Herstellung rekombinanter PRMT-Proteine unter Verwendung des Baculovirus Expression Vector System

Zusammenfassung

Das Baculovirus Expression Vector System (BEVS) ist eine robuste Plattform für das Expressionsscreening und die Produktion von Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs), die für biochemische, biophysikalische und strukturelle Studien verwendet werden sollen. Für die meisten PRMTs und andere Proteine von Interesse, die eine eukaryotische Expressionsplattform benötigen, können Milligrammmengen an Material produziert werden.

Zusammenfassung

Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs) Methylat-Arginin-Rückstände auf einer Vielzahl von Proteinen, die in zahlreichen zellulären Prozessen eine Rolle spielen. PRMTs können entweder Mono- oder Dimethylat-Arginin-Guanidino-Gruppen symmetrisch oder asymmetrisch anmuten. Die Enzymologie dieser Proteine ist ein komplexes und intensiv untersuchtes Gebiet, das Milligrammmengen an hochwertigem rekombinantem Protein benötigt. Das Baculovirus Expression Vector System (BEVS), das Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) und Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) Insektenzellen verwendet, wurde für das Expressionsscreening und die Produktion vieler PRMTs, einschließlich PRMT 1, 2 und 4 bis 9, verwendet. Um gleichzeitig nach der Expression mehrerer Konstrukte dieser Proteine zu suchen, einschließlich Domänen und abgeschnittenen Fragmenten sowie der Proteine in voller Länge, haben wir skalierbare Methoden mit einstellbaren und programmierbaren Mehrkanalpipetten in Kombination mit 24- und 96-Well-Platten und -Blöcken angewendet. Insgesamt ermöglichten diese Methodenanpassungen eine groß angelegte Erzeugung von Bacmid-DNA, rekombinanten Viren und Proteinexpressionsscreening. Die Verwendung von Kulturgefäßen mit einem hohen Füllvolumen an Sf9-Zellsuspension trug dazu bei, Platzbeschränkungen in der Produktionspipeline für die Großproteinproduktion in Einzelchargen zu überwinden. Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle zur effizienten und kostengünstigen Expression funktioneller PRMTs für biochemische, biophysikalische und strukturelle Studien.

Einleitung

Protein Argininmethyltransferasen (PRMTs) methylat arginin Rückstände in einer Monomethyl- oder symmetrischen/asymmetrischen Dimethyl-Weise. Die sich wiederholenden RG/RGG/GRG-Sequenzen werden von den meisten PRMTs sehr bevorzugt und kommen in einer Vielzahl von Proteinen^1,2vor. Argininmethylierte Proteine wie Histone oder Transkriptionsfaktoren und Spleißfaktoren regulieren Transkription, Spleißen und Chromatinstruktur^3,4. Das zunehmende Wissen über die vielfältige Regulation der Substrat- und Cofaktorverwertung, des Umsatzes und der Kinetik von PRMTs sowie die Erzeugung selektiver Inhibitoren haben mechanistisches Licht auf diese Enzyme und ihre Komplexe geworfen^5,6. Allerdings werden nicht alle PRMT-Familienmitglieder im gleichen Umfang untersucht; Beispielsweise wurde PRMT9 erst kürzlich als Mitglied der PRMT-Familie¹entdeckt. Struktur- und Enzymfunktionsstudien für diese Proteine erfordern ausreichende, oft Milligramm, Mengen an rekombinantem Protein, um verfügbar zu sein.

Das prokaryotische Expressionssystem Escherichia coli (E. coli) ist in der Regel die erste Wahl für das Expressionsscreening unter Verwendung mehrerer Konstrukte für ein bestimmtes Protein^7,8,9. Die E. coli-basierteExpression führt jedoch nicht immer zu ausreichenden Mengen an PRMT-Proteinen in ihren aktiven Formen, wie wir insbesondere für PRMT5 und PRMT7 festgestellt haben (siehe unten). So wurden PRMTs, die sich nicht in E. coli exprimierten oder von der eukaryotischen Expressionsmaschinerie produziert werden mussten, in Vektoren subkloniert, die für das Expressionsscreening im alternativen Baculovirus-Expressionsvektorsystem (BEVS) geeignet waren. Während E. coli-exprimierte Proben von PRMT1, PRMT3 und PRMT8 ausgiebig für In-vitro-Assays und Kristallographie verwendet wurden, erfordern andere PRMTs wie PRMT5, das einen MEP50-Bindungspartner seiner dualen Methyltransferase-Domäne erfordert, und PRMTs wie PRMT7 und 9 die Expression von Insektenzellen, um ausreichende Mengen an aktivem Protein zu erhalten. Insgesamt haben die standardisierten Mitteldurchsatz-Methyltransferase-Assays für PRMT4, 5, 6, 7 und 9 den BEVS in Insektenzellen⁶verwendet. Das Baculovirus Expression Vector System (BEVS) ist eine vielseitige Plattform zur Herstellung rekombinanter Proteine, die die eukaryotische Expressionsmaschinerie erfordern, die post translationale Modifikationen ermöglicht, die für biochemische, biophysikalische und strukturelle Studien unerlässlich sind^10,11,12. Mehrere BEVS sind seit der ersten berichteten Verwendung von Baculoviren im Jahr 1983 zur Proteinexpression kommerziell verfügbar geworden¹³. Die meisten dieser Protokolle verwenden unterschiedliche Strategien für die Übertragung des Expressionsplasmids in Insektenzellen. Dazu gehören Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK usw. Unser Protokoll basiert auf dem am häufigsten verwendeten System in BEVS, dem Bac-to-Bac-System¹⁴, das entwickelt wurde, um das Gen / cDNA, das für das interessierende Protein (POI, hier die PRMTs) kodiert, in das Baculovirus-Genom zu übertragen, das in einem spezialisierten Stamm von E. coli über eine ortsspezifische Transposition¹⁵aufrechterhalten wird.

Kurz gesagt, der Plasmidtransfervektor, der das interessierende Gen enthält, wurde in DH10Bac E. coli-kompetente Zellen umgewandelt, um rekombinante virale Bacmid-DNA zu erzeugen. Adhärente Sf9-Zellen wurden dann mit Bacmid-DNA transfiziert. Vier bis fünf Tage nach der Transfektion wurden die ersten rekombinanten Baculoviren, die in das Zellkulturmedium sezerniert wurden, wiederhergestellt und als P1-Virus markiert. Die P1-Baculovirus-Bestände wurden dann für die Virusamplifikation (d. h. die Erzeugung von P2-Baculovirus-Beständen) und das Proteinexpressionsscreening verwendet. Basierend auf den Expressionsscreening-Ergebnissen wurden P2-Viren für das beste Expressionskonstrukt des Proteins identifiziert und verwendet, um Suspensionskulturen von Baculovirus-infizierten Insektenzellen (SCBIIS) für die groß angelegte Proteinproduktion zu erzeugen. Hier beschreiben wir unsere detaillierten Protokolle und beschreiben die Gründe für unsere Reagenz- und Kulturgefäßentscheidungen, um unsere Strategie zu unterstützen, eine zeiteffizientere, kostengünstigere und skalierbarere Methodik zu entwickeln, um ausreichende Mengen an gewünschten rekombinanten Proteinen zu erhalten.

Protokoll

HINWEIS: Die Übersicht über die BEVS-Protokollschritte ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Erzeugung einer rekombinanten Bacmid-DNA

1. Herstellung von LB-Agar-selektiven Platten für die DH10Bac-Transformation
   1. Bereiten Sie LB-Agarplatten vor, die Folgendes enthalten: 50 μg/ml Kanamycin, 7 μg/ml Gentamicin, 10 μg/ml Tetracyclin, 200 μg/ml Bluo-gal und 40 μg/ml IPTG, um für DH10Bac-Transformantien auszuwählen.
   2. 25 g vorgemischte LB-Brühe und 13 g Bacto Agar wiegen und in einen 2-L-Kolben geben. Mit destilliertem Wasser und Autoklaven für 15-30 min bei 121 °C auf 1 L bringen.
   3. Stellen Sie ein Wasserbad auf 50 °C und kühlen Sie die autoklavierte Agarlösung im Wasserbad für 40-60 min ab, bis sie auf 50-55 °C abgekühlt ist.
   4. Zur abgekühlten Lösung gentamicin zu einer Endkonzentration von 7 μg/ml, Kanamycin zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml, Tetracyclin zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml, Bluo-gal zu einer Endkonzentration von 200 μg/ml und IPTG zu einer Endkonzentration von 40 μg/ml.
   5. Mischen Sie die Agarlösung und aliquot 7-10 mL des Mediums auf jede 60 mm Platte mit einer 50 mL Pipette. Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur (2 h) stehen, um auszuhärten. Invertieren, umwickeln und bei 4 °C lagern. Platten, die Antibiotika enthalten, sind bis zu 4 Wochen stabil.
2. Umwandlung des Plasmids in DH10Bac E. coli kompetente Zellen
   1. Berechnen Sie das erforderliche Volumen an kompetenten Zellen.
   2. Kompetente Zellen auf Eis auftauen, sanft herunterdrehen und durch sanftes Klopfen wieder kehren.
   3. Verwenden Sie eine 12-Kanal-Pipette, um 4 μL der Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-PCR-Platte zu dosieren.
   4. Fügen Sie ~ 0,3-0,5 μg rekombinante Plasmid-DNA zu den zuständigen Zellen hinzu und mischen Sie sie vorsichtig durch Klopfen. Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für 10-15 min.
   5. Hitzeschock das Gemisch in einer PCR-Maschine bei 42 °C für 45 s. Auf Eis 2 min kühlen.
   6. Geben Sie 0,5 ml SOC-Medium in jede Vertiefung der 96-Well-Blöcke (96-tiefe Vertiefung 2,4 ml).
   7. Verwenden Sie eine 12-Kanal-Pipette, um die umgewandelte Bakteriensuspension in die entsprechende Vertiefung des Blocks zu übertragen und mit einer Luftporenfolie abzudecken.
   8. Legen Sie den Block in einen Schüttelbrutschrank bei 37 °C bei mittlerer Bewegung (205 U/min) für 4-5 h.
   9. Verteilen Sie 30-50 μL der Kultur gleichmäßig über die Oberfläche der LB-Agarplatte mit sterilen Glasperlen. Den Rest der Kultur bei 4 °C lagern.
   10. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C, bis die Farbe der blau-weißen Kolonien erkennbar ist (40-48 h). Verwerfen Sie die Kultur, wenn genügend weiße, große Kolonien auf dem Teller erhalten sind.
   11. Um sicherzustellen, dass weiße Kolonien nur rekombinante Bacmid-DNA enthalten, streifen Sie eine isolierte weiße Kolonie auf frische LB-Agarplatten mit Antibiotika, Bluo-Gal und IPTG, um den Phänotyp zu überprüfen.
   12. 48 h bei 37 °C inkubieren.
   13. Wählen Sie eine verifizierte weiße Kolonie aus einer re-gestreiften Platte für die Extraktion von rekombinanter Bacmid-DNA.
3. Rekombinante Bacmid-DNA isolieren
   1. Impfen Sie eine einzelne, isolierte weiße Kolonie in 3 ml LB-Medium, ergänzt mit 50 μg / ml Kanamycin, 7 μg / ml Gentamicin und 10 μg / ml Tetracyclin in 24-Well-Blöcken (24-Well-Blöcke runder Boden) und bedecken Sie sie mit einer Airpore-Platte.
   2. Wachsen Sie bei 37 °C über Nacht mit Schütteln bei 250 U /min.
   3. Zentrifuge die 24-Well-Blöcke bei 2.100 x g für 10 min. Dekantieren Sie den Überstand, kehren Sie den Block um und klopfen Sie vorsichtig auf ein saugfähiges Seidenpapier. 250 μL Lösung 1 (Zellreuspensionslösung) werden in jede Vertiefung geben.
   4. Versiegeln Sie die Blöcke mit Klebebandpads oder anderen Dichtungsfolien und legen Sie sie für 5-10 min bei 75 U/min auf eine Schüttelplattform. Überprüfen Sie jede Vertiefung, um eine ordnungsgemäße Zelllyse sicherzustellen, und resuspendieren Sie sie gegebenenfalls mit einer 1 ml Spitze.
   5. 250 μL Lösung 2 (Zelllyselösung) in jede Vertiefung geben, die Blöcke versiegeln und für 30 s bei 75 U/min auf eine Schüttelplattform legen (um eine Kreuzkontamination der Proben zu vermeiden, 24-Well-Blöcke nicht invertieren) und 4 Min. bei Raumtemperatur inkubieren.
   6. Fügen Sie 250 μL Lösung 3 (Neutralisationslösung) hinzu, versiegeln Sie die Blöcke und legen Sie sie bei 75 U / min für 30 s auf die Schüttelplattform. Es bildet sich ein dicker weißer Niederschlag aus Protein und E. coli genomischer DNA. Legen Sie die Probe für 10-15 Minuten auf Eis.
   7. Zentrifuge für 60 min bei 2.100 x g bei 4 °C, um das weiße Niederschlagsmaterial fest zu pelletieren. Beschriften Sie während der Zentrifugation ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 0,8 ml absolutes Isopropanol hinzu.
   8. Übertragen Sie den Überstand vorsichtig in das Rohr, das Isopropanol enthält, und vermeiden Sie weißes Niederschlagsmaterial. Mischen Sie, indem Sie das Röhrchen einige Male vorsichtig umkehren und dann für 5 bis 10 minuten auf Eis legen. In diesem Stadium kann die Probe über Nacht bei -20 °C gelagert werden.
   9. Zentrifuge die Probe für 15 min bei 14.000 x g bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 0,5 ml 70% Ethanol zu jedem Röhrchen hinzu. Kehren Sie das Röhrchen mehrmals um, um das Pellet zu waschen. Zentrifuge für 5 min bei 14.000 x g bei Raumtemperatur. (Optional: Waschen wiederholen)
   10. Bringen Sie Proben in die Laminar-Flow-Haube, um die Sterilität des Plasmidpräparats sicherzustellen, und entfernen Sie so viel wie möglich vom Überstand.
       HINWEIS: Das Pellet kann sich vom Boden des Rohres entfernen, also achten Sie sorgfältig darauf, dass das Pellet beim Entsorgen des Überstands verwirft wird.
   11. Trocknen Sie das Pellet in der Laminar-Flow-Haube für 15 - 20 min an der Luft und lösen Sie die DNA in 50 μL gefilterten Elutionspuffer, 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 auf (achten Sie darauf, dass die Pellets nicht übertrocknet sind).
   12. Da rekombinante Bacmid-DNA größer als 135 kb ist, lösen Sie das Pellet durch sanftes Klopfen auf, um ein Scheren der DNA zu vermeiden.
   13. Um das Vorhandensein des interessierenden Gens in bacmid DNA zu überprüfen, richten Sie die PCR-Reaktionsmischung in einer 96-Well-PCR-Platte ein.
   14. Die PCR-Mischung wird wie folgt hergestellt: 1 μL Puffer, 0,2 μL (je 10 mM) dNTPs, 0,1 μL Taq-DNA-Polymerase, 0,1 μL (25 μM) Vorwärts- und Rückwärtsprimer (BACV2FWD: Tattccggattattcataccg; BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggc), 1 μL Bacmid-DNA und 8 μL Wasser.
   15. Amplifikation der Zielgene mit anfänglicher Denaturierung für 2 min bei 95 °C, gefolgt von 25 Zyklen von 94 °C für 30 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 1 min/kb.
   16. Beenden Sie die Reaktion nach einer abschließenden Verlängerung für 7 min bei 72 °C.
   17. Analysieren Sie 10 μL des Amplifikationsprodukts auf 1% (w/v) Agarosegel, das Nukleinsäure färbende Lösung enthält, durch Elektrophorese.
   18. Lagern Sie die verifizierten Bacmid-DNAs bei 4 °C.

2. Erzeugung rekombinanter Baculovirus-Bestände

HINWEIS: Verwenden Sie exponentiell wachsende Sf9-Zellen mit einer Lebensfähigkeit von 95% oder mehr für jeden Schritt des Baculovirus-Expressionsprotokolls, einschließlich Zelltransfektion für die Baculovirus-Generierung, Baculovirus-Volumenamplifikation, Proteinexpressionsscreening und Proteinproduktion.

1. Transfektion von Sf9-Zellen mit Bacmid-DNA und Transfektionsreagenzien (T.R.) wie JetPrime oder X-tremeGENE 9.
   HINWEIS: Trypan Blue-Färbung und ein Hämozytometer können verwendet werden, um lebensfähige Zellzahlen und % Zelllebensfähigkeit zu bestimmen. Nicht lebensfähige Zellen nehmen den Fleck auf und erscheinen unter dem Mikroskop blau, während lebensfähige Zellen ungefärbt bleiben. Um die zelllebensfähigkeit in % zu berechnen, wird eine Gesamtzellzahl (ungefärbt und gefärbt) erhalten und die lebensfähige Zellzahl wird durch die Gesamtzellzahl dividiert und mit 100 multipliziert.
   1. Die exponentiell wachsenden Sf9-Zellen werden in serumfreien Insektenmedien auf eine endgültige Zelldichte von 4 x^{10 5} Zellen/ml verdünnt und in das sterile Reagenzreservoir gegossen.
   2. Verwenden Sie eine programmierbare Mehrkanalpipette, um 0,5 ml der verdünnten Sf9-Zellen in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte zu säen.
   3. Kennzeichnen Sie eine Vertiefung der Platte als Kontrolle (nicht transfiziert) und verwenden Sie sie als Kontrolle, um die transfizierten und nicht transfizierten Zellen zu vergleichen, um mögliche Anzeichen von Infektionen zu beurteilen.
   4. Nachdem Sie die Zellen in die Platten eingesät haben, schaukeln Sie die Platten mehrmals vorsichtig hin und her, um eine gleichmäßige Monoschicht von Zellen zu gewährleisten. Wirbeln Sie die Platten nicht, da sich die Zellen in der Mitte des Brunnens anhäufen.
   5. Inkubieren Sie die Platten bei 27 °C für mindestens 1 h, um die Zellbefestigung an den Kulturplatten zu ermöglichen.
   6. Mischen Sie die Durchstechflasche mit dem Transfektionsreagenz gut. Für jede Transfektion werden 2 μL des Transfektionsreagenz auf 100 μL des Transfektionspuffers addiert. Jedes andere unergäntliche Insektenmedium kann ebenfalls verwendet werden. Das verdünnte Transfektionsreagenz in einem sterilen Reagenzreservoir abscheiden und 10 s vorsichtig mischen.
   7. Übertragen Sie mit einer 12-Kanal-Pipette 102 μL des verdünnten Transfektionsreagenz in eine sterile 96-Mikrowell-Platte.
   8. 10 μL einer 0,2 μg/μL-Lösung rekombinanter Bacmid-DNA in die entsprechende Vertiefung einer 96-Well-Mikrowellplatte geben und durch sanftes Schütteln (Klopfen) der Platte von den Seiten mischen.
   9. Inkubieren Sie die Transfektionsmischung für 15-20 minuten, um die Komplexbildung zu ermöglichen.
   10. Mit einer einstellbaren 6-Kanal-Pipette, die für den Transfer zwischen 96- und 24-Well-Platten ausgelegt ist, fügen Sie die Transfektionsmischung auf die Zellen tropfenweise in entsprechende Vertiefungen von Transfektionsplatten ein und inkubieren Sie für 4-5 h bei 27 °C.
   11. Schaukeln Sie die Platten während der Inkubationszeit mehrmals vorsichtig hin und her, um eine gleichmäßige Verteilung der Transfektionsmischung über die Zellmonoschicht zu gewährleisten.
   12. 4-5 h nach der Transfektion 1,5 ml insektenserumfreies Medium, ergänzt mit 10% (v/v) Endwärme inaktiviertem fetalem Rinderserum und Antibiotikum-Antimykotikum, zu 1% (v/v) Endvolumen (100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) hinzufügen.
   13. Inkubieren Sie die Zellen in einem 27 °C Inkubator für 72-96 h. Schaufeln Sie die Transfektionsplatten nach Möglichkeit einmal täglich vorsichtig.
   14. Suchen Sie nach Anzeichen einer Infektion (SOI), die in transfizierten Zellen nach 72-96 h nach der Transfektion sichtbar sind (Abbildung 2). Denken Sie daran, dass die transfizierten Zellen beginnen, das Virus zu produzieren und die Kultur weiter zu infizieren. Suchen Sie daher nach anzeichen einer Infektion.
       HINWEIS: Anzeichen einer Infektion sind strukturelle Veränderungen in den Insektenzellen, wie eine 25-50% ige Zunahme des Zelldurchmessers, vergrößerte Zellkerne, gleichmäßig abgerundete Form, Verlust der Proliferation und Adhärenz an der Oberfläche der Kulturschale sowie eine Abnahme der Zelllebensfähigkeit (Abbildung 2. B. Baculovirus-infizierte und nicht infizierte Sf9-Zellen).

3. Kleines Proteinexpressionsscreening und Virusamplifikation

1. Infektion von Sf9-Zellen mit P1-Baculovirus-Beständen.
   HINWEIS: 4-5 Tage nach der Transfektion sollten Anzeichen einer Infektion in den transfizierten Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen (nicht transfiziert) unter einem invertierten Mikroskop sichtbar sein. Die anfänglichen rekombinanten Baculoviren, die in das Zellkulturmedium ausgeschieden werden, sollten zur Sammlung bereit sein.
   1. Samen Sie 2 x^{10 5} exponentiell wachsende Sf9-Zellen in serumfreien Insektenmedien in jede Vertiefung der 24-Well-Platten in einem Gesamtvolumen von 2 ml zur Infektion mit P1-Viren zur Verstärkung des Virusvolumens (was zur Erzeugung der P2-Viren führt).
   2. Nachdem Sie die Zellen in die Platten pipettiert haben, schaukeln Sie die Platten vorsichtig ab und sorgen Sie mit einer Hin- und Herbewegung für eine gleichmäßige Monoschicht. Wirbeln Sie die Platten nicht, da sich die Zellen in der Mitte des Brunnens anhäufen.
   3. Inkubieren Sie die Platten bei 27 °C für mindestens 1 h, um eine zelluläre Haftung an der Platte zu ermöglichen.
   4. 4 ml Sf9-Zellen mit einer Dichte von 3,5-4 x 10⁶ in insektenserumfreiem Medium in jede Vertiefung von 24-Well-Blöcken geben, um sie mit P1-Viren für das Proteinexpressionsscreening zu infizieren.
      HINWEIS: Kennzeichnen Sie eine Vertiefung der 24-Well-Platten und 24-Well-Blöcke als Kontrolle und verwenden Sie sie als nicht infizierte Kontrolle zum Vergleich von infizierten und nicht infizierten Zellen bei der Suche nach SOI.
   5. Verwenden Sie einen programmierbaren elektronischen Mehrkanal, um die gleichzeitige Sammlung von P1-Viren (Schritt 2.1.13), die Infektion von frisch ausgesäten Sf9-Zellen (Schritt 3.1.1) und die Infektion der Suspensionszellen in den 24-Well-Blöcken (Schritt 3.1.4) mit 150 μL P1-Viren zu ermöglichen.
   6. Den Rest der gesammelten P1-Virusbestände für 15 min bei 17.970 x gherunterspinnen, in Mikrozentrifugenröhrchen überführen und im Dunkeln bei 4 °C lagern.
   7. Die 24-Well-Platten (Schritt 3.1.1) vorsichtig auf einem Hubschütter schaukeln, um eine gleichmäßige Verteilung der zugesetzten P1-Viren über die Zellmonoschicht zu gewährleisten; Wiederholen Sie dies einige Male während der Inkubationszeit.
   8. Decken Sie die 24-Well-Blöcke mit der Suspensionskultur infizierter Sf9-Zellen (Schritt 3.1.4) mit einer Airpore-Folie ab.
   9. Inkubieren Sie die 24-Well-Blöcke bei 27 °C und schütteln Sie sie bei 245 U / min für 72-96 h.
   10. Suchen Sie innerhalb von 72-96 h nach der Infektionszeit in den 24-Well-Platten mit P2-Viren (Schritt 3.1.1) und in den 24-Well-Blöcken (Schritt 3.1.4) mit infizierten Zellen nach SOI für das Expressionsscreening.
       HINWEIS: 4-5 Tage nach der Infektion von Sf9-Zellen mit P1-Viren sollte SOI in den infizierten Zellen im Vergleich zu den nicht infizierten Kontrollzellen unter einem invertierten Mikroskop offensichtlich sein.
   11. P2-Viren von 24-Well-Platten sammeln, 15 min bei 17.970 x gzentrifugieren, in Mikrozentrifugenröhrchen überführen und im Dunkeln bei 4 °C lagern.
   12. Nach 72-96 h nach der Infektion die 24-Well-Blöcke mit 70% Ethanol besprühen, in die Laminar-Flow-Haube bringen und die Zelldichte und Lebensfähigkeit in einigen Vertiefungen durch Trypan Blue-Färbung überprüfen.
   13. Fahren Sie mit der Proteinreinigung fort, wenn die Zellen Anzeichen einer Infektion aufweisen und die Lebensfähigkeit nahe bei 70-75% liegt, wie durch Trypan Blue-Färbung beurteilt.
   14. Pelletieren Sie die Zellen, indem Sie die 24-Well-Blöcke bei 525 x g bei 4 °C für 15 min zentrifugieren. Den Überstand entsorgen und die Pellets in 1 ml Lysepuffer, umfassend 25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,6 % NP-40, 2 mM Imidazol, 5% Glycerin (v/v) und 1x Proteasehemmercocktail (100x Proteaseinhibitorcocktail enthält Aprotinin 0,25 mg/ml, Leupeptin 0,25 mg/ml, Pepstatin A 0,25 mg/ml; E-64 0,25 mg/ml).
   15. Lagern Sie die Zellsuspension bei -80 °C für die anschließende Testreinigung (siehe 3.2.2).
2. Proteinreinigung aus gefrorener Zellsuspension in 24-Well-Testexpressionsblöcken.
   1. Montage des Bindungsblocks (Abbildung 3).
      1. Legen Sie 3 überlappende Schichten Parafilm auf die Oberseite des 96-tiefen Brunnenblocks (96-tiefe Vertiefung 2,4 ml).
      2. Legen Sie eine 96-Well-Filterplatte (Filtermikroplatte, 96-Well, Polypropylen mit 25 μm ultrahochmolekularer Polyethylenmembran) auf die Oberseite des 96-tiefen Well-Blocks.
      3. Drücken Sie die Filterplatte nach unten, um die Spitzen in der Parafolie zu befestigen, um die Filterplatte vom 96-Well-Tiefenblock abzudichten.
      4. 50 μL vorgleiche 50% Ni-NTA-Harzaufschlämmung in jede Vertiefung der Filterplatte geben.
   2. Testausdrucksverfahren
      1. Legen Sie die gefrorene Zellsuspension (Schritt 3.1.15), die in 24-Well-Blöcken vorhanden ist, für 5-10 min in ein Wasserbad bei RT und schütteln Sie sie dann bei 450 U / min für 20 min.
      2. Zentrifuge die 24-Well-Blöcke bei 3.275 x g für 15 min.
      3. Die geklärten Lysate werden mit einer Mehrkanalpipette in eine Filterplatte mit 50 μL vorgleicher 50%iger Ni-NTA-Harzaufschlämmung (Schritt 3.2.1.4) überführen und die Filterplatte mit einer 96-Well-Kappenmatte (96-Well-Cap-Matte, zur Verwendung mit Quadratischem Bohrplatz, 2 ml) versiegelt.
         HINWEIS: Verwenden Sie einige Gummibänder, um den Bindungsblock während der Inkubations- und Zentrifugationsschritte zusammenzuhalten.
      4. Legen Sie den gesicherten Bindeblock für 45-60 min in einen Rotator in einem Kühlraum, um gereinigte Lysate mit Ni-NTA-Harz zu inkubieren.
      5. Heben Sie nach der Inkubation vorsichtig die Filterplatte an und entfernen Sie die Parafilmschicht von der Oberfläche des 96-tiefen Brunnenblocks (Schritt 3.2.1.1).
      6. Legen Sie die Filterplatte wieder auf den 96-tiefen Brunnenblock und drehen Sie den gesicherten Bindungsblock für 2 min bei 235 x gherunter.
      7. Waschbindung Ni-NTA-Harz 2x mit 2 mL Waschpuffer bestehend aus 25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 5% Glycerin und 15 mM Imidazol.
      8. Drehen Sie den Block mit Waschpuffer jedes Mal für 5 min bei 235 x g herunter, um eine vollständige Entfernung der Restflüssigkeit zu gewährleisten.
      9. Übertragen Sie die Filterplatte auf die Oberseite der 96-Well-PCR-Platte, die 10 μL 4x Ladefarbstoff enthält.
      10. 40 μL Elutionspuffer (25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 5% Glycerin, 500 mM Imidazol) in jede Vertiefung der Filterplatte geben und 5 min inkubieren.
      11. Drehen Sie den Block herunter, um Proteine in die 96-Well-PCR-Platte bei 235 x g für 10 min zu eluieren.
      12. Versiegeln Sie die 96-Well-PCR-Platte mit hochtemperaturbeständigem Tap-Pad und Hitze bei 98 °C für 3 min.
      13. Laden Sie 15 μL eluierte Proteinproben in Standard-Laemmli-Puffer auf 4-20% SDS-PAGE-Gel neben der Proteinleiter und führen Sie das Gel mit einem Standard-Laufpuffer aus, der SDS enthält.
      14. Das Gel mit Coomassie blau färben und mit Wasser entfärben. Analysieren Sie die Ergebnisse des Testausdrucks, um die besten Expressierungskonstrukte für die Großproduktion zu identifizieren.

4. Zubereitungen der mit dem Baculovirus infizierten Insektenzellen (SCBIIC) zur Proteinproduktion

1. 4 Tage vor der geplanten Produktionszeit exponentiell wachsende Sf9-Zellen auf eine endgültige Zelldichte von 2 x 10⁶ Zellen / ml in 125 ml / 250 ml / 500 ml Erlenmeyerglas-Schüttelkolben mit Schallwänden in 50 ml / 100 ml / 200 ml Insektenserum-freiem Medium mit 1% (v / v) endgültigem Antibiotikum-Antimykotika aufteilen.
2. Fügen Sie 0,150 ml / 0,300 ml / 0,6 ml geeigneter P2-Viren hinzu, inkubieren Sie infizierte Zellen bei 165 U / min auf einem Orbitalschüttler mit einem Ein-Zoll-Hub und bei einer niedrigeren Temperatur von 25 ° C, um die Zellteilung zu verlangsamen.
3. Überprüfen Sie die Zellen 4 Tage nach der Infektion unter einem Mikroskop auf SOI und fahren Sie mit der Produktion fort, wenn die Zelllebensfähigkeit, die mit trypan Blue-Färbung nachgewiesen wurde, nahe bei 70-75% liegt.

5. Sf9-Zellpräparate für die Proteinproduktion in großem Maßstab

1. Berechnen Sie 4 Tage vor der geplanten Produktionszeit das erforderliche Volumen an Sf9-Zellen für die Proteinproduktion in großem Maßstab.
2. Samen Sie 2 L exponentiell wachsende Sf9-Zellen in Insektenserum-freiem Medium bis zu einer Zelldichte von 1 x 10⁶ Zellen/ml in 2,8 L Fernbach-Schüttelkolben.
3. Inkubationskolben bei 27 °C mit Schütteln bei 150 U/min eingestellt.
   HINWEIS: Um eine bakterielle Kontamination in der Sf9-Zellkultur zu verhindern, verwenden Sie Gentamicin bis zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml oder Penicillin/Streptomycin bis 50 U/ml bzw. 50 μg/ml.

6. Infektion der Sf9-Zellen mit SCBIIS für die großtechnische Proteinproduktion

1. 2 L oder 4 L exponentiell wachsende Sf9-Zellen in Insektenserum-freiem Medium auf eine endgültige Zelldichte von 4 x 10⁶ Zellen/ml in 2,5 L Tunair Shake-Kolben oder 5 L Reagenzflaschen aufteilen.
2. Fügen Sie 10-12 ml / L der Baculovirus-infizierten Insektenzell (SCBIIC) Suspensionskultur hinzu.
3. Inkubieren Sie die infizierte Kultur von Sf9-Zellen auf einem Shaker mit 145 U / min bei der niedrigeren Temperatur von 25 ° C (um die Zellteilung zu verlangsamen) für 72-96 h.
4. Überprüfen Sie die Zellen nach 72 Stunden nach der Infektion unter einem Mikroskop auf SOI und beurteilen Sie die Zelllebensfähigkeit.
5. Normalerweise sinkt die Lebensfähigkeit der Sf9-Zellen nach etwa 72 Stunden nach der Infektion auf 70% -75% (gemessen mit Trypan Blue-Fleck). Ernte infizierte Sf9-Zellen in einer 1 L Polypropylenflasche durch Zentrifugation bei 900 x g für 15 min bei 4 °C.
6. Resuspend das zellpellets gesammelt aus 1 L der Produktionszellkultur mit 20-25 mL 1x PBS durch sanftes Verwirbeln und Übertragen in 50 mL konische Röhrchen.
7. Drehen Sie die Zellsuspension bei 900 x g für 15 minuten herunter und entsorgen Sie die PBS-Lösung.
8. Das gewaschene Zellpellet mit 20-25 ml des Suspensionspuffers (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 5% Glycerin, 1x Protease-Inhibitor-Cocktail) wieder aufschnutzen und in flüssigem Stickstoff einfrieren; bis zur Reinigung bei −80 °C lagern.
   HINWEIS: Die Reinigungsverfahren für die PRMTs wurden in dem von SGC veröffentlichten Papier⁶ausführlich beschrieben.

Ergebnisse

Eine Übersicht über das BEVS-Protokoll finden Sie in Abbildung 1. Mehrere Expressionskonstrukte von PRMTs, einschließlich Domänen in voller Länge und abgeschnittener Fragmente, wurden am Structural Genomics Consortium (SGC, Toronto) nach internen Strategien generiert, um die Erfolgsrate für die Identifizierung löslicher und stabiler Proteine mit einem relativ hohen Expressionsniveau zu erhöhen^7,9. Interessierte Leser werden ermutigt, die Definitionen und die Methodik des SGC für die Gestaltung eines "Fragments" als Segment der Gensequenz, das in einen Expressionsklon integriert ist, "Domäne" als PFAM-annotierte Strukturdomäne und "Konstrukt" als das in einem Expressionsvektor geklonte Fragment zu überprüfen, die alle in einer früheren Veröffentlichung ausführlich beschrieben wurden⁷. Expressionskonstrukte von PRMTs, die in diesem Protokoll vorgestellt werden, sind für die Produktion der polyhistidin-markierten Proteine, die in den pFBOH-MHL-Vektor geklont werden, der ein Derivat des pFastBac1-Vektors ist. In Abbildung 4zeigen wir die SDS-PAGE-Analyse der his-markierten löslichen Konstrukte von PRMT1, 2, 4-9, die aus Pellets gereinigt wurden, die nach 4 ml Produktion in Sf9-Zellen gesammelt wurden (Schritt 3.1.4). Full-Length (FL) PRMT1 und PRMT9 werden in diesem Gel nicht präsentiert, da FL PRMT1 aus E. colihergestellt wurde und FL PRMT9 aus BEVS durch Flag-Tag⁶gereinigt wurde. Die abgeschnittenen Konstrukte von PRMT1, FL PRMT4 und allen PRMT8-Konstrukten zeigen eine relativ hohe Ausbeute, aber Proteinelfuate enthalten Fraktionen von co-gereinigten Verunreinigungen. Diese Konstrukte erfordern eine weitere Optimierung der Reinigungsprotokolle. Daher sind zusätzliche Ansätze erforderlich, um die Reinheit dieser Proteine aus Scale-up-Produktionen zu verbessern, wie z.B. eine Verringerung der Menge an Nickelperlen im Stadium der Inkubation mit einem geklärten Lysat; eine Erhöhung der Imidazolkonzentrationen in den Waschpuffern; Spaltung des His-Tags mit TEV-Protease, gefolgt von der Anwendung auf einem Ni-affinen Harz; und zusätzliche Reinigungsschritte wie Größenausschluss und Ionenaustauschchromatographie. Die Konstrukte von PRMT2 zeigen im Vergleich zu anderen Proteinen und PRMT2-Proteinen in voller Länge, begleitet von einem starken Schadstoffband, eine signifikant geringere Ausbeute. Die Scale-up-Produktion und zwei Reinigungsschritte wie IMAC und Größenausschluss bestätigten ein niedriges Expressionsniveau für dieses Konstrukt zusammen mit dem anhaltenden Vorhandensein des co-reinigenden Schadstoffs für das FL-Protein. Für den PRMT5-Komplex wurden reine Proteine gewonnen, die mit seinem obligaten Bindungspartner MEP50 hergestellt und gereinigt wurden. Das abgeschnittene Konstrukt von PRMT9 hat im Vergleich zu anderen PRMTs ein fast zwei- oder dreifach niedrigeres Expressionsniveau von fast 1,5 mg / L. Dennoch wurden die rekombinanten Virusbestände dieses Konstrukts für die Scale-up-Produktion verwendet, beugende Kristalle wurden erhalten und die Struktur wurde für dieses Protein zusammen mit PRMT4, 6 und 7 gelöst (Abbildung 5).

Für die Scale-up-Produktionen wurden die entsprechenden P2-Viren verwendet, um die Suspensionskultur von Sf9-Insektenzellen zu infizieren. Dieser Schritt erzeugt 50/100/200 ml Baculovirus-infizierte Zellen, die infizierte Zellen und P3-Viren im Überstand enthalten. Für die großtechnische Proteinproduktion wurden 2 L Sf9-Zellen in jeweils 2,8 L Fernbach-Schüttelkolben bei 150 U/min, 27 °C kultiviert(Abbildung 6). Am Tag der Produktion wurden 2 l Sf9-Zellen (Zelllebensfähigkeit > 97%) in 2,5 L Tunair Schüttelkolben oder 4 L in 5 L Reagenzflaschen wurden auf eine Zelldichte von 4 x 10^6/mlverdünnt. Diese Zellen wurden direkt mit 10-12 ml/L Suspensionskultur von Baculovirus-infizierten Insektenzellen infiziert und bei einer niedrigeren Temperatur von 25 °C bei 145 U/min inkubiert. Die direkte Infektion der Produktionscharge mit einer Suspensionskultur von Baculovirus-infizierten Insektenzellen reduzierte die mühsamen und zeitaufwändigen Schritte bei der Virusvolumenamplifikation signifikant, ohne die zusätzliche Handhabung der infizierten Zellen, und vermied eine Verringerung des Titer- und Virusabbaus. SF9-Zellkulturpflege und Scale-up-Produktion wurden in den Kulturgefäßen mit einem hohen Füllvolumen durchgeführt, um eine groß angelegte Proteinproduktion in der einen Charge zu übernehmen (Abbildung 6).

PRMT 4, 5 (im Komplex mit MEP50), 6, 7 und 9 Proteinen in voller Länge, die aus der Baculovirus-vermittelten Produktionsplattform hergestellt wurden, wurden für die kinetische Charakterisierung und das Inhibitor-Compound-Screening am SGC⁶verwendet. Kristallstrukturen wurden gelöst und in der Protein Data Bank (PDB) für die vollständigen oder abgeschnittenen Formen der Proteine PRMT 4, 6, 7 und 9 mit verschiedenen chemischen Sonden und Inhibitoren abgelagert. Expressionsplasmide für diese PRMTs wurden im Addgene-Plasmid-Repository deponiert (Addgene ist ein Vertriebspartner des SGC, https://www.addgene.org/) und stehen der Forschungsgemeinschaft zur Verfügung (Abbildung 5).

Abbildung 1: Schematische Übersicht der Schritte des Baculovirus-Expressionsprozesses Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Baculovirus-infizierte und nicht infizierte Sf9-Zellen. Anzeichen einer Infektion sind strukturelle Veränderungen in den Insektenzellen, wie eine 25-50% ige Zunahme des Zelldurchmessers, vergrößerte Zellkerne, gleichmäßig abgerundete Form, Verlust der Proliferation und Adhärenz an der Oberfläche der Kulturschale sowie eine Abnahme der Zelllebensfähigkeit. Weißer Maßstab Balken 200 μm. Die hier dargestellten Anzeichen einer Infektion sind für die transfizierten Zellen, die beide Transfektionsreagenzien, JetPrime und X-tremeGene 9, verwenden, gleich. Das gezeigte Beispiel ist für das JetPrime-Transfektionsreagenz. (A) Nicht infizierte Sf9-Zellen als Kontrolle. B)Mit dem Baculovirus infizierte Sf9-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Bindeplattenanordnung zur schnellen Aufreinigung von Testexpressionsproteinen. Bitte beachten Sie den Text für Details, Schritte 3.2.1-2 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Ergebnisse des Proteinexpressions-Screenings. Proteinexpressionsscreening-Ergebnisse der Baculovirus-vermittelten Proteinproduktion in 4 ml Sf9-Suspensionskultur, die mit entsprechenden P1-rekombinanten Viren für verschiedene PRMTs und den PRMT5-MEP50-Komplex infiziert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Zusammenfassung der Expressionskonstrukte für PRMT4, 6, 7 und 9, die für Kristallstrukturstudien am Structural Genomics Consortium, Toronto (SGC) verwendet werden. Die Kristallstrukturen wurden gelöst und in der Protein Data Bank (PDB) für die volle Länge oder abgeschnittene Formen der Proteine PRMT 4, 6, 7 und 9 mit verschiedenen chemischen Sonden und Inhibitoren abgelagert. Expressionsplasmide für diese PRMTs wurden im Addgene-Plasmid-Repository deponiert und stehen der Forschungsgemeinschaft zur Verfügung (Addgene ist ein Vertriebspartner des SGC, https://www.addgene.org/). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Sf9 Insektenzellerhaltung und Proteinproduktion in den verschiedenen Kulturgefäßen: (A) 2,8 L Fernbachkolben für Zellerhaltung und Proteinproduktion. Durch den Einsatz des 72%igen Füllvolumens erhöht sich die Durchsatzrate um das 2,5-fache in einer Schüttelplattform. (B) Tunair-Schüttelkolben (nur 9 von 10 Kolben sind in diesem Bild dargestellt) und Reagenzflaschen mit einem Füllvolumen von 80 % erhöhen die Produktionskapazität der Schüttelplattform drastisch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Einer der Vorteile von BEVS in Insektenzellen enthält die Fähigkeit der post-translationalen Modifikationsmaschinerie, komplexere Modifikationen wie Phosphorylierung, Myristoylierung und Glykosylierung zu ermöglichen. Zusammen mit der hocheffizienten Faltung von Säugetierproteinen ermöglichen diese Modifikationen hohe Mengen an modifiziertem und gefaltetem Protein, das für physiologisch relevante nachgeschaltete Experimente geeignet^{ist 16}.

Hier beschrieben wir detaillierte Protokolle des BEVS, die kritische Elemente für ein erfolgreiches Expressionsscreening mehrerer Konstrukte von PRMT-Proteinen und die großräumige PRMT-Proteinproduktion in der Baculovirus-Expressionsplattform hervorheben: 1) Die Verwendung regelmäßiger, einstellbarer und programmierbarer Mehrkanalpipetten, um die biologischen Materialien zwischen 24- und 96 -well-Zellkulturplatten und -blöcken in den Stadien der Bacmid-DNA- und Virusgenerierung zu übertragen; eine Sammlung der rekombinanten Viren, Amplifikation der Virusvolumina der rekombinanten Viren und Herstellung der Proteinexpressions-Screening-Blöcke. 2) Leistungsstarke und kostengünstige Transfektionsreagenzien zur Erzeugung rekombinanter Viren. 3) Suspensionskultur von Baculovirus-infizierten Insektenzellen (SCBIIC) für die proteinbasierte Produktion in großem Maßstab. 4) Verwendung von 2,8 L Fernbach-Schüttelkolben mit hohem Füllvolumen zur Aufrechterhaltung der Sf9-Suspensionskultur und 2,5-L-Tunair-Schüttelkolben und 5-L-Reagenzflaschen für die proteingroße Proteinproduktion.

Besondere Überlegungen und Begründungen für die Transformations- und Transfektionsschritte.
Obwohl ein kommerzielles Protokoll die Verwendung von 100 μL kompetenter Zellen für eine Transformation¹⁴empfiehlt, beträgt die Umwandlungseffizienz kommerzieller DH10Bac E. coli-kompetenter Zellen so hoch wie 1 x^{10 8} KBE / μg DNA, so dass wir nur 4 μL verwenden. Dies reicht für jedes Transformant aus, um isolierte weiße rekombinante Kolonien für die Bacmid-DNA-Isolierung zu erhalten. Adhärente Sf9-Zellen in der 24-Well-Transfektionsplatte wurden mit einer Zelldichte von 2 x 10⁵ /ml in 0,5 ml serumfreier Insektenmedien ausgesät. Dieses Volumen reicht aus, um eine gleichmäßige Abdeckung der Arbeitsfläche des Brunnens zu gewährleisten. Gleichzeitig verdünnt es die Transfektionsmischung nicht zu sehr, was die Transfektionseffizienz erhöht. Transfektionsreagenzien sind für die Sf9-Zellen ungiftig, und ein Medienaustausch ist nicht erforderlich. Anstelle eines Medienwechsels werden zusätzliche 1,5 ml Medien mit 10% (v / v) FBS 4-5 Stunden nach der Transfektionszeit in die Transfektionsplatte eingelegt, um das Zellwachstum zu erleichtern. Die Transfektionseffizienz beider Transfektionsreagenzien ist hoch. Dennoch treten bei X-tremeGene 9 die Anzeichen einer Infektion in den transfizierten Zellen (Abbildung 2) 10-12 h früher auf als mit dem JetPrime-Reagenz, so dass wir zwischen diesen Reagenzien wählen, abhängig vom Arbeitsplan der nächsten Schritte in den Protokollen, was eine gewisse Flexibilität im Gesamtprozess bietet.

Das Proteintestexpressionsscreening kann mit P2-Viren eingerichtet werden, wenn die Menge der anfänglichen rekombinanten Viren, die von der Transfektionsplatte gesammelt und als P1 gekennzeichnet sind, ein limitierender Faktor für das Proteinexpressionsscreening ist.

Überlegungen beim Wechsel von kleinen zu großen Kulturvolumen.
Historisch gesehen glaubte man, dass ein optimales Zellwachstum einen hohen Luftraum in der Suspensionskultur der Sf9-Zellwartung und Scale-up-Produktion erfordert. Im Jahr 2014 wurde jedoch berichtet, dass ein hoher Luftraum in Kulturschiffen weniger kritisch ist als bisher angenommen¹⁷. Ein Kulturgefäß, das mit einer entsprechend an den Orbitalwurf der Schüttelplattform angepassten Schüttelgeschwindigkeit eingerichtet ist, sorgt auch in der Suspensionskultur mit hohem Füllvolumen für einen ausreichenden Sauerstofftransfer, indem kleine Luftblasen für eine längere Zeit erzeugt und aufrechterhalten werden. Mit diesem Ansatz können kommerziell erhältliche Insektenzellen mit einer höheren Schüttelgeschwindigkeit innerhalb eines normalen Bereichs der Verdopplungszeit der Zellen kultiviert werden, ohne die hohe Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen.

So haben wir vor 6 Jahren begonnen, das Suspensionskulturvolumen in einem Schüttelkolben während der Zellwartung zu erhöhen und eine andere Art von Kulturgefäß für die Proteinproduktion einzuführen, während wir die Schüttelbedingungen anpassen und überwachen (Abbildung 6). Um optimale Bedingungen in diesen Kulturgefäßen zu schaffen, überwachten wir die Sf9-Zellkulturparameter wie die Zellverdopplungszeit zusammen mit der Zelllebensfähigkeit, Größe und Form, dem Aggregationszustand und der Infektabilität der Zellen.

Zum Beispiel kulturieren wir für die Sf9-Zellerhaltung in den 2,8-L-Fernbach-Schüttelkolben 2 L anstelle von 0,8 L der Sf9-Suspensionszellen, die bei 150 U / min bei 27 ° C schütteln, und die Zelllebensfähigkeit liegt die meiste Zeit bei fast 99%, mit gleichmäßig geformten gesunden Teilungszellen. Für die Scale-up-Produktion infizieren wir 4 L Zellen in 5-L-Reagenzflaschen, die mit hoher Geschwindigkeit als 145 U / min bei einer niedrigeren Temperatur von 25 ° C schütteln. Die am häufigsten verwendeten Inkubatoren mit eingebauter Schüttelplattform können 6 x 2,8 L Schüttelkolben oder 6 x 5 L Reagenzflaschen oder 10 x 2,5 L Tunair Schüttelkolben aufnehmen. So beträgt die Kapazität der einen Schüttelplattform, wenn wir Fernbach-Schüttelkolben und Reagenzflaschen auf 1/3 gegenüber dem hohen Füllvolumen der Gefäße füllen, 4,8 L gegenüber 12 L mit 2,8 L Fernbach-Schüttelkolben und 10 L gegenüber 24 L mit 5 L Reagenzflaschen(Abbildung 6). Die Wartung der Suspensionszellkultur und die Scale-up-Produktion in den Kulturgefäßen mit hohem Füllvolumen haben uns geholfen, die Einschränkungen der Produktionsmengen zu überwinden und eine groß angelegte Plattform einzuführen. Daher ist dies sehr nützlich für Labore ohne Zugang zu Bioreaktoren und / oder begrenztem Platz in den Produktionspipelines.

Dieses Protokoll könnte leicht für die Herstellung und Aufreinigung von Proteinkonstrukten mit unterschiedlichen Affinitäts-Tags angepasst werden, indem geeignete Harze verwendet und Reinigungspuffer modifizieren werden, wie in der von SGC veröffentlichten Arbeit⁶ für die Flag-markierten Full-Length-Proteine von PRMT4, 7, 9 und den His-tagged PRMT5-MEP50-Komplex und PRMT6 beschrieben wurde. Obwohl wir ein BEVS-Protokoll für die PRMT-Proteinfamilie beschreiben, kann der gleiche Ansatz auf jede andere Proteinfamilie angewendet werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2.8L Nalgene  Fernbach Kulturflasche, Polycarbonat,	Nalgene	29171-854	Für die großflächige Pflege von Suspensionskulturen von Sf9-Zellen
24-Well-Blöcke RB	Qiagen	19583	Für die Inkubation von  4ml Suspension  Sf9-Zellen  für Protein  Expressionsscreening
4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul	Biorad	5671095	Für die SDS-PAGe-Analyse der gereinigten Proteine
50ml Reagenzreservoir	Celltreat Scientific Products	229290	Reservoir für verdünntes Transfektionsreagenz  und Sf9-Zellen Suspension
96-Well-Cap-Matte, zur Verwendung mit Square Well, 2 mL	Greiner Bio-One	381080	Wird zum Abdecken von 96-Well-Block-96-Well-PCR-Platten
	verwendet Eppendorf	30129300
Bacto-Agar	BD	214010	Für LB-Agar-Auswahlpaltes
Airpore Tape Sheets	Qiagen	19571	Zum Abdecken von 24-Well-Blöcken für das Proteinexpressions-Screening
Allega X-15R Zentrifuge	Beckman Coulter	392932
Antibiotikum Antimykotikum (100x)	Gibco	15240112
Bacmid DNA	Inhouse-Non-Catalog-Artikel	Bacmid DNA für die Baculovirus-Produktion
Bluo-Gal, 1g	Thermo Fisher	15519028
Beckman JLA 8.1000
Zellkulturplatten, 24-Well, mit Deckel, flacher Boden, steril	Eppendorf	30722116	Platte mit kulturbehandelter
Platte Zellresuspension Lösung 0,5  L	Millipore Sigma	für die Extraktion von Bacmid-DNA-Zellen
Lyselösung 0,5  L	Millipore Sigma	LSKCLS500	für die Extraktion von Bacmid-DNA
CELLSTAR  Gewebekulturplatten, 96 well	Greiner Bio-One	655180	Für Transfektionsmix
ClipTip 1250, Filternachschub, steril	ThermoFisher Scientific	94420818	Tips für  programmierbare und einstellbare Mehrkanalpipette
dNTP Mix (je 25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R1121
E1-ClipTip  Elektronisch einstellbarer Spitzenabstand Mehrkanal-Equalizer-Pipette, 15 bis 1250 μ L	ThermoFisher Scientific	4672090BT	Programmierbare und einstellbare Mehrkanalpipette
E4  XLS verstellbarer Abstandshalter 6-Kanal Pipette, 20-300 μ L	Ranin	LTS EA6-300XLS	Ranin einstellbare Mehrkanalpipette
Filter-Mikrotiterplatte, 96 Well, Polypropylen, mit 25 & Mikro; m Polyethylen-Membran mit ultrahohem Molekulargewicht	Agilent	201005-100	Für die Proteinaufreinigung im Expressionsscreening
Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2,5 l	IBI Scientific	SS-6003C	Für die großtechnische Proteinproduktion in Suspensionskulturen von SF9-Zellen
Gentamicin 10x10 ml	BioShop	15750078
Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum	Wisent Biocenter	080-450
I-Max Insektenmedien mit L-Glutamin, 1 l	Wisent Biocenter	301-045-LL	Serumfreies Wachstumsmedium für Insektenzellen
InstantBlue, Ultrafast Protein Stain	Expedeon Protein Solutions	ISB1L-1L	Für die Färbung von Proteingelen (SDS-PAGE)
Iptg, ultrarein, dioxanfrei, min 99,5%	BioShop	IPT001.100
JetPRIME Transfektionsreagenz  Versehen mit  jetPRIME Puffer	POLYPLUS TRANSFECTION Inc	114-01	Für die Transfektion von Sf9-Zellen zur Erzeugung von Baculovirus
Kanamycin Monosulfate	BioShop	KAN201.100
Lb Bouillon (Lennox), Pulver Mikrobielle Brühe &	Sigma	L3022-1KG
Masterblock 96 Deep Well 2,4 mL	Greiner Bio-One	780285-FD	Wird in den Transformations- und Expressions-Screening-Verfahren
verwendet Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0,5 ml	Thermo Fisher	10361012	Kompetente Zellen für die Bacmid-DNA-Generierung
mLINE 12-Kanal Pipette, einstellbar 30 - 300 uL	Sartorius	Sartorius 725240	12 Kanal
Pipetten-Neutralisationslösung, 0,5  L	Millipore Sigma LSKNS0500		Für die Extraktion von Bacmid-DNA
New Brunswick  Innova 44R, 120V, Orbit 2,5 cm (1 in)	Eppendorf	M1282-0004	Shaker-Inkubator zur Inkubation der Suspension von Sf9-Zellen
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30250	Für die Proteinreinigung
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	LS15140122
PYREX  Delong Shaker Erlenmeyerkolben mit Leitblechen, Corning  500 ml	Pyrex	4444-500	Für die Suspensionskultur von Sf9-Zellen
PYREX Delong Shaker Erlenmeyerkolben mit Leitblechen, Corning, 125 ml	Pyrex	4444-125	Für die Suspensionskultur von Sf9-Zellen
PYREX Delong Shaker Erlenmeyerkolben mit Leitblechen, Corning, 250 ml	Pyrex	4444-250	Für die Suspensionskultur von Sf9-Zellen
RedSafe  Nukleinsäure  Säure  Färben  Lösung	Froggabio	21141
RNase A, 0,9  mL	Millipore Sigma	Für Suspensionspuffer für die Bacmid-DNA-Extraktion
Rolle & Züchten Sie kugelförmige Glasbeschichtungsperlen	MP Biomedicals	115000550	für die Ausbreitung von Bakterienzellen auf der Oberfläche einer Agarplatte.
RT-LTS-A-300μ L-768/8 (Spitzen)	Ranin	30389253	Tips for ranin Mehrkanalpipette
S.O.C. Medium	Thermo Fisher Scientific	15544034
Serum, Zellkultur, fötales Rinderserum (Fbs), Hyclone, charakterisiert kanadisches	cytivalifesciences	SH3039602	Zusätzlich zum Serum freies Medikament für die transfizierten
Zellen Sf9-Zellen	Thermo Fisher	12659017	Insect cells
Sfx-Insect Cell Culture Media	Cytiva (ehemals GE Healthcare Life Sciences)	SH3027802	Serumfreies Wachstumsmedium für Insektenzellen
Tape Pad	Qiagen	19570	Tape Pad Taq
DNA Polymerase mit ThermoPol Puffer - 2.000 Einheiten	New England Biolabs	M0267L
Tetracyclin Hcl	BioShop	TET701.10
Trypanblau 0,4% Lösung	Gibco	15250061	für die Beurteilung der Zellviabilität
VITLAB  Reagenzflaschen, PP mit Schraubverschluss, PP, BrandTech, 5L	VITLAB	V100889	Für die großtechnische Proteinproduktion in Suspensionskulturen von Sf9-Zellen
VWR  Digitaler Mini-Inkubator	VWR	10055-006	Inkubator für adhärente Sf9-Zellen
VWR  Inkubations-Mikrotiterplatten-Schüttler	VWR	97043-606	Inkubator für die Suspensionskultur von Sf9-Zellen in 24-Well-Blöcken
VWR Petrischalen	VWR	CA73370-037
X-tremeGene 9 DNA  Transfektions-Reagenz  1,0 M	Roche	6365787001	Für die Transfektion von Sf9-Zellen zur Erzeugung rekombinanter Baculoviren