Summary
Een biomembrane force probe (BFP) is een in situ dynamic force spectroscopy (DFS) techniek. BFP kan worden gebruikt om de veerconstante van moleculaire interacties op levende cellen te meten. Dit protocol presenteert veerconstante analyse voor moleculaire bindingen gedetecteerd door BFP.
Abstract
Een biomembrane force probe (BFP) is onlangs naar voren gekomen als een native-cell-surface of in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool die single-molecular binding kinetics kan meten, mechanische eigenschappen van ligand-receptor interacties kan beoordelen, eiwitdynamische conformatieveranderingen kan visualiseren en receptor gemedieerde celmechanosensingmechanismen spannender kan ophelderen. Meer recent is BFP gebruikt om de veerconstante van moleculaire bindingen te meten. Dit protocol beschrijft de stapsgewijze procedure voor het uitvoeren van moleculaire veerconstante DFS-analyse. Specifiek worden twee BFP-werkingsmodi besproken, namelijk de Bead-Cell- en Bead-Bead-modi. Dit protocol richt zich op het afleiden van veerconstanten van de moleculaire binding en cel uit DFS-ruwe gegevens.
Introduction
Als een live-cell DFS-techniek ontwikkelt BFP een menselijke rode bloedcel (RBC; Figuur 1) in een ultragevoelige en afstembare krachtopnemer met een compatibel veerconstantebereik bij 0,1-3 pN/nm1,2,3. Om ligand-receptorinteractie te onderzoeken, maakt BFP DFS-metingen mogelijk bij ~ 1 pN (10-12 N), ~ 3 nm(10 -9 m) en ~ 0,5 ms (10-3 s) in kracht, ruimtelijke en temporele resolutie4,5. De experimentele configuratie bestaat uit twee tegengestelde micropipettes, namelijk de Probe en het doelwit. De Probe micropipette aspirateert een RBC en een kraal wordt aan de top gelijmd via een biotine-streptavidin interactie. De kraal is bedekt met het ligand van belang (figuur 1A). De doelmicropipette aspirateert een cel of een kraal met de receptor van belang, overeenkomend met de modi Bead-Cell (Figuur 1B) en Bead-Bead (Figuur 1C) respectievelijk5.
BFP constructie, assemblage en de DFS experimentele protocollen werden eerder in detail beschreven1,6. In het kort bestaat een BFP-aanraakcyclus uit 5 fasen: Approach, Impinge, Contact, Retract en Dissociate(Figuur 1D). De horizontale RBC-toppositie wordt aangeduid als ΔxRBC. In het begin is de onbelaste (nulkracht) RBC-vervorming ΔxRBC 0 (tabel 1). Het doel wordt vervolgens aangedreven door een piëzotranslator om de sondekraal te impeneren en terug te trekken(figuur 1D). De RBC-sonde wordt eerst gecomprimeerd door het doel met negatieve RBC-vervorming ΔxRBC < 0. In een Bond-gebeurtenis gaat de Retract-fase over van een druk- naar een trekfase met positieve RBC-vervorming ΔxRBC > 0 (figuur 2C en D). Volgens de wet van Hooke kan de BFP-draagkracht worden gemeten als F = kRBC × ΔxRBC, waarbij kRBC ( tabel1) de RBC-veerconstante van de BFP is. Na het scheuren van de binding en het voltooien van de one-touch cyclus, keert de sondekraal terug naar de nulkrachtpositie met ΔxRBC = 0 (Figuur 1D).
Om de kRBCte bepalen, meten en registreren we de radii van de binnenste opening van de sondemicropipette (Rp), de RBC (R0) en het cirkelvormige contactgebied (Rc) tussen de RBC en de sondekraal ( Figuur1A). Vervolgens wordt kRBC berekend volgens het model van Evan (Eq. 1)7,8 met behulp van een LabVIEW-programma dat fungeert als een virtueel instrument (VI) om de BFP te bedienen (Figuur S1A)8,9.
(Eq. 1)
Met een BFP vastgesteld en DFS ruwe gegevens verkregen, presenteren we hierbij hoe de veerconstante van ligand-receptorpaar of cellen te analyseren. De DFS ruwe gegevens over de interactie van het geglycosyleerde eiwit Thy-1 en K562 celdragende integrine α5β1 (Thy-1-α5β1; Figuren 3A en 3B)10 en die van fibrinogeen en met kralen bekleed integrine αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Figuur 3C) 11,12 zijn gebruikt om respectievelijk de Bead-Cell en Bead-Bead analysemodi te demonstreren.
BFP Experimentele Voorbereiding
Voor meer informatie over de experimentele voorbereiding en instrumentatie van BFP verwijzen wij u naar de eerder gepubliceerde protocollen3. Kortom, humane RBC is gebiotinyleerd met behulp van de Biotine-PEG3500-NHS in de koolstof / bicarbonaatbuffer. Interessante eiwitten zijn covalent gekoppeld aan de borosilicaatglasparels met behulp van MAL-PEG3500-NHS in de fosfaatbuffer. Om zich aan de gebiotinyleerde RBC te hechten, wordt de sondekraal ook bedekt met streptavidin (SA) met behulp van de MAL-SA. Zie de tabel met materialen en tabel 2.
Om de BFP te assembleren(figuur 1, links),zal de derde micropipette met de term 'Helper' worden gebruikt om de sondekraal af te leveren en te lijmen op de top1,3vande RBC. De covalente interactie tussen de SA-gecoate sondekraal en gebiotinyleerde RBC is veel sterker dan de ligand-receptorbinding van belang. Het dissociate stadium kan dus worden geïnterpreteerd als de ligand-receptorbindingsruptuur in plaats van de loslating van probekraal van de RBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Analyseerbare DFS-gebeurtenissen verkrijgen
- Start het experiment in de software (bijv. LabVIEW VI) voor de BFP-besturing en parameterinstelling(Figuur S1A).
- Observeer de repetitieve sonde kraal-target kraal / cel aanrakingen in de software voor BFP Monitor(Figuur S1B).
- Test en bereik de adhesiefrequentie ≤ 20% binnen de eerste 50 aanrakingen door de impingementkracht en contacttijd af te stemmen, waardoor het ervoor zorgt dat ≥ 89% van de DFS-adhesiegebeurtenis wordt gemedieerd door enkele bindingen12,13,14.
OPMERKING: Voor elk Bead-Cell/Bead-paar voeren we 200 repetitieve aanraakcycli uit. Om publiceerbare gegevenskwaliteit te verkrijgen, voeren we meestal n ≥ 3 Bead-Bead- of Bead-Cell-paren uit.- Sla gegevens op, in de vorm van Force vs. Time, in de door de gebruiker gerichte map aan het einde van elk paar, gevraagd door de software voor BFP-besturing en parameterinstelling.
- Verzamel de Force vs. Time ruwe gegevens van Bond-gebeurtenissen, zoals geïllustreerd in figuur 2A,met behulp van het BFP-acquisitieplatform(figuur S1C).
- Open de BFP-software voor gegevensanalyse. Klik op het gele mappictogram en selecteer het bijbehorende onbewerkte gegevensbestand door erop te dubbelklikken.
- Voer het programma uit en klik vervolgens op de knop Omhoog en Omlaag om tussen gebeurtenissen te schakelen. Gebruik de uitsluitingscriteria voor uitschieters (Figuur S2) om ongeldige gebeurtenissen af te schermen. Selecteer het exporterende gegevenstype als Force vs. Time-indeling en klik op de knop Plotgegevens exporteren.
2. Converteer de kracht versus tijdcurve naar de kracht versus verplaatsingscurve
- Exporteer het gegevenssegment dat overeenkomt met de fase Intrekken naar een spreadsheet(Afbeelding 2A, vierkant selectiekader), dat relevant is voor de analyse van de veerconstante.
- Plot de Force vs. Time Curve met behulp van spreadsheetsoftware. Om de curve Kracht versus verplaatsing te verkrijgen, converteert u de tijdwaarden(Figuur 2A, x-as) naar de totale verplaatsingswaarden (Δxtot ) door tijdwaardentevermenigvuldigen met piëzo-bewegingssnelheid (d.w.z. 4.000 nm/s per preset).
- Nul het eerste gegevenspunt door de kleinste verplaatsingswaarde af te trekken van elke verkregen verplaatsingswaarde. Deze horizontale transformatie heeft geen invloed op de oplopende hellingen van de Retract-fase of de daaropvolgende veerconstanteberekening.
- Met name wordt de BFP beschouwd als een serieel veersysteem waarin Δxtot ( tabel1) vervormingen van de RBC, ΔxRBC ( tabel1), de moleculaire binding, Δxmol ( tabel1) en de doelcel, Δxcel ( tabel1), als de Eq. 2:
(Eq. 2) - Plot de curve Kracht (F) vs. Verplaatsing (Δxtot) zoals weergegeven in figuur 2B.
(Eq. 2)3. Spring Cnstant Analyse van Kraal-Cell Mode
- In de kracht versus verplaatsingscurve kunnen twee verschillende slop worden geïdentificeerd, waarbij elk de drukfase en de trekfase kan vertegenwoordigen. Plaats een regressielijn op elke gegevensgroep (figuur 2B), waarbij de grotere lineaire helling de totale veerconstante in de drukfase vertegenwoordigt (figuur 2B, rood), aangeduid als k1 (tabel 1); en de kleinere lineaire helling vertegenwoordigt de totale veerconstante in de tensliele fase (figuur 2B, blauw), gegaan als k2 (tabel 1).
- Voor veren die in serie zijn verbonden volgens stap 2.2 beschrijving, de reciproke van de totale veerconstante, ktot (tabel 1), uitdrukken als de som van de veerconstante inverses van RBC, kRBC (tabel 1), de moleculaire binding, kmol (tabel 1) en de doelcel, kcel (tabel 1). Tijdens de compressiefase van de Bead-Cell-modus wordt de moleculaire binding niet uitgerekt, daarom wordt kmol niet in aanmerking genomen. De reciproke van de ktot in dit scenario (1/k1) wordt uitgedrukt als
(Eq. 3).
In de voorbeeldgegevens is kRBC vooraf bepaald (standaard 0,25 pN/nm). k-cel kan worden afgeleid van het Eq. 3 met de verworven k1 en kRBC ( figuur3B). - Tijdens de trekfase wordt adhesie gevormd tussen het ligand-receptorpaar. Druk de reciproke van de ktot in dit scenario (1/k2) uit als
(Eq. 4)
waarbij k2 (tabel 1) de totale veerconstante tijdens de trekfase weergeeft. - Leid kmol af van het aftrekken van 1/k1 van 1/k2 (vergelijk Eq. 3 vs. Eq. 4).
(Eq. 3).
(Eq. 4)4. Veer constante analyse van kraal-kraal modus
- Plaats een regressielijn op de compressiefasegegevens om k1 te verkrijgen (vergelijkbaar met figuur 2B, rood). Let op, in de Bead-Bead-modus wordt de doelcel vervangen door een glazen kraal bedekt met de receptor van belang(Figuur 1C). Aangezien de vervorming van de kralen verwaarloosbaar is, kan decelterm 1/kdienovereenkomstig uit de Eq. 3 en Eq. 4 worden verwijderd. De reciproke k tot van de drukfase (1/k1) kan worden uitgedrukt als:
(Eq. 5) - Plaats een regressielijn op de trekfasegegevens om k2 te verkrijgen (vergelijkbaar met figuur 2B, blauw). De reciproke k tot van de trekfase (1/k2) kan worden uitgedrukt als:
(Eq. 6) - Leid kmol af van het aftrekken van 1/k1 van 1/k2 (vergelijk Eq. 5 vs. Eq. 6).
(Eq. 5)
(Eq. 6)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit werk hebben we het protocol van de BFP veerconstante analyse gedemonstreerd. Voor de Bead-Cell-analysemodus analyseerden we de kmol van de moleculaire binding tussen het geglycosyleerde eiwit Thy-1 gecoat op de Probe-kraal en het integrine-α5β1 uitgedrukt op de Target K562-cel (Thy-1-integrine α5β1; Figuur 3A) 10. Dek-cel is ook afgeleid van de Bead-Cell-modus (K562-cel; Figuur 3B). Voor de Bead-Bead-modus werd de moleculaire binding gevormd tussen fibrinogeen en integrine αIIbβ3 (FGN-integrine αIIbβ3; Figuur 3C) 11,12 wordt gebruikt om de Bead-Bead-analysemodus te demonstreren.
Voor de Bead-Cell-modus maten we de veerconstanten van Thy-1-integrine α5β1 binding en K562-cel als kmol = 0,45 ± 0,28 pN / nm (Figuur 3A) en k-cel = 0,18 ± 0,07 pN / nm (Figuur 3B) van 27 vooraf gescreende analyseerbare gebeurtenissen. Voor de Bead-Bead-modus maten we de veerconstanten van FGN-integrine αIIbβ3 binding als kmol = 0,53 ± 0,29 pN/nm (Figuur 3C) van 33 vooraf gescreende analyseerbare gebeurtenissen.
| Symbool | Definitie | Symbool | Definitie |
| Δxtot | De totale verplaatsing van de piëzo, die ook kan worden geïnterpreteerd als de totale vervorming van RBC, doelcel en moleculaire binding. | ΔxRBC | De RBC-vervorming, die ook kan worden geïnterpreteerd als de verplaatsing van de probekraal. |
| ktot | De totale veerconstante van het gehele BFP seriële veersysteem. | KRBC | De veerconstante van de aangezogen RBC door de Probe micropipette. |
| kmol | De veerconstante van de BFP detecteerde moleculaire binding | kcel | De veerconstante van de Doelcel. |
| K1 | ktot van de drukfase in de retract-fase. | K2 | ktot van de trekfase in de retract-fase. |
| ΔF1 | De toename van de kracht die door de probekraal in de drukfase wordt gevoeld. | ΔF2 | De toename van de kracht die door de probekraal in de trekfase wordt gevoeld. |
| Δx1 | De toename van verplaatsing in de compressiefase. | Δx2 | De toename van verplaatsing in de trekfase. |
Tabel 1. Symbooldefinities voor de BFP moleculaire veerconstante analyse. Horizontale posities van alle objecten worden gedefinieerd als x, terwijl Δx [nm] verwijst naar de vervorming ten opzichte van de oorspronkelijke positie. ΔF [pN] verwijst naar de krachttoename gemeten door BFP. k [pN/nm] verwijst naar de veerconstante. Subscripts 1 en 2 komen overeen met respectievelijk de druk- en trekfase. De moleculaire veerconstante is afgeleid van de Kracht (F) vs. Verplaatsingscurve (Δxtot).
Afbeelding 1: BFP-configuratie en DFS-aanraakcyclus. (A) Het BFP-systeem assembleert twee tegengestelde micropipettes, namelijk de Probe(links)en de Target(rechts). De Probe micropipette aspirateert een RBC(rood)met een glazen kraal gelijmd aan de top om te dienen als een krachtopnemer. De Target micropipette aspirateert een receptordragende cel(blauw). De RBC-veerconstante (kRBC) wordt bepaald door de aspiratiedruk (Δp) en de radii van aangezogen RBC (R0), Probe micropipette (Rp) en cirkelvormig contactgebied (Rc) tussen de RBC en de Probe-kraal. (B en C) Microfoto's van de BFP-modi Bead-Cell (B) en Bead-Bead (C). Schaalbalken = 5 μm. (D) Een BFP-aanraakcyclus die bestaat uit de fasen Approach, Impinge, Contact, Retract en Dissociate. De Δ xRBC = 0-streepjeslijn geeft de onbelaste of nulkrachtige positie van de BFP aan. De retract-fase omvat de drukfase (ΔxRBC < 0, rood),de nulkrachtpositie (ΔxRBC = 0, zwart)en de trekfase (ΔxRBC > 0, blauw)achter elkaar. De zwarte pijl geeft de positie van de Bond-gebeurtenis aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Leid moleculaire veerconstanten af uit DFS-ruwe gegevens. (A) Representatieve kracht (F) vs. Tijd (t) curve van DFS-onbewerkte gegevens in één BFP-aanraakcyclus. (B) Representatieve geconverteerde kracht (F) vs. verplaatsingscurve (Δxtot) die de intrektrap weergeeft. k1 en k2 vertegenwoordigen de fithelling van respectievelijk de opeenvolgende druk- en trekfase. ΔF1 en ΔF2 vertegenwoordigen respectievelijk de krachttoenames in respectievelijk de drukfase en de trekfasegegevens, waarbij Δx1 en Δx2 de toename van verplaatsing in respectievelijk de drukfase en trekfasegegevens vertegenwoordigen. R2-waarden voor veerconstante tijdens de drukfase (R12) en trekfase (R2 2) zijn op de grafiek gelabeld om een goede statistische geschiktheid aan te geven. (C en D) Illustraties van de retract-fase in de experimentele modi Bead-Cell (C) en Bead-Bead (D). kRBC vertegenwoordigt de veerconstante van RBC; k-cel en kmol vertegenwoordigen respectievelijk de veerconstanten van de doelcel en de moleculaire binding. Tijdens de trekfase wordt adhesie gevormd tussen het ligand-receptorpaar, de RBC buigt in dezelfde richting als piëzo zich terugtrekt voorbij de nulkrachtpositie (ΔxRBC > 0). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve histogrammen van BFP gemeten veerconstanten. Het gebeurtenisnummer (linker y-as) en frequentieverdeling (rechter y-as) van gemeten veerconstanten voor Thy-1-integrine α5β1 binding (A) en K562 Doelcel (B) in de Bead-Cell modus en FGN-integrine αIIbβ3 binding (C) in de Bead-Bead modus. Histogrammen passen bij de Gaussiaanse verdelingscurve (roze) en de statistische parameter, R2, wordt gebruikt om de sterkte van de fitheid aan te geven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur S1: De zelfgemaakte BFP-interface. (A) BFP-besturings- en parameterinstellingsinterface. De parameters om de RBC-veerconstante te bepalen, worden ingevoerd vanuit het paneel van biofysische parameters. B) BFP-monitoring. Live BFP-aanraakcycli worden waargenomen vanuit deze cameraweergave. (C) BFP DFS-analyse-interface waarbij de curven Force (F) vs. Time (t) offline worden beoordeeld en voorbewerkt voor daaropvolgende moleculaire veerconstanteanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S2. BFP analyseerbare gegevenskwaliteitscontrole en pre-screening criteria. (A) Goede DFS-gebeurtenissen met hoge kwaliteit: (i) Kraal-Cel breukkrachtgebeurtenis; (ii) Bead-Cell lifetime event; (iii) Kraal-Kraal breukkrachtgebeurtenis; (iv) Bead-Bead lifetime event. (B) Acceptabele DFS-gebeurtenissen met enige ruis: (i) Gegevens drijven maar de inzoomfase Intrekken blijft geldig; ii) Lichte gegevens die afdrijven na bindingsdissociatie; (iii) gegevens knikken bij het nulkrachtenregime; iv) De houdkracht is klein (< 10 pN). C) Gebeurtenissen van slechte kwaliteit die moeten worden weggegooid: (i) Geen hechting; ii) gegevensschommelingen; (iii) gegevens die de hele tijd afdrijven; (iv) discontinue gegevens; v) te kleine drukkracht (≈ 0 pN); (vi) Meerdere obligaties; (vii) Ongeldige gegevens met afgeleide kmol < 0; (viii) Signaalfout. Nulkracht wordt aangegeven door de grijze intermitterende lijn. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Samenvattend hebben we een gedetailleerd data-analyseprotocol geleverd voor het voorbewerken van de DFS-ruwe gegevens en het afleiden van moleculaire veerconstanten in de BFP Bead-Bead en Bead-Cell analysemodi. Biomechanische modellen en vergelijkingen die nodig zijn voor het bepalen van moleculaire en cellulaire veerconstanten worden gepresenteerd. Hoewel verschillende integrinen worden bestudeerd, heeft de kmol gemeten door de Bead-Bead-modus en de Bead-Cell-modus significante bereiksverschillen ( Figuur3A vs. Figuur 3C). Let op, met de Bead-Bead-modus is de receptor covalent gekoppeld aan de glazen kraal. In tegenstelling tot de Bead-Cell-modus wordt de oppervlaktereceptor aangepast door het onderliggende plasmamembraan en cytoskeletten, die hoogstwaarschijnlijk de gemeten kmolbeïnvloeden .
Controle van de gegevenskwaliteit is cruciaal om de reproduceerbaarheid te waarborgen. Hiertoe hebben we de DFS-gegevensvoorscreening en uitsluitingscriteria voor uitschieters geïmplementeerd op de Force vs. Time-plots. Om dit aan te tonen, werd een representatieve dataset geselecteerd, waarin we de dfs-ruwe gegevens in drie kwaliteitsniveaus hebben ingedeeld: goed(figuur S2A),acceptabel met ruis(figuur S2B)en slecht onaanvaardbaar(figuur S2C). Voor beginners van het gebruik van de BFP, raden we de strikte criteria aan om de gegevens vooraf te screenen met de Goede kwaliteit(Figuur S2A). Op basis van de gegevenscriteria vóór de screening moet de regressiefitlijn van de drukfase steiler zijn dan die van de trekfase, met name k1 > k2 ( figuurS2C, vii). Gemeten k1 < k2 (figuur S2C, vii), is de afgeleide kmol < 0 tegen de redenering per berekening in stap 4. Dergelijke gebeurtenissen moeten dan worden beschouwd als de ongeldige uitschieters en worden weggegooid.
Om de BFP-meting op enkelmolecuul niveau tijdens data-acquisitie te bevorderen, zijn volgens eerdere studie meerdere experimentele configuraties geïmplementeerd12. Ten eerste wordt de eiwitcoatingdichtheid op kralen meestal getitreerd tot een minimaal niveau (bijv. 60 μm-2) door de concentratie van de oplossing, de hoeveelheid eiwit en de reactieomstandigheden strikt te controleren15. De gemiddelde ruimtelijke afstand tussen eiwitten op de kraal wordt daardoor veel groter geschat dan de lineaire dimensies van het eiwit, wat onze metingen op enkelmolecuul niveau12,13,14begunstigt. Ten tweede regelen we de adhesiefrequentie voor elk ligand-receptorpaar ≤ 20%, waarbij moleculaire bindingsgebeurtenissen poissonverdeling zullen volgen en voorspellen ≥ 89% van de gebeurtenissen enkelmoleculaire binding zou zijn14,15. Om dit te bereiken, worden impingementkracht en contacttijd dienovereenkomstig ingesteld en moeten ze consistent zijn gedurende het hele experiment12. Toch is het nog steeds mogelijk dat meerdere bindingen achter elkaar voorkomen (Figuur S2C, vi). In dergelijke gevallen zullen we de gebeurtenissen met handtekeningen van meerdere obligaties weggooien. Last but not least zullen negatieve controle-experimenten worden uitgevoerd met kralen bedekt met runderserumalbumine (Table of Materials) of SA alleen om ervoor te zorgen dat de niet-specifieke hechtingsfrequentie ≤ 2%16,17is.
Hoewel BFP krachtig is om eiwitdynamiek op levend celoppervlak10,11,12te onderzoeken, zijn er technische beperkingen. Bij BFP kan slechts één ligand-receptorpaar tegelijk worden onderzocht. Het zou tijdrovend zijn om voldoende gegevens met statistische significantie te verkrijgen. Bovendien zijn de experimentele procedures arbeidsintensief met steile leercurves. Qua implementatie is het huidige BFP-systeem gevoelig voor omgevingsdrift en omringende mechanische trillingen. Als gevolg hiervan is continue handmatige aanpassing vereist om de DFS-gegevenskwaliteit te waarborgen. Hiertoe heeft een van onze recente studies ultrastabiele BFP-feedbackcontrolealgoritmen geïntroduceerd om de stabiliteit van de BFP-krachtklem DFS-assays te verbeteren4. Deze technische vooruitgang maakt metingen van sterkere moleculaire interactie mogelijk, zoals antigeen-antilichaambinding met ultralange bindingslevensduur (>50 s). Niettemin voorzien we dat er in de toekomst inspanningen zullen worden geleverd om de BFP-gegevensverzameling en DFS-analyse te automatiseren en te integreren in één geautomatiseerd programma, waardoor de volledige BFP-operatie en gegevensanalyse gebruiksvriendelijker en met een hoge doorvoer worden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen te melden hebben met betrekking tot de huidige studie.
Acknowledgments
We bedanken Guillaume Troadec voor de nuttige discussie, Zihao Wang voor hardwareconsultatie en Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning en Simon Ringer voor ondersteuning van onze labstart-up. Dit werk werd ondersteund door het Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator prize (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.), en The University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Equipment Scheme (L.A.J.). Lining Arnold Ju is een Decra fellow van de Australian Research Council (DE190100609).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| BFP data acquisition VI | LabVIEW | BFP control and parameter setting | |
| BFP data analysis VI | LabVIEW | BFP raw data analysis | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology, Netherlands | 9002 | Glass bead functionalization |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalization |
| Camera VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’s buffer preparation |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Glass bead functionalization |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
References
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
- Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
- An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
- Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C.
- Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886 (2014).
- Passam, F., et al.
- Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
- Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
- Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
- Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447 (2016).
