Method Article

Molekulare Federkonstantenanalyse mittels Biomembran-Kraftsondenspektroskopie

DOI:

10.3791/62490

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November 20th, 2021

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1School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney, 2Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 3Heart Research Institute, 4Department of Chemistry, The Hong Kong University of Science and Technology, 5School of Aerospace, Mechanical and Mechatronic Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine Biomembrankraftsonde (BFP) ist eine In-situ-Technik der dynamischen Kraftspektroskopie (DFS). BFP kann verwendet werden, um die Federkonstante molekularer Wechselwirkungen auf lebenden Zellen zu messen. Dieses Protokoll präsentiert eine Federkonstantenanalyse für molekulare Bindungen, die von BFP nachgewiesen wurden.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine Biomembrankraftsonde (BFP) hat sich kürzlich als Nanowerkzeug für die native Zelloberfläche oder die dynamische Kraftspektroskopie (DFS) mit nativer Zelloberfläche oder in situ entwickelt, das die einzelmolekulare Bindungskinetik messen, mechanische Eigenschaften von Liganden-Rezeptor-Interaktionen bewerten, proteindynamische Konformationsänderungen visualisieren und rezeptorvermittelte Zellmechanosensormechanismen aufregender aufklären kann. In jüngerer Zeit wurde BFP verwendet, um die Federkonstante molekularer Bindungen zu messen. Dieses Protokoll beschreibt das schrittweise Verfahren zur Durchführung der molekularen Federkonstanten-DFS-Analyse. Konkret werden zwei BFP-Betriebsmodi diskutiert, nämlich die Bead-Cell- und Bead-Bead-Modi. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Ableitung von Federkonstanten der molekularen Bindung und Zelle aus DFS-Rohdaten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als Lebendzell-DFS-Technik entwickelt BFP ein menschliches rotes Blutkörperchen (RBC; Abbildung 1) in einen ultraempfindlichen und abstimmbaren Kraftaufnehmer mit einem kompatiblen Federkonstantenbereich bei 0,1-3 pN/nm1,2,3. Um die Liganden-Rezeptor-Interaktion zu untersuchen, ermöglicht BFP DFS-Messungen bei ~1 pN (10-12 N), ~3 nm (10-9 m) und ~0,5 ms (10-3 s) in Kraft, räumlicher und zeitlicher Auflösung4,5. Seine experimentelle Konfiguration besteht aus zwei gegenüberliegenden Mikropipetten, nämlich der Sonde und dem Ziel. Die Sonden-Mikropipette saugt ein RBC an und eine Perle wird an ihrer Spitze über eine Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung geklebt. Die Perle ist mit dem interessierenden Liganden beschichtet (Abbildung 1A). Die Target-Mikropipette aspirat entweder eine Zelle oder eine Perle mit dem interessierenden Rezeptor, entsprechend den Modi Bead-Cell (Abbildung 1B) und Bead-Bead (Abbildung 1C) bzw.5.

BFP-Aufbau, Montage und die DFS-Versuchsprotokolle wurden zuvor ausführlich beschrieben1,6. Kurz gesagt, ein BFP-Touch-Zyklus besteht aus 5 Stufen: Annäherung, Impinge, Kontakt, Rückzug und Dissoziieren (Abbildung 1D). Die horizontale RBC-Spitzenposition wird als ΔxRBC bezeichnet. Zu Beginn ist die unbelastete (kraftfreie) RBC-Verformung ΔxRBC 0 (Tabelle 1). Das Ziel wird dann von einem Piezotranslator angetrieben, um auf die Sondenperle einzufallen und sich von ihr zurückzuziehen (Abbildung 1D). Die RBC-Sonde wird zunächst vom Target mit negativer RBC-Verformung ΔxRBC-< 0 komprimiert. In einem Bond-Ereignis geht die Retract-Stufe von einer Druck- in eine Zugphase mit positiver RBC-Verformung ΔxRBC > 0 über(Abbildung 2C und D). Nach dem Hookeschen Gesetz kann die BFP-Lagerkraft als F = kRBC × ΔxRBCgemessenwerden, wobei kRBC ( Tabelle1) die RBC-Federkonstante des BFP ist. Nach Abschluss eines Berührungszyklus kehrt die Sondenperle mit Δ xRBC = 0 in die Nullkraftposition zurück (Abbildung 1D).

Zur Bestimmung des kRBCmessen und erfassen wir die Radien der Sondenmikropipetten-Innenöffnung (Rp), der RBC (R0) und der kreisförmigen Kontaktfläche (Rc) zwischen dem RBC und der Sondenperle ( Abbildung1A). Dann wird kRBC nach dem Evan's Modell (Eq. 1)7,8 unter Verwendung eines LabVIEW-Programms berechnet, das als virtuelles Instrument (VI) zum Betrieb des BFP fungiert (Abbildung S1A)8,9.

Statische Gleichgewichtsgleichung für kRBC in der Fluiddynamik mit Variablen und logarithmischen Termen. (Gleichung 1)

Mit einem BFP etabliert und DFS Rohdaten erhalten, präsentieren wir hiermit, wie die Federkonstante von Liganden-Rezeptor-Paaren oder Zellen analysiert werden kann. Die DFS-Rohdaten zur Wechselwirkung des glykosylierten Proteins Thy-1 und K562 zelltragendes Integrin α5β1 (Thy-1-α5β1; Abbildungen 3A und 3B)10 und die des fibrinogen- und perlenbeschichteten Integrins αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Abbildung 3C) 11,12 wurden verwendet, um die Analysemodi Bead-Cell bzw. Bead-Bead zu demonstrieren.

BFP Versuchsvorbereitung
Einzelheiten zur experimentellen Vorbereitung und Instrumentierung von BFP finden Sie in den zuvor veröffentlichten Protokollen3. Kurz gesagt, humanes RBC wurde mit dem Biotin-PEG3500-NHS im Kohlenstoff-/Bicarbonatpuffer biotinyliert. Interessante Proteine wurden kovalent mit den Borosilikatglasperlen unter Verwendung von MAL-PEG3500-NHS im Phosphatpuffer gekoppelt. Zur Bindung an das biotinylierte RBC wird die Sondenperle auch mit Streptavidin (SA) unter Verwendung des MAL-SA beschichtet. Bitte beachten Sie die Materialtabelle und Tabelle 2.

Um den BFP (Abbildung 1, links) zusammenzubauen, wird die dritte Mikropipette, die als "Helper" bezeichnet wird, verwendet, um die Sondenperle zu liefern und sie an die Spitze1,3des RBC zu kleben. Die kovalente Wechselwirkung zwischen der SA-beschichteten Sondenperle und dem biotinylierten RBC ist viel stärker als die interessierende Ligandenrezeptorbindung. Daher kann das Dissoziierungsstadium als Liganden-Rezeptor-Bindungsbruch und nicht als Ablösung der Sondenperle vom RBC interpretiert werden.

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Protocol

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1. Abrufen analysierbarer DFS-Ereignisse

  1. Starten Sie das Experiment in der Software (z. B. LabVIEW VI) für die BFP-Steuerung und Parametrierung (Abbildung S1A).
  2. Beobachten Sie die sich wiederholenden Berührungen der Sondenperlen-Zielperle/Zelle in der Software für BFP Monitor (Abbildung S1B).
  3. Testen und erreichen Sie die Adhäsionsfrequenz ≤ 20% innerhalb der ersten 50 Berührungen durch Abstimmung der Impingementkraft und der Kontaktzeit, wodurch sichergestellt wird, dass ≥ 89% des DFS-Adhäsionsereignisses durch Einzelbindungen12,13,14vermittelt werden.
    HINWEIS: Für jedes Perlen-Zell/Perlen-Paar führen wir 200 sich wiederholende Berührungszyklen durch. Um eine publizierbare Datenqualität zu erhalten, führen wir in der Regel n ≥ 3 Perlen-Perlen- oder Perlenzellpaare durch.
    1. Speichern Sie die Daten in Form von Force vs. Time am Ende jedes Paares im benutzergesteuerten Ordner, der von der Software zur BFP-Steuerung und Parametereinstellung aufgefordert wird.
  4. Sammeln Sie die Force vs. Time-Rohdaten von Bond-Ereignissen, wie in Abbildung 2Averanschaulicht, mithilfe der BFP-Erfassungsplattform (Abbildung S1C).
    1. Öffnen Sie die BFP-Datenanalysesoftware. Klicken Sie auf das gelbe Ordnersymbol und wählen Sie durch Doppelklick die entsprechende Rohdatendatei aus.
  5. Führen Sie das Programm aus, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche nach oben und unten, um zwischen den Ereignissen zu wechseln. Verwenden Sie die Ausreißerausschlusskriterien (Abbildung S2 ),um ungültige Ereignisse auszublenden. Wählen Sie den exportierenden Datentyp als Format Force vs. Time aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Plots Data exportieren.

2. Konvertieren Sie die Kraft-Zeit-Kurve in die Kraft-Verschiebungs-Kurve

  1. Exportieren Sie das Datensegment, das der Retract-Stufe entspricht, in eine Tabelle (Abbildung 2A, quadratischer Auswahlrahmen), die für die Federkonstantenanalyse relevant ist.
  2. Zeichnen Sie die Kraft- vs. Zeitkurve mit tabellenkalkulationssoftware. Um die Kraft-Verdrängungskurve zu erhalten, konvertieren Sie die Zeitwerte (Abbildung 2A, x-Achse) in die Gesamtverschiebungswerte (Δxtot), indem Sie Zeitwerte mit der Piezobewegungsgeschwindigkeit multiplizieren (d. h. 4.000 nm / s durch Voreinstellung).
  3. Null den ersten Datenpunkt, indem der kleinste Verschiebungswert von jedem erfassten Verschiebungswert subtrahiert wird. Diese horizontale Transformation wirkt sich weder auf die aufsteigenden Steigungen der Retract-Stufe noch auf die anschließende Berechnung der Federkonstante aus.
  4. Insbesondere wird das BFP als serielles Federsystem betrachtet, in dem Δxtot (Tabelle 1) Verformungen des RBC, ΔxRBC (Tabelle 1), der molekularen Bindung, Δxmol (Tabelle 1) und der Zielzelle, ΔxZelle (Tabelle 1), als Eq. 2 summen:
    Statische Gleichgewichtsgleichung Δxtot=ΔxRBC+Δxmol+Δxcell, mathematische Formel. (Gleichung 2)
  5. Zeichnen Sie die Kurve Kraft (F) vs. Verschiebung (Δxtot) wie in Abbildung 2Bdargestellt.

3. Spring Cnstant Analyse des Perlen-Zell-Modus

  1. In der Kraft-Verschiebungs-Kurve können zwei unterschiedliche Steigungen identifiziert werden, wobei jede die Druckphase und die Zugphase darstellen kann. Passen Sie eine Regressionslinie an jede Datengruppe an (Abbildung 2B), wobei die größere lineare Anpassungssteigung die Gesamtfederkonstante in der Druckphase darstellt (Abbildung 2B, rot), gekennzeichnet als k1 (Tabelle 1); und die kleinere lineare Passungsneigung stellt die Gesamtfederkonstante in der Zugphase dar (Abbildung 2B, blau), gekennzeichnet als k2 (Tabelle 1).
  2. Für in Reihe geschaltete Federn gemäß Der Beschreibung der Stufe 2.2 wird der Kehrwert der Gesamtfederkonstante ktot (Tabelle 1) als Summe der Federkonstantenumkehrungen von RBC, kRBC (Tabelle 1), der molekularen Bindung kmol (Tabelle 1) und der Zielzelle kZelle (Tabelle 1) angegeben. Während der Druckphase des Bead-Cell-Modus wird die molekulare Bindung nicht gedehnt, daher wird kmol nicht berücksichtigt. Der Kehrwert des ktot in diesem Szenario (1/k1) wird ausgedrückt als
    Gleichung zur Darstellung der Zellkinetik in der Biologie; Diagramm der kinetischen Konstanten: k1, kRBC, kcell. (Gleichung 3).
    In den Beispieldaten ist kRBC vorbestimmt (standardmäßig 0,25 pN/nm). kZelle kann aus dem Eq. 3 mit dem erworbenen k1 und kRBC abgeleitet werden ( Abbildung3B).
  3. Während der Zugphase bildet sich eine Adhäsion zwischen dem Liganden-Rezeptor-Paar. Drücken Sie den Kehrwert des ktot in diesem Szenario (1/k2) als
    Widerstandsgleichung in Reihe, die 1/k2 = 1/kRBC + 1/kmol + 1/kcell zeigt, verwendet in der Kinetikstudie. (Gleichung 4)
    wobei k2 (Tabelle 1) die Gesamtfederkonstante während der Zugphase darstellt.
  4. Leiten Sie kmol ab, wenn Sie 1/k1 von 1/k2 subtrahieren (vergleichen Sie Eq. 3 vs. Eq. 4).

4. Federkonstante Analyse des Perlen-Perlen-Modus

  1. Passen Sie eine Regressionslinie an die Druckphasendaten an, um k1 zu erhalten (ähnlich wie in Abbildung 2B, rot). Bemerkenswert ist, dass im Bead-Bead-Modus die Zielzelle durch eine Glasperle ersetzt wird, die mit dem interessierenden Rezeptor beschichtet ist (Abbildung 1C). Da die Wulstverformung vernachlässigbar ist, kann der 1/kZellterm entsprechend aus dem Eq. 3 und Eq. 4 entfernt werden. Das reziproke ktot der Druckphase (1/k1) kann wie folgt ausgedrückt werden:
    Gleichung mit Beziehung: 1/k1 = 1/kRBC; Schlüssel für kinetische Geschwindigkeitskonstanten in der biochemischen Analyse. (Gleichung 5)
  2. Passen Sie eine Regressionslinie an die Zugphasendaten an, um k2 zu erhalten (ähnlich wie in Abbildung 2B, blau). Das reziproke ktot der Zugphase (1/k2) kann wie folgt ausgedrückt werden:
    Reaktionsgeschwindigkeitsgleichung, Diagramm der inversen Geschwindigkeitskonstanten; k2, kRBC, kmol Begriffe für die kinetische Analyse. (Gleichung 6)
  3. Leiten Sie kmol ab, wenn Sie 1/k1 von 1/k2 subtrahieren (vergleichen Sie Eq. 5 vs. Eq. 6).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Arbeit haben wir das Protokoll der BFP-Federkonstantenanalyse demonstriert. Für den Bead-Cell-Analysemodus analysierten wir das kmol der molekularen Bindung zwischen dem auf der Sondenperle beschichteten glykosylierten Protein Thy-1 und dem Integrin α5β1, exprimiert auf der Zielzelle K562 (Thy-1-integrin α5β1; Abbildung 3A) 10.Diek-Zelle ist ebenfalls aus dem Bead-Cell-Modus (K562 Cel...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zusammenfassend haben wir ein detailliertes Datenanalyseprotokoll zur Vorverarbeitung der DFS-Rohdaten und zur Ableitung molekularer Federkonstanten in den BFP-Analysemodi Bead-Bead und Bead-Cell bereitgestellt. Biomechanische Modelle und Gleichungen, die zur Bestimmung molekularer und zellulärer Federkonstanten erforderlich sind, werden vorgestellt. Obwohl verschiedene Integrine untersucht werden, besitzt das kmol, gemessen durch den Bead-Bead-Modus und den Bead-Cell-Modus signifikante Reichweitenunt...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben, über die vorliegende Studie zu berichten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Guillaume Troadec für die hilfreiche Diskussion, Zihao Wang für die Hardware-Beratung und Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning und Simon Ringer für die Unterstützung unseres Labor-Startups. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), das NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), den Sydney Research Accelerator Prize (SOAR - L.A.J.), den Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), den National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.) und den University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Equipment Scheme (L.A.J.). Lining Arnold Ju ist deCRA-Fellow des Australian Research Council (DE190100609).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-Mercaptopropyltrimethoxysilan (MPTMS)Uct, Specialties, llc4420-74-0Glasperlen-Funktionalisierung
Anhy. Natriumphosphat Dibasisch (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907Phosphatpuffervorbereitung
BFP-Datenerfassung VILabVIEWBFP-Steuerung und Parametereinstellung
BFP-Datenanalyse VILabVIEWBFP-Rohdatenanalyse
Biotin-PEG3500-NHSJenKemA5026-1Erythrozyten-Biotinylierung
BorosilikatglasperlenDistrilab Particle Technology, Niederlande9002Funktionalisierung von Glasperlen
RinderserumalbuminSigma-AldrichA0336Ligandenfunktionalisierung
Kamera VILabVIEWBFP monitoring
D-glucoseSigma-AldrichG7021Tyrode s Puffervorbereitung
HepesSigma-AldrichH3375Tyrode' s Puffervorbereitung
MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1Glasperlenfunktionalisierung
Kaliumchlorid (KCl)Sigma-AldrichP9541Tyrode ' Puffervorbereitung
Natriumbicarbonat (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Carbonat/Bicarbonat-Pufferzubereitung; Tyrode" Pufferzubereitung
Natriumcarbonat (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127Carbonat/Bicarbonat-Pufferzubereitung
Natriumchlorid (NaCl)Sigma-AldrichS7653Tyrode" Natriumphosphat
Monobasisches Monohydrat (NaH2PO4• H2O)Sigma-AldrichS9638Phosphatpuffer-Präparation
Streptavidin-MaleimidSigma-AldrichS9415Funktionalisierung von Glasperlen

References

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