dass Split-Nanoluciferase-basierte Bioreporter verwendet werden können, um solche Assays zu entwickeln. Wir haben kürzlich den HiBiT-RBD-Bioreporter entwickelt, um einen Test zu entwickeln, mit dem SARS-CoV-2-spezifische Antikörper im Patientenserum schnell ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5x Passiver Lysepuffer	Promega	E194A	30 mL
Bio-Plex Handheld Magnetic Washer	Bio-Rad	171020100
DMEM	Sigma	D6429-500ml
Dual-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2940	100 mL Kit
Fötales Rinderserum (FBS)	Sigma	F1051
HiBiT-RBD Plasmid			gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgtgtgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgggatgtacgggagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagtccatcccat atggagttccgccggttakataacttacggtaa atggcccgcctccccccaccc ccgcccattgacgcaacccccccaataatgacgtgttctccc Atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtttt ggcagtacatcaatgggggaagggatagcggtttg actcacggggatttccaagtccaccaccattg acgtcaatgggagttttccaccaaaatc aacgggactttccaaaatccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatggaatggggcggagagtcgtga ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA 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attattgaagcatttatcagggtgtc tcatgagcggatacatatttgaatattt agaaaaaaaaaaaaaatagggtccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc
LgBiT	Promega	N3030
penicillin Streptomycin	Thermo Fisher Scientific
Pierce Protein G Magnetische Kügelchen	Thermo Fisher Scientific	88848
PolyJet In-vitro-DNA-Transfektionsreagenz	Signagen	SL100688.5
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralisierender Antikörper, Maus Mab	SinoBiological	40592-MM57
Synergy Mx Mikroplatten-Reader	BioTek		96-Well-Plattenleser Lumimeter
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	2520056	0,25