Leukodepletion Filter-abgeleitete CD34+ Zellen als Zellquelle zur Untersuchung der Megakaryozytendifferenzierung und Thrombozytenbildung

Anaïs Pongerard; Lea Mallo; Christian Gachet; Henri de La Salle; François Lanza; Catherine Strassel

doi:10.3791/62499

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Methodenartikel

Leukodepletion Filter-abgeleitete CD34+ Zellen als Zellquelle zur Untersuchung der Megakaryozytendifferenzierung und Thrombozytenbildung

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DOI:

10.3791/62499

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20. Mai 2021

Anaïs Pongerard¹ , Lea Mallo¹ , Christian Gachet¹ , Henri de La Salle¹ , François Lanza¹ , Catherine Strassel¹

¹BPPS UMR-S 1255, FMTS, Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt detailliert alle Schritte zur Gewinnung von Leukofilter-abgeleiteten CD34+ hämatopoetischen Vorläufern und deren In-vitro-Differenzierung und Reifung zu proplatlettragenden Megakaryozyten, die in der Lage sind, Blutplättchen im Kulturmedium freizusetzen. Dieses Verfahren ist nützlich für die eingehende Analyse zellulärer und molekularer Mechanismen, die die Megakaryopoese kontrollieren.

Zusammenfassung

Die In-vitro-Expansion und Differenzierung menschlicher hämatopoetischer Vorläufer in Megakaryozyten, die in der Lage sind, Proplatelette zu verlängern und Blutplättchen freizusetzen, ermöglicht eine eingehende Untersuchung der Mechanismen, die der Thrombozytenbiogenese zugrunde liegen. Verfügbare Kulturprotokolle basieren meist auf hämatopoetischen Vorläufern, die aus Knochenmark oder Nabelschnurblut gewonnen werden, was eine Reihe ethischer, technischer und wirtschaftlicher Bedenken aufwirft. Wenn es bereits verfügbare Protokolle zur Gewinnung von CD34-Zellen aus peripherem Blut gibt, schlägt dieses Manuskript ein einfaches und optimiertes Protokoll zur Gewinnung von CD34+-Zellen aus Leukodepletionsfiltern vor, die in Blutzentren leicht verfügbar sind. Diese Zellen werden aus Leukodepletionsfiltern isoliert, die bei der Herstellung von Bluttransfusionsprodukten verwendet werden, was acht Blutspenden entspricht. Diese Filter sollen verworfen werden. Ein detailliertes Verfahren zur Entnahme hämatopoetischer Vorläufer, die als CD34+-Zellen identifiziert wurden, aus diesen Filtern wird beschrieben. Die Methode, um reife Megakaryozyten zu erhalten, die Proplatele verlängern, während ihre phänotypische Evolution diskutiert wird, wird ebenfalls detailliert beschrieben. Schließlich stellt das Protokoll eine kalibrierte Pipettiermethode vor, um Thrombozyten, die morphologisch und funktionell nativen ähnlich sind, effizient freizusetzen. Dieses Protokoll kann als Grundlage für die Bewertung pharmakologischer Verbindungen dienen, die in verschiedenen Schritten des Prozesses wirken, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu sezieren und sich den In-vivo-Thrombozytenausbeuten zu nähern.

Einleitung

Blutplättchen stammen aus spezialisierten großen polyploiden Zellen, den Megakaryozyten (MK), die aus einem konstanten und fein abgestimmten Produktionsprozess stammen, der als Megakaryopoese (MKP) bekannt ist. An der Spitze dieses Prozesses stehen hämatopoetische Stammzellen, die in Kontakt mit der Knochenmarkumgebung (Zytokine, Transkriptionsfaktoren, hämatopoetische Nische) in der Lage sein werden, sich zu vermehren und sich zu hämatopoetischen Vorläufern (HP) zu differenzieren, die in der Lage sind, sich auf den megakaryozytären Weg zu begeben, was zu unreifen MKs^{führt 1}. Unter dem Einfluss verschiedener Zytokine, insbesondere Thrombopoieti....