Culture de mégacaryocytes dans un hydrogel 3D à base de méthylcellulose pour améliorer la maturation cellulaire et étudier l’impact de la rigidité et du confinement

Summary

Il est maintenant reconnu que l’environnement tridimensionnel des cellules peut jouer un rôle important dans leur comportement, leur maturation et/ou leur différenciation. Ce protocole décrit un modèle de culture cellulaire tridimensionnel conçu pour étudier l’impact du confinement physique et des contraintes mécaniques sur les mégacaryocytes.

Abstract

L’environnement 3D conduisant à la fois au confinement et aux contraintes mécaniques est de plus en plus reconnu comme un déterminant important du comportement cellulaire. La culture 3D a ainsi été développée pour mieux aborder la situation in vivo. Les mégacaryocytes se différencient des cellules souches hématopoïétiques et progénitaires (HSPC) dans la moelle osseuse (BM). Le BM est l’un des tissus les plus mous du corps, confiné à l’intérieur de l’os. L’os étant peu extensible à l’échelle cellulaire, les mégacaryocytes sont concomitamment soumis à une faible rigidité et à un confinement élevé. Ce protocole présente une méthode de récupération des HSPC de lignée de souris négative (Lin-) par tri immuno-magnétique et leur différenciation en mégacaryocytes matures dans un milieu 3D composé de méthylcellulose. La méthylcellulose n’est pas réactive envers les mégacaryocytes et sa rigidité peut être ajustée à celle de la moelle osseuse normale ou augmentée pour imiter une moelle fibrotique pathologique. Le processus de récupération des mégacaryocytes pour d’autres analyses cellulaires est également détaillé dans le protocole. Bien que l’extension des proplaquettaires soit empêchée dans le milieu 3D, il est décrit ci-dessous comment remettre en service les mégacaryocytes en milieu liquide et quantifier leur capacité à étendre les proplaquettaires. Les mégacaryocytes cultivés en hydrogel 3D ont une plus grande capacité à former des proplaquettaires que ceux cultivés en milieu liquide. Cette culture 3D permet i) de différencier les progéniteurs vers les mégacaryocytes atteignant un état de maturation plus élevé, ii) de récapituler des phénotypes qui peuvent être observés in vivo mais passent inaperçus dans les cultures liquides classiques, et iii) d’étudier les voies de transduction induites par les signaux mécaniques fournis par un environnement 3D.

Introduction

Les cellules du corps subissent un microenvironnement 3D complexe et sont soumises à l’interaction entre les signaux chimiques et mécanophysiques, y compris la rigidité du tissu et le confinement dû aux cellules voisines et à la matrice environnante ^1,2,3. L’importance de la rigidité et du confinement pour le comportement cellulaire n’a été reconnue qu’au cours des dernières décennies. En 2006, les travaux fondateurs d’Engler et al. ⁴ ont mis en évidence l’importance de l’environnement mécanique pour la différenciation cellulaire. Les auteurs ont démontré que la variation de la rigidité du substrat cellulaire entraînait l’orientation des cellules souches vers diverses lignées de différenciation. Depuis lors, l’impact des signaux mécaniques sur le devenir et le comportement des cellules est devenu de plus en plus reconnu etétudié. Bien qu’elle soit l’un des tissus les plus mous de l’organisme, la moelle osseuse a une organisation structurelle 3D qui est confinée à l’intérieur de l’os. La rigidité de la moelle, bien que techniquement difficile à mesurer avec précision, est estimée entre 15 et 300 Pa ^5,6. Dans le stroma, les cellules sont étroitement confinées les unes aux autres. De plus, la plupart d’entre eux migrent vers les vaisseaux sinusoïdaux pour entrer dans la circulation sanguine. Ces conditions créent des contraintes mécaniques supplémentaires sur les cellules adjacentes, qui doivent s’adapter à ces forces. Les indices mécaniques représentent un paramètre important dont les conséquences sur la différenciation des mégacaryocytes et la formation de proplaquettaires ont récemment été explorées. Bien que les mégacaryocytes puissent se différencier in vitro en culture liquide traditionnelle, ils n’atteignent pas le degré de maturation observé in vivo,en partie à cause de l’absence des indices mécaniques de l’environnement 3D ^7. La croissance des progéniteurs intégrés dans l’hydrogel apporte des indices mécaniques 3D qui manquent dans le milieu liquide.

Les hydrogels sont largement utilisés depuis plusieurs décennies dans le domaine hématologique, notamment pour faire pousser des cellules dans des essais de formation de colonies afin de quantifier les progéniteurs hématopoïétiques. Cependant, de tels hydrogels ont rarement été utilisés pour explorer l’impact biologique de l’environnement mécanique 3D sur la maturation et la différenciation des cellules hématopoïétiques. Au cours des dernières années, notre laboratoire a développé un modèle de culture 3D utilisant un hydrogel ⁸à base de méthylcellulose. Ce gel physique non réactif est un outil utile pour imiter les contraintes physiques de l’environnement mégacarytaire natif. Il est dérivé de la cellulose par remplacement des résidus hydroxyles (-OH) par des groupes méthoxyde (-OCH_3). Le degré de substitution méthylique et la concentration en méthylcellulose déterminent la rigidité de l’hydrogel une fois qu’il s’est jellifié. Au cours de la phase de développement de cette technique, il a été démontré que le module de Young dans la gamme de 30 à 60 Pa est la rigidité optimale du gel pour la croissance des mégacaryocytes ⁹.

Le protocole suivant décrit une méthode pour cultiver des progéniteurs mégacaryocytaires de souris dans un hydrogel de méthylcellulose 3D. Il a déjà été démontré que par rapport à la culture liquide standard, cette culture d’hydrogel augmente le degré de polyploïdisation des mégacaryocytes, améliore la maturation et l’organisation intracellulaire, et augmente la capacité des mégacaryocytes à étendre les proplaquettaires une fois ressuspendées dans un milieu liquide ⁹. Ce manuscrit décrit en détail le protocole d’isolement des cellules Lin− de la moelle osseuse de souris et leur incorporation dans un hydrogel de méthylcellulose pour la culture 3D ainsi que la quantification de leur capacité à produire des proplaquettaires et la récupération des cellules pour des analyses ultérieures.

Protocol

Toutes les expériences doivent être effectuées conformément aux lignes directrices institutionnelles pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Tous les protocoles présentés dans la vidéo ont été réalisés dans le strict respect de la législation européenne et des recommandations de la Commission de révision de l’Etablissement Français du Sang (EFS). Une première version de ce protocole a été initialement publiée en 2018 dans Methods in Molecular Biology ⁸.

REMARQUE : La figure 1 présente une vue schématique de l’ensemble du processus. Ce processus comprend 1) la dissection osseuse, la récupération de la moelle osseuse et l’isolement mécanique des cellules de la moelle, 2) le tri magnétique des cellules négatives de la lignée (Lin-), 3) l’ensemencement dans un hydrogel liquide ou de méthylcellulose et 4) la résusption de mégacaryocytes cultivés dans un gel 3D pour l’examen de la formation de proplaquettaires en milieu liquide.

1. Collecte d’os de souris adultes

REMARQUE: Dans cette section, il est important de minimiser la contamination microbienne.

1. Préparer un tube de 15 mL pour le prélèvement osseux avec le milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 1 % du volume total de mélange antibiotique pénicilline-streptomycine-glutamine (PSG) (pénicilline 10000 U/mL, streptomycine 100000 μg/mL et L-glutamine 29,2 mg/mL).
   REMARQUE: Si toutes les souris utilisées ont le même génotype, regrouper tous les os dans le même tube contenant 1 mL de DMEM - PSG 1% par nombre de souris. Les antibiotiques sont importants pour prévenir la prolifération possible des bactéries pendant le temps de prélèvement osseux.
2. Remplissez un tube de 50 mL avec de l’éthanol à 70% pour la désinfection des os et un autre pour les instruments de rinçage pendant la procédure. Utilisez des instruments de dissection stérilisés.
3. Anesthésier les souris par inhalation d’isoflurane (4%) et procéder rapidement à la luxation cervicale pour les euthanasier. Immergez rapidement le corps dans de l’éthanol à 70% pour désinfecter et éviter la contamination microbienne.
4. Disséquez rapidement les tibias et les fémurs.
5. À l’aide d’un scalpel, coupez les épiphyses de l’extrémité latérale de la cheville pour le tibia et de l’extrémité latérale de la hanche pour le fémur.
6. Immergez les os pendant une seconde dans de l’éthanol à 70% avant de les immerger dans un milieu DMEM contenant 1% de PSG.

2. Dissociation de la moelle osseuse et isolement des cellules Lin

REMARQUE: Cette partie du protocole est effectuée sous une hotte à flux laminaire. Pour une culture, tous les puits font partie de la même expérience et ne peuvent pas être considérés comme des répliques biologiques indépendantes. Les cellules de toutes les souris sont regroupées pour assurer l’homogénéité de tous les puits et pouvoir les comparer les unes aux autres tout en éliminant toute variabilité interindéclite possible. Pour les répliques biologiques indépendantes, la culture doit être répétée.

1. Placez les os dans une boîte de Pétri et remontez-les deux fois dans la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) stérile de Dulbecco pour éliminer les contaminants potentiels.
2. Préparer DMEM - 1% PSG dans un tube de 50 mL.
   REMARQUE: Fournir 2 mL de DMEM - 1% PSG par souris utilisée pour l’expérience.
3. Remplissez une seringue de 5 mL équipée d’une aiguille de calibre 21 avec DMEM - 1% PSG.
4. En tenant l’os avec une pince, introduisez uniquement le biseau de l’aiguille à l’extrémité du genou.
   REMARQUE: L’épiphyse du côté du genou doit rester intacte de la dissection, laissant une petite cavité en son centre à travers laquelle insérer l’aiguille. L’épiphyse restante maintiendra l’os attaché à l’aiguille pendant le rinçage. Veillez à ne pas introduire plus que le biseau dans l’os car il pourrait écraser et endommager la moelle.
5. Appuyez rapidement sur le piston de la seringue pour rincer la moelle dans un tube de 50 mL.
   REMARQUE: Pour éviter les éclaboussures et faciliter la chasse d’eau et la libération de la moelle, placez l’extrémité libre de l’os sur la paroi du tube, immergée dans DMEM - 1% PSG. En pratique, un volume compris entre 500 μL et 1 mL est généralement suffisant pour expulser la moelle osseuse. Lorsque la moelle a été totalement expulsée, l’os est devenu blanc. Dans le cas où la moelle n’a pas été totalement expulsée de la diaphyse comme en témoigne une couleur rouge restante, il est possible de répéter le rinçage avec du milieu frais.
6. Répétez les étapes 2.4. et 2.5. pour tous les os, remplir la seringue de 5 mL avec du DMEM - 1% PSG si nécessaire.
7. Utilisez la même seringue de 5 mL avec l’aiguille de calibre 21 pour transférer le volume total de milieu contenant de la moelle rincée dans des tubes ronds de 10 mL.
   REMARQUE: Il n’est pas absolument nécessaire de passer à un tube à fond rond de 10 mL, mais il est plus facile de procéder aux étapes de dissociation suivantes. N’hésitez pas à changer de seringue et/ou d’aiguille si un risque de contamination est suspecté.
8. Procéder à la dissociation cellulaire en aspirant et en expulsant les cellules du milieu et de la moelle successivement deux fois à travers une aiguille de calibre 21, trois fois à travers une aiguille de calibre 23 et une fois à travers une aiguille de calibre 25.
   REMARQUE: Évitez les bulles d’air car elles peuvent être préjudiciables pour les cellules.
9. Transférer la suspension dans des tubes de 15 mL.
10. Mesurez le nombre de cellules et vérifiez la viabilité à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’une chambre cellulaire pour le comptage manuel en présence de bleu de trypan afin d’exclure les cellules mortes.
11. Centrifuger les tubes de 15 mL pendant 7 min à 300 x g. À l’aide d’une pipette de transfert de 1 mL, pipettez soigneusement et jetez le surnageant.
12. Isoler les cellules souches et progénitaires par tri immunomagnétique négatif à l’aide d’un kit d’isolement de cellules hématopoïétiques de souris.
    NOTE: Le but de ce tri cellulaire est de récupérer les cellules qui sont négatives pour tous les anticorps de sélection (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) et donc d’éliminer les cellules qui sont déjà engagées dans une lignée de différenciation autre que mégacaryocytaire.
13. En suivant les instructions du kit, resussuspendre la pastille cellulaire dans un milieu M fraîchement préparé (PBS avec 2 % du volume final de sérum fœtal bovin (FBS), EDTA 1 mM) à une concentration de 1 × 10⁸ cellules/mL et répartir la suspension dans des tubes de polystyrène à fond rond de 5 mL jusqu’à un volume maximal de 2 mL.
14. Ajouter aux tubes de polystyrène : sérum de rat normal à une concentration de 50 μL/mL ainsi que le mélange d’anticorps biotinylés (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) à une concentration de 50 μL de mélange par mL et homogénéiser en agitant doucement les tubes.
    REMARQUE: Ces anticorps se lient aux cellules déjà engagées dans une voie de différenciation, à l’exception de la voie mégacaryocytaire.
15. Incuber les tubes sur de la glace pendant 15 min.
16. Ajouter les billes magnétiques recouvertes de streptavidine à une concentration de 75 μL/mL et homogénéiser en agitant doucement les tubes.
17. Incuber à nouveau sur de la glace pendant 10 min.
18. Si nécessaire, régler à un volume final de 2,5 mL par tube avec un milieu M.
19. Homogénéisez la suspension en agitant doucement le tube juste avant de les placer, sans leurs capuchons, à l’intérieur d’un aimant et attendez trois minutes.
    REMARQUE: Les cellules déjà engagées dans une voie de différenciation et recouvertes de billes magnétiques seront retenues sur la paroi du tube à l’intérieur de l’aimant.
20. Inverser l’aimant et le tube pour transférer le contenu du tube dans un nouveau tube en polystyrène à fond rond de 5 mL.
    REMARQUE: Ne retirez pas le tube de l’aimant pour le transfert; cela se fait en inversant l’aimant avec le tube encore à l’intérieur. Utilisez un mouvement régulier et ne secouez pas le tube.
21. Jetez le tube initial contenant des cellules magnétiques indésirables et placez le nouveau, sans son capuchon, dans l’aimant pendant trois minutes supplémentaires.
22. En procédant comme à l’étape 2.20, transférer les cellules Lin− isolées dans un nouveau tube de 15 mL.
    REMARQUE: Si plusieurs tubes en polystyrène de 5 mL ont été utilisés pour les étapes précédentes, remettez toutes les cellules dans le même tube de 15 mL. Les cellules récupérées après le tri cellulaire sont des cellules souches hématopoïétiques et des progéniteurs. La présence de thrombopoïétine (TPO), le principal régulateur physiologique de la mégacaryopoïèse ^10,dirigera la différenciation cellulaire vers la lignée cellulaire mégacaryocytaire.
23. Mesurez le nombre de cellules Lin− et la viabilité comme à l’étape 2.10.
24. Calculer le volume requis de suspension de cellule à centrifuger afin d’avoir 1 x 10⁶ cellules viables x Nombre de puits, le nombre de puits étant le nombre de puits à ensemencer par condition.
25. Préparer un tube par condition avec le volume approprié de suspension de cellule et centrifuger à 300 x g pendant 7 min.
26. Pour les cultures liquides, jeter le surnageant et remise en service de la pastille cellulaire dans un milieu de culture complet (DMEM, PSG 1% du volume final, FBS 10% du volume final, hirudine 100 U/mL, TPO 50 ng/mL) pour atteindre la concentration finale de 2 × 10⁶ cellules viables/mL (égale à 1 × 10⁶ cellules par puits de 500 μL). Incuber les cellules à 37 °C sous 5 % de CO2. (= jour 0 de la culture)
    REMARQUE: Voir le paragraphe suivant pour les cultures de méthylcellulose À titre d’exemple, pour préparer un milieu de culture complet pour un puits, utilisez 435 μL de DMEM, 50 μL de FBS à 100% pour 10% final, 5 μL de PSG à 1% final, 5 μL de 10 000 U/mL pour 100 U/mL final et 5 μL de 5 μg/mL TPO pour 50 ng/mL final. Les plaques de culture à 4 ou 24 puits sont généralement utilisées car leur diamètre de puits convient bien aux 500 μL nécessaires par puits.

3. Incorporation de cellules dans l’hydrogel de méthylcellulose

REMARQUE: Veuillez noter que le protocole suivant décrit la méthode pour obtenir un seul puits de culture cellulaire d’hydrogel, s’adapter au nombre de puits nécessaires.

1. Décongeler 1 mL d’aliquotes de solution stock de méthylcellulose à 3 % à température ambiante. Préparez une aliquote supplémentaire séparée de méthylcellulose pour le revêtement de la seringue.
   NOTE: À une concentration de 3%, la méthylcellulose reste liquide à température ambiante (20-25 °C).
2. Enduire une seringue Luer lock de 1 mL équipée d’une aiguille de calibre 18 avec de la méthylcellulose en tirant 1 mL de méthylcellulose de l’aliquote supplémentaire. Expulser totalement la méthylcellulose.
   REMARQUE: Cette étape de revêtement garantit que le volume de méthylcellulose collecté à l’étape 3.3 est exact.
3. Avec la même seringue et la même aiguille, mais à l’aide d’une nouvelle aliquote de méthylcellulose, prélever le volume approprié de méthylcellulose (Figure 2A).
   REMARQUE: Pour atteindre une concentration finale de 2% de méthylcellulose dans un volume final de 500 μL par puits, 333 μL de méthylcellulose à 3% sont nécessaires.
4. Retirez prudemment l’aiguille. À l’aide de pinces stérilisées, vissez un connecteur de verrouillage Luer à l’extrémité de la seringue(Figure 2B-C).
5. Fixez une deuxième seringue Luer lock de 1 mL non revêtue au connecteur Luer Lock afin de connecter les deux seringues ensemble (Figure 2D).
   REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de recouvrir cette deuxième seringue.
6. Répartir également le volume de méthylcellulose entre les deux seringues(figure 2E)et les mettre de côté jusqu’à l’étape 3.11.
7. Préparer le milieu de culture concentré de DMEM de manière à obtenir dans le volume final de méthylcellulose (étape 3.11) une concentration identique à celle du milieu de culture liquide pour chaque composé (PSG 1 % du volume final, FBS 10 % du volume final, hirudine 100 U/mL, TPO 50 ng/mL).
   1. Préparer 167 μL de milieu de culture concentré par puits final de 1 × 10⁶ cellules. Ce volume de milieu est calculé de manière à obtenir une concentration finale de méthylcellulose de 2%. Le volume total dans le puits sera de 500 μL (167 μL de suspension cellulaire en milieu de culture concentré + 333 μL de méthylcellulose) et tous les composants auront une concentration identique à celle des puits liquides.
   2. À titre d’exemple, pour préparer un milieu de culture complet pour un puits, utilisez 102 μL de DMEM, 50 μL de FBS à 10 % pour 10 % de final, 5 μL de PSG à 1 % de PSG pour 1 % de final, 5 μL de 10 000 U/mL pour 100 U/mL final et 5 μL de 5 μg/mL TPO pour 50 ng/mL final. Il donne un volume de 167 μL utilisé pour remettre en service les cellules et avec l’ajout de 333 μL de méthylcellulose, le volume final sera de 500 μL.
8. Après avoir terminé l’étape de centrifugation 2.26, jeter le surnageant et ressuspend la pastille cellulaire dans le milieu de culture concentré dans un rapport de 1 × 10⁶ cellules pour 167 μL.
9. Reprez les seringues et déconnectez l’une d’entre elles du connecteur.
10. Pipette 167 μL de la suspension cellulaire.
11. Ajouter la suspension cellulaire directement dans le connecteur de la seringue(Figure 2F),en veillant à ne pas introduire de bulles d’air.
    REMARQUE: Lors de l’ajout de la suspension cellulaire, aspirez lentement le piston de la seringue simultanément pour libérer de l’espace pour la suspension cellulaire.
12. Reconnectez soigneusement les deux seringues(Figure 2G)sans perdre de suspension dans le filetage de la vis.
    REMARQUE: Avant la reconnexion, tirez le piston afin de laisser le connecteur à moitié vide et laissez suffisamment d’espace pour que la deuxième seringue se connecte sans que la suspension ne déborde.
13. Homogénéiser lentement le milieu méthylcellulosique avec la suspension cellulaire avec dix mouvements de piston d’avant en arrière entre les deux seringues (Figure 2H).
14. Tirez le volume total dans une seringue et débranchez les deux seringues, en laissant le connecteur vide.
15. Vider le contenu de la seringue dans un puits d’une plaque à 4 puits (Figure 2I).
16. Incuber les cellules à 37 °C sous 5% de CO₂ (= jour 0 de culture).
    REMARQUE: Il est possible de préparer deux puits de méthylcellulose avec une paire de seringues. Augmenter de deux le volume de méthylcellulose et le volume de suspension cellulaire pour avoir 2 x10⁶ cellules. Après avoir terminé l’étape 3.13. répartir le volume également entre les deux seringues pour avoir 500 μL dans chacune d’elles. Déconnectez-les et videz celui sans connecteur dans un puits de culture. Reconnectez les seringues pour transférer le volume de celle qui a maintenu le connecteur à l’autre. Débranchez les seringues, celle avec les 500 μL ne doit pas avoir le connecteur attaché, et ensemencez les cellules dans un deuxième puits de culture. La méthylcellulose à 3% est achetée sous forme de solution mère dans le milieu de Dulbecco modifié (IMDM) d’Iscove tandis que les cellules concentrées sont en suspension dans le DMEM. Des tests comparatifs ont été initialement effectués pour s’assurer que ce milieu mixte n’avait aucun impact sur le résultat de l’expérience, en particulier par rapport à la culture liquide en 100% DMEM.

4. Resuspension cellulaire pour l’analyse proplaquettaire

NOTE: L’analyse de la capacité à former des proplaquettaires doit être effectuée dans des conditions comparables entre les mégacaryocytes cultivés en liquide et en méthylcellulose. Les contraintes physiques exercées par l’hydrogel de méthylcellulose inhibent l’extension des proplaquettaires. Par conséquent, les cellules cultivées en méthylcellulose sont ressuspendées dans un milieu liquide frais le jour 3 de la culture pour leur permettre d’étendre les proplaquettaires. L’hydrogel de méthylcellulose est un hydrogel physique qui se dilue facilement lors de l’ajout de milieu liquide. Il est important de savoir si les effets de la remise en condition et de la centrifugation ne sont pas des artefacts, les cellules en milieu liquide témoin doivent être traitées simultanément de la même manière que les cellules cultivées en méthylcellulose. Reportez-vous à la représentation schématique de l’expérience (Figure 1).

1. Préparer 10 mL de DMEM - 1 % psg préchauffé à 37 °C dans un tube de 15 mL pour que chaque puits soit réinsais.
2. Ressuspendez prudemment les cellules de chaque puits dans les 10 mL de DMEM - 1% PSG.
   REMARQUE: Faites doucement plusieurs mouvements de haut en bas pour diluer complètement la méthylcellulose. Pour les puits liquides, assurez-vous de recueillir toutes les cellules déposées au fond du puits.
3. Centrifuger les tubes 5 min à 300 × g.
4. Pendant ce temps, préparez le milieu de culture complet (DMEM, PSG 1% du volume final, FBS 10% du volume final, hirudin 100 U / mL, TPO 50 ng / mL).
   REMARQUE: À cette étape, chaque puits est récupéré pour être dilué de moitié, donc préparer 1 mL de milieu de culture complet par puits.
5. Jeter le surnageant et ressuspender la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de culture pour chaque tube.
6. Réensemé 500 μL de suspension cellulaire par puits dans une plaque de 4 ou 24 puits et incuber à 37 °C sous 5 % de CO_2.
   REMARQUE: À partir d’un puits initial, obtenez 2 puits pour la visualisation proplaquettaire en double. Veuillez noter que, comme ces doublons proviennent du même échantillon, ils ne peuvent pas être considérés comme des répliques indépendantes.
7. 24 heures après le réasérage, le jour 4 de la culture, acquérir au hasard 10 images par puits en utilisant la microscopie à champ lumineux et l’objectif 20×.
   REMARQUE: Les cellules ont tendance à se regrouper au centre du puits, assurez-vous de ne pas avoir trop de cellules sur le terrain car cela pourrait rendre la visualisation et la quantification des proplaquettaires difficiles. Assurez-vous de capturer au moins 5 mégacaryocytes par champ.
8. Comptez le nombre total de mégacaryocytes et de mégacaryocytes étendant les proplaquettaires dans chaque image et calculez la proportion de mégacaryocytes étendant les proplaquettaires.
   REMARQUE : La quantification n’est pas automatisée; effectuer le comptage des cellules manuellement. Le comptage peut être facilité par l’utilisation du plugin compteur de cellules d’ImageJ pour cliquer sur les cellules afin de les marquer au fur et à mesure qu’elles sont comptées. 10 champs acquis par puits et des puits en double représentent environ 150 à 300 mégacaryocytes par condition.

5. Fixation et récupération des cellules pour les analyses futures

ATTENTION: Ce protocole utilise des fixateurs qui doivent être manipulés sous une hotte aspirante, en portant un équipement de protection.

REMARQUE: L’objectif est de maintenir intactes les contraintes de gel appliquées sur les cellules jusqu’à ce qu’elles soient complètement fixées. Par conséquent, et quel que soit le fixateur utilisé, il doit être ajouté dans le puits au-dessus de la méthylcellulose, sans perturber le gel. Le même protocole est appliqué aux cultures liquides.

1. Ajouter un volume de solution fixatrice égal au volume ensemencé (500 μL dans ce protocole), sur la méthylcellulose sans perturber le gel. Attendez le temps approprié selon le fixateur utilisé (au moins 10 min).
   REMARQUE: La diffusion fixative dans tout le gel doit être très rapide, comme le révèle un changement rapide de la couleur du gel (du rose à la teinte jaune-orange). Le paraformaldéhyde (8% dans le DPBS, 500 μL par puits) est généralement utilisé pour l’immunomarquage, tandis que le glutaraldhéhyde (5% dans le tampon cacodylate, 500 μL par puits) est utilisé pour l’analyse par microscopie électronique.
2. À l’aide d’une pipette P1000, effectuez doucement plusieurs pipetages de haut en bas avec le fixateur et le gel afin de diluer de manière homogène la méthylcellulose.
3. À l’aide de la même pipette et de la même pointe, transférer tout le volume du puits dans un tube de 15 mL contenant 10 mL de DPBS et homogénéiser.
4. Centrifuger le mélange à 300 × g pendant 7 min.
   REMARQUE: Une deuxième étape de lavage peut être nécessaire pour éliminer toute la méthylcellulose
5. Jeter le surnageant et ressuspend la pastille de mégacaryocytes dans le milieu approprié selon l’analyse souhaitée (immunomarquage, cytométrie en flux^9,microscopie électronique...) (pour la microscopie électronique, voir aussi la méthode papier «In situ exploration of the major steps of megakaryopoiesis using transmission electron microscopy » dans ce numéro de JoVE).

Representative Results

Les données obtenues à l’aide de ce protocole ont été publiées à l’origine dans Blood en 2016⁹.

Selon le protocole, les cellules ont été ensemencées dans un milieu liquide ou en hydrogel de méthylcellulose. Les cellules en milieu liquide ont toutes sédimenté au fond du puits, en contact avec la surface plastique rigide et parfois avec d’autres cellules. En revanche, les cellules incorporées dans l’hydrogel de méthylcellulose sont réparties de manière homogène dans le gel et sont isolées des cellules voisines(Figure 3A). Le gel de méthylcellulose à une concentration finale de 2 % augmente très légèrement le diamètre moyen des mégacaryocytes par rapport à la culture liquide (Figure 3B), conformément à la ploïdie rapportée plus élevée⁹. En revanche, l’augmentation de la concentration de méthylcellulose de 0,5 % altère la différenciation des mégacaryocytes, comme le montre un diamètre moyen plus petit(figure 3B).

Une différence notable dans l’ultrastructure des mégacaryocytes est observée entre les mégacaryocytes différenciés en culture liquide et ceux différenciés in vivo dans la moelle osseuse. Une caractéristique des mégacaryocytes matures est un réseau membranaire intracytoplasmique complexe, le DMS (Demarcation Membrane System) qui sert de réservoir pour la membrane des futures plaquettes. Dans les mégacaryocytes matures, le DMS s’organise pour former des feuilles de membrane entrelacées qui occupent la majeure partie du cytoplasme. Par microscopie électronique à transmission (TEM), ils semblent être étroitement apposés et délimitent des territoires cytoplasmiques (panneau supérieur de lafigure 3C) (pour la procédure TEM, voir la méthode papier «Exploration in situ des principales étapes de la mégacaryopoïèse à l’aide de la microscopie électronique à transmission » dans ce même numéro JOVE). En culture liquide, les membranes DMS ont principalement l’apparence de petites vésicules rondes, ovales ou allongées sans délimitation des territoires cytoplasmiques(figure 3C du panneau central). En revanche, la culture de méthylcellulose à 2% favorise l’organisation du DMS dans une majorité de mégacaryocytes, avec des membranes étroitement apposées et délimitant des territoires cytoplasmiques, ressemblant à celui in situ (Figure 3C panneau inférieur). Ce résultat indique que la culture d’hydrogel de méthylcellulose à 2% permet une meilleure différenciation des mégacaryocytes en raison des contraintes mécaniques du milieu environnemental.

Après le transfert cellulaire en milieu liquide au jour 3, les mégacaryocytes commencent à étendre les proplaquettaires après 4 h ⁹. La figure 4 montre la quantification de la proportion de mégacaryocytes ayant des proplaquettaires étendues 24 h après la remise en charge en milieu liquide. Dix images ont été acquises au hasard par puits, en utilisant la microscopie à champ lumineux et l’objectif 20×(Figure 4A). La quantification a été effectuée à l’aveugle et manuellement à l’aide du plugin de compteur de cellules sur Fiji (ImageJ)(Figure 4B). Comme il s’agit de cultures cellulaires primaires, il existe une variabilité inter-expériences mais le protocole reste robuste et offre une bonne reproductibilité. Dans l’état de pré-culture liquide, la proportion de proplaquettaires doit être comprise entre 10% et 20% alors que cette proportion est doublée pour la pré-culture d’hydrogel.

Graphique 1. Représentation schématique de l’ensemble du processus. Les os sont disséqués, la moelle est évacuée et les cellules sont dissociées mécaniquement. Les cellules souches et progénigènes d’intérêt (cellules Lin) sont isolées par une procédure de tri immunomagnétique négatif et ensemencées dans un milieu liquide ou hydrogel (jour 0). Au jour 3 de la culture (qui représente au total une durée de 4 jours), les deux conditions sont ressaisie dans un milieu de culture liquide frais séparé. Cette deuxième étape de culture est réalisée du jour 3 au jour 4 de la culture. La proportion de MOM étendant les proplaquettaires est mesurée au jour 4 de la culture. Pour plus de clarté visuelle, une cellule est schématisée par puits. Le cercle bleu représente une seule cellule avec son noyau en violet. Dans la dernière étape, les deux députés sont représentés par des proplaquettaires. La proportion de MATÉRIAUX formant des proplaquettaires varie en fonction de la pré-culture de liquide ou de méthylcellulose. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 2. Incorporation de cellules dans l’hydrogel de méthylcellulose. Après pré-revêtement de la paroi des seringues, (A) tirer le volume approprié de méthylcellulose; (B, C) débrancher l’aiguille et visser un connecteur sur la seringue; (D) pousser la méthylcellulose à mi-chemin à travers le connecteur et fixer une deuxième seringue; E)répartir également la méthylcellulose entre les deux seringues et les déconnecter; F) ajouter la suspension cellulaire à la seringue portant le connecteur; (G) reconnecter les deux seringues; (H) homogénéiser en poussant tout le volume d’une seringue à l’autre plusieurs fois; (I) ensemencer les cellules en expulsant tout le volume dans un plat de culture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 3. Caractéristiques des mégacaryocytes selon l’état de culture. (A) Images représentatives de mégacaryocytes au jour 3 de la culture dans un liquide (panneau de gauche) ou un milieu d’hydrogel de méthylcellulose à 2% (panneau de droite). Barre d’échelle = 50 μm (B) Diamètre moyen des mégacaryocytes cultivés en milieu liquide ou dans un hydrogel de méthylcellulose à 2% ou 2,5%. Les résultats sont exprimés comme la moyenne ± SD dans 3 cultures indépendantes, avec un total d’au moins 100 mégacaryocytes examinés. *, P<0,05, ***P < 0,0001, en utilisant l’analyse de variance à 1 voie (ANOVA) avec le test de comparaison multiple de Bonferroni. (graphique adapté d’Aguilar et al. 2016) (C) Vue schématique (à gauche) et images représentatives de microscopie électronique (au milieu) de mégacaryocytes murins; panneaux de droite, vues rapprochées des carrés blancs (barre d’échelle = 5 μm pour les images de microscopie électronique moyenne et 2 μm pour les vues rapprochées). Les panneaux supérieurs sont des mégacaryocytes in situ, le milieu représente les mégacaryocytes cultivés in vitro en culture liquide et les panneaux inférieurs sont des mégacaryocytes cultivés dans de l’hydrogel de méthylcellulose 3D. Ces données ont été publiées à l’origine dans Blood Journal, DOI10.1007/978-1-4939-8585-2_9⁵. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 4. Résultats représentatifs de la quantification des proplaquettaires. (A) images représentatives des mégacaryocytes au jour 4 de la culture. Les cellules ont été incubées trois jours dans un milieu liquide(à gauche)ou à 2 % d’hydrogel de méthylcellulose(à droite),suivis d’un jour de résuspension en milieu liquide. Les flèches noires indiquent des mégacaryocytes étendant les proplaquettaires. (Barre d’échelle = 50 μm). (B) Données de quantification représentatives de la formation de proplaquettaires. Formation de proplaquettaires quantifiée au jour 4 pour les mégacaryocytes préalablement pré-cultivés du jour 0 au jour 3 dans un milieu liquide ou hydrogel de méthylcellulose à 2%. Les résultats sont exprimés en % de mégacaryocytes étendant les proplaquettaires (moyenne ± SD) et proviennent de 3 expériences indépendantes, avec un nombre total de mégacaryocytes examinés par condition >750 (test t, p = 0,0023). La proportion moyenne de mégacaryocytes prolongeant les proplaquettaires est de 16% à l’état liquide et de 39% pour la pré-culture d’hydrogel de méthylcellulose. Ce résultat correspond à l’effet précédemment démontré et publié de la pré-culture d’hydrogel qui augmente la formation de proplaquettaires par rapport à l’état liquide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Au cours de la décennie précédente, la mécanobiologie a suscité de plus en plus d’intérêt dans de nombreux domaines de la biologie. Il est maintenant communément admis que l’environnement mécanique entourant les cellules joue un rôle dans leur comportement, soulignant l’importance d’étudier comment les mégacaryocytes détectent et réagissent aux signaux mécaniques extracellulaires. Il est difficile de mesurer avec précision la rigidité du tissu de la moelle osseuse in situ¹¹, surtout si l’on considère la moelle rouge hématopoïétique car elle est située à l’intérieur des os trabéculaires chez les grands mammifères alors que la moelle plus facilement accessible de la diaphyse est composée essentiellement d’adipocytes (moelle jaune)¹². Dans le cas d’une moelle isolée de souris, où la diaphyse contient essentiellement de la moelle rouge, un autre problème est que, une fois extrait de l’os, le tissu ne reste pas cohésif. Cependant, Shin et ses collaborateurs ont réussi à mesurer la rigidité de la moelle de la souris par diaphyse à l’aide de la microscopie à force atomique et ont trouvé une valeur de_moelle E = 0,3 ± 0,1 kPa, ce qui place la moelle parmi les tissus les plus mous⁶.

L’intérêt de la procédure décrite ici est de comparer le comportement des mégacaryocytes en milieu liquide à celui de l’hydrogel. En milieu liquide, les cellules ont toutes sédimenté au fond du puits, en contact avec la surface plastique rigide et parfois avec d’autres cellules. En revanche, les cellules incorporées dans l’hydrogel de méthylcellulose sont réparties de manière homogène dans le gel et sont entièrement isolées des autres cellules(Figure 3A). Par conséquent, ils sont soumis essentiellement à des signaux mécaniques fournis par le confinement, à l’exclusion de la communication juxtacrine. La stimulation paracrine ne peut pas être totalement exclue. Néanmoins, les cellules incorporées dans l’hydrogel de méthylcellulose sont éloignées les unes des autres contrairement à la situation dans la moelle osseuse et nous pouvons donc supposer que si les substances sécrétées atteignent les cellules voisines, elles pourraient être très diluées.

La méthode est facile à mettre en place et ne nécessite pas de compétences spécifiques. La méthylcellulose est un gel physique dont les chaînes polymères forment des réticulations non covalentes. Étant liquide à basse température, il se fige lors de l’augmentation de la température (voir l’article d’Aguilar et al. 2016⁹ pour plus d’informations sur la caractérisation des propriétés mécaniques du gel). Cet état de gel peut être facilement inversé après dilution en solution aqueuse, ce qui permet une récupération facile des cellules, qu’elles soient fixées en gel ou en tant que cellules vivantes.

Un facteur critique ici est la rigidité de l’hydrogel. Le volume de méthylcellulose approprié doit être distribué très précisément car même un petit changement dans la concentration d’hydrogel peut avoir un impact important sur la rigidité du milieu et donc sur la maturation des mégacaryocytes. Par exemple, il a déjà été démontré que l’augmentation de la concentration de méthylcellulose de 2 à 2,5% augmentait la rigidité du gel (module de Young) de 10 fois. Un piège possible est qu’il n’y a pas de contrôle de qualité facile pour vérifier les propriétés rhéologiques précises de la méthylcellulose dans chaque puits expérimental une fois qu’elle a été ensemencée avec des cellules. Néanmoins, un critère essentiel qui rassurera sur une concentration de gel correcte est la bonne maturation des mégacaryocytes dans l’hydrogel, comme en témoigne leur grande taille à peu près similaire à celle du milieu liquide. Une diminution de leur diamètre moyen pourrait refléter une différenciation défectueuse similaire à celle qui se produit lors de l’augmentation de la rigidité avec 2,5% de méthylcellulose(Figure 3B).

Une autre limitation de la méthode est que la récupération cellulaire de l’hydrogel prend plus de temps que dans la culture classique car il est nécessaire de diluer d’abord le gel avant la centrifugation. Si la méthylcellulose doit être totalement éliminée, par exemple pour obtenir du lysate cellulaire pour une procédure ultérieure de transfert occidental ou d’isolement de l’ARN, une étape de lavage supplémentaire peut être nécessaire, au cours de laquelle des modifications peuvent se produire dans les protéines ou l’ARN (déphosphorylation des protéines, dégradation de l’ARN...).

Un point critique à considérer dans la procédure est le nombre de cellules qui doit être égal dans chaque condition. Ce n’est pas si trivial puisque dans la culture liquide, les cellules ont tendance à sédimenter au fond du puits et certaines d’entre elles adhèrent à la surface du plastique, ce qui n’est pas le cas pour les cellules en suspension dans l’hydrogel. Un piège est une collecte incomplète des cellules à l’état liquide, ce qui entraîne une teneur en cellules différente entre « liquide » et « hydrogel » après suspension dans un milieu liquide au jour 3. Une telle différence peut entraîner des divergences dans les données finales. En tant que point de contrôle, une numération cellulaire peut être effectuée à ce stade avant de réasémer les cellules. Il est préférable de le faire manuellement à l’aide d’un hémocytomètre Nageotte car il est particulièrement approprié pour les cellules plus grandes telles que les mégacaryocytes.

Comme pour toute culture cellulaire primaire, il existe un risque possible de contamination. La contamination est l’explication la plus probable d’une proportion de proplaquettaires inhabituellement faible dans l’état de pré-culture de méthylcellulose, car une petite contamination semble plus difficile à détecter que dans un milieu liquide. Par conséquent, il peut passer inaperçu jusqu’à la quantification des proplaquettaires, conduisant à des résultats trompeurs. Les bonnes pratiques de laboratoire doivent être strictement observées, en particulier lors de l’encapsulation des cellules de méthylcellulose qui nécessite de nombreuses manipulations précises des seringues et des connecteurs. La viabilité des mégacaryocytes doit également être vérifiée avec du bleu de Trypan à l’aide d’une chambre cellulaire de Nageotte pour le comptage manuel avant le réésemage au jour 3.

Dans l’ensemble, le protocole fourni ici décrit un modèle in vitro pour la comparaison entre la culture liquide classique et une culture 3D utilisant de l’hydrogel de méthylcellulose. Il est à noter que ce protocole de culture est décrit pour les cellules Lin primaires^de souris et n’a pas encore été adapté aux cellules humaines. Ce modèle 3D est un outil utile pour étudier l’impact de l’environnement mécanique sur le comportement et la maturation des mégacaryocytes⁹. Il est également possible d’ajouter des composés dans la culture (même sur le gel) pour étudier l’influence des médicaments sur le comportement / maturation des mégacaryocytes et la formation de proplaquettaires. Enfin, en reproduisant les contraintes mécaniques que les cellules peuvent rencontrer dans la moelle osseuse, ce système de culture permet d’investigation de phénotypes anormaux qui n’ont pas pu être observés dans les cultures liquides classiques comme on l’a déjà montré pour les mégacaryocytes Knock Myh9 ^9,13,14.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-gauge needles	Sigma-Aldrich	1001735825
21-gauge needles	BD Microlance	301155
23-gauge needles	Terumo	AN*2332R1
25-gauge neeldes	BD Microlance	300400
4-well culture dishes	Thermo Scientific	144444
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
Cytoclips	Microm Microtech	F/CLIPSH
Cytofunnels equiped with filter cards	Microm Microtech	F/JC304
Cytospin centrifuge	Thermo Scientific		Cytospin 4
Dakopen	Dako
DMEM 1x	Gibco, Life Technologies	41 966-029
DPBS	Life Technologies	14190-094	Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline
EasySep magnets	Stem Cell Technologies	18000
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit	Stem Cell Technologies	19856A	biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads
EDTA	Invitrogen	15575-020
Fetal Bovine Serum	Healthcare Life Science	SH30071.01
Luer lock 1 mL syringes	Sigma-Aldrich	Z551546-100EA	or 309628 syringes from BD MEDICAL
Luer lock syringes connectors	Fisher Scientific	11891120
MC 3%	R&D systems	HSC001
Polylysin coated slides	Thermo Scientific	J2800AMNZ
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Rat serum	Stem Cell Technologies	13551
Recombinant hirudin	Transgène	rHV2-Lys47
Recombinant human trombopoietin (rhTPO)	Stem Cell Technologies	2822	10,000 units/mL
Round bottomed 10 mL plastique tubes	Falcon	352054
Round bottomed 5 mL polystyrene tubes