Name: Megakaryozytenkultur in 3D-Methylcellulose-basiertem Hydrogel zur Verbesserung der Zellreifung und Untersuchung der Auswirkungen von Steifigkeit und Einschluss (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Erfahren Sie die 3D-Kultur von Megakaryozyten in Methylcellulose-Hydrogel zur Untersuchung mechanischer Einflüsse auf Zellreifung und Proplattenbildung. Diese Methode ermöglicht realistischere in-vitro-Bedingungen als Flüssigkultur.

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Die Autoren danken Fabien Pertuy und Alicia Aguilar, die diese Technik zunächst im Labor entwickelt haben, sowie Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Strasbourg), der die viskoelastischen Eigenschaften des Methylcellulose-Hydrogels charakterisierte. Diese Arbeit wurde von ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) und einem ARN-Stipendium (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics) unterstützt. Julie Boscher ist Empfängerin der Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-Förderkennzeichen FDT202012010422).

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</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

In den letzten zehn Jahren hat die Mechanobiologie in vielen Bereichen der Biologie immer mehr Interesse geweckt. Es ist jetzt allgemein anerkannt, dass die mechanische Umgebung, die die Zellen umgibt, eine Rolle in ihrem Verhalten spielt, was die Bedeutung der Untersuchung betont, wie Megakaryozyten extrazelluläre mechanische Hinweise wahrnehmen und darauf reagieren. Es ist schwierig, die Steifigkeit des Knochenmarkgewebes in situ11genau zu messen, insbesondere wenn wir das hämatopoetisc...

Zellen im Körper erleben eine komplexe 3D-Mikroumgebung und sind dem Zusammenspiel zwischen chemischen und mechanophysikalischen Hinweisen ausgesetzt, einschließlich Steifigkeit aus dem Gewebe und Einschluss aufgrund benachbarter Zellen und der umgebenden Matrix 1,2,3. Die Bedeutung von Steifheit und Einschluss für das Zellverhalten wurde erst in den letzten Jahrzehnten erkannt. Im Jahr 2006 hob die bahnbrechende Arbeit von Engler et al. 4 die Bedeutung der mechanischen Umgebung für die Zelldifferenzierung hervor. Die Autoren zeigten, dass die Variation der Zellsubstratsteifigkeit zur Orientierung von Stammzellen auf verschiedene Differenzierungslinien führte. Seitdem wird der Einfluss mechanischer Hinweise auf das Schicksal und Verhalten von Zellen zunehmend erkannt unduntersucht. Obwohl es eines der weichsten Gewebe des Organismus ist, hat das Knochenmark eine 3D-Strukturorganisation, die im Knochen eingeschlossen ist. Die Marksteifigkeit, obwohl technisch schwierig, genau zu messen, wird auf 15 bis 300 Pa geschätzt 5,6. Innerhalb des Stromas sind die Zellen eng aufeinander beschränkt. Darüber hinaus wandern die meisten von ihnen in Richtung der Sinusoidgefäße, um in den Blutkreislauf einzudringen. Diese Bedingungen erzeugen zusätzliche mechanische Einschränkungen für benachbarte Zellen, die sich an diese Kräfte anpassen müssen. Mechanische Hinweise stellen einen wichtigen Parameter dar, dessen Konsequenzen für die Megakaryozytendifferenzierung und Proplatletbildung erst kürzlich erforscht wurden. Obwohl Megakaryozyten in vitro in traditioneller Flüssigkultur differenzieren können, erreichen sie nicht den in vivobeobachteten Reifegrad, was zum Teil auf das Fehlen der mechanischen Hinweise aus der 3D-Umgebung zurückzuführen ist 7. Wachsende Vorläufer, die in Hydrogel eingebettet sind, bringen mechanische 3D-Hinweise, die im flüssigen Milieu fehlen.
Hydrogele werden seit mehreren Jahrzehnten im hämatologischen Bereich häufig eingesetzt, insbesondere um Zellen in koloniebildenden Assays zur Quantifizierung hämatopoetischer Vorläufer zu züchten. Solche Hydrogele wurden jedoch selten verwendet, um den biologischen Einfluss der mechanischen 3D-Umgebung auf die Reifung und Differenzierung hämatopoetischer Zellen zu untersuchen. In den letzten Jahren hat unser Labor ein 3D-Kulturmodell mit einem Hydrogel 8auf Methylcellulosebasis entwickelt. Dieses nicht reaktive physikalische Gel ist ein nützliches Werkzeug, um die physikalischen Einschränkungen der nativen Megakaryozytenumgebung nachzuahmen. Es wird aus Cellulose durch Ersatz von Hydroxylresten (-OH) durchMethoxidgruppen (-OCH3) gewonnen. Sowohl der Grad der Methylsubstitution als auch die Methylcellulosekonzentration bestimmen die Hydrogelsteifigkeit nach der Jellifikation. Während der Entwicklungsphase dieser Technik wurde gezeigt, dass ein Elastizitätsmodul im Bereich von 30 bis 60 Pa die optimale Gelsteifigkeit für das Megakaryozytenwachstum ist 9.
Das folgende Protokoll beschreibt eine Methode zur Züchtung von megakaryozytären Vorläuferzellen der Maus in einem 3D-Methylcellulose-Hydrogel. Es wurde bereits gezeigt, dass diese Hydrogelkultur im Vergleich zur Standardflüssigkeitskultur den Grad der Megakaryozytenpolyploidisierung erhöht, die Reifung und intrazelluläre Organisation verbessert und die Fähigkeit von Megakaryozyten erhöht, Proplatele zu verlängern, sobald sie in einem flüssigen Medium resuspendiert sind 9. Dieses Manuskript beschreibt detailliert das Protokoll für die Isolierung von Lin−-Zellen aus dem Knochenmark der Maus und deren Einbettung in ein Methylcellulose-Hydrogel für die 3D-Kultur sowie die Quantifizierung ihrer Fähigkeit, Proplatelets herzustellen und die Rückgewinnung der Zellen für weitere Analysen.

<table><tbody><tr><td>18-Gauge-Nadeln</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001735825</td><td></td></tr><tr><td>21-Gauge-Nadeln</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>23-Gauge-Nadeln</td><td>Terumo</td><td>AN*2332R1</td><td></td></tr><tr><td>25-Gauge-Nadeln</td><td>BD Microlance</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>4-Well-Kulturschalen</td><td>Thermo Scientific</td> 144444 5-mL-Spritzen <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Terumo</td><td>SS+05S1</td><td></td></tr><tr><td>Cytoclips</td><td>Microm Microtech</td><td>F/CLIPSH</td><td></td></tr><tr><td>Zytotrichter mit Filterkarten</td><td>Microm Microtech</td><td>F/JC304</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Cytospin 4</td></tr><tr><td>Dakopen</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>41 966-029</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>Steriles Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>EasySep Magnete</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Maus Hämatopoetische Vorläuferzell-Isolationskit</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>19856A</td><td>biotinylierte Antikörper (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7&ndash; 4) und Streptavidin-beschichtete magnetische Kügelchen</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gesundheitswesen Life Science</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lock 1 mL Spritzen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z551546-100EA</td><td>oder 309628 Spritzen von BD MEDICAL</td></tr><tr><td>Luer-Lock Spritzen Konnektoren</td><td>Fisher Scientific</td><td>11891120</td><td></td></tr><tr><td>MC 3%</td><td>R& Ampere; D systems</td><td>HSC001</td><td></td></tr><tr><td>Polylysin-beschichtete Objektträger</td><td>Thermo Scientific</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PSG 100x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>1037-016</td><td>10.000 Einheiten/ml Penicillin, 10.000 &mu; g/mL Streptomycin und 29,2 mg/ml Glutamin</td></tr><tr><td>Rattenserum</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>13551</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes Hirudin</td><td>Transg&egrave; ne</td><td>rHV2-Lys47</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes Trombopoietin (rhTPO)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>2822</td><td>10.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>10 mL Kunststoffröhrchen mit rundem Boden</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polystyrolröhrchen</td><td></td><td></td><td></td> mit rundem Boden</tr></tbody></table>

megakaryozytenkultur in 3d-methylcellulose-basiertem hydrogel zur verbesserung der zellreifung und untersuchung der auswirkungen von steifigkeit und einschluss

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

Die 3D-Umgebung, die sowohl zu Einschluss als auch zu mechanischen Einschränkungen führt, wird zunehmend als wichtige Determinante des Zellverhaltens erkannt. Die 3D-Kultur wurde daher entwickelt, um sich der In-vivo-Situation besser zu nähern. Megakaryozyten unterscheiden sich von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) im Knochenmark (BM). Der BM ist eines der weichsten Gewebe des Körpers, das im Knochen eingeschlossen ist. Da der Knochen auf der Zellskala schlecht dehnbar ist, werden Megakaryozyten gleichzeitig einer schwachen Steifigkeit und einer hohen Einschließung ausgesetzt. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Rückgewinnung von mouse lineage negative (Lin-) HSPCs durch immunmagnetische Sortierung und deren Differenzierung in reife Megakaryozyten in einem 3D-Medium aus Methylcellulose dar. Methylcellulose ist gegenüber Megakaryozyten nicht reaktiv und ihre Steifigkeit kann an die eines normalen Knochenmarks angepasst oder erhöht werden, um ein pathologisches fibrotisches Knochenmark nachzuahmen. Der Prozess zur Gewinnung der Megakaryozyten für weitere Zellanalysen ist ebenfalls im Protokoll detailliert beschrieben. Obwohl die Proplatelet-Erweiterung innerhalb des 3D-Milieus verhindert wird, wird im Folgenden beschrieben, wie die Megakaryozyten in flüssigem Medium resuspendiert und ihre Fähigkeit, Proplatelets zu verlängern, quantifiziert werden können. Megakaryozyten, die in 3D-Hydrogel gezüchtet werden, haben eine höhere Fähigkeit, Proplatelette zu bilden, verglichen mit denen, die in einem flüssigen Milieu gezüchtet werden. Diese 3D-Kultur ermöglicht es, i) Vorläufer in Richtung Megakaryozyten zu differenzieren, die einen höheren Reifezustand erreichen, ii) Phänotypen zu rekapitulieren, die in vivo beobachtet werden können, aber in klassischen flüssigen Kulturen unbemerkt bleiben, und iii) Transduktionswege zu untersuchen, die durch die mechanischen Hinweise einer 3D-Umgebung induziert werden.

Die mit diesem Protokoll erhaltenen Daten wurden ursprünglich 2016 in Blood veröffentlicht9.
Gemäß dem Protokoll wurden die Zellen entweder in flüssigem oder Methylcellulose-Hydrogel-Medium ausgesät. Zellen in flüssigem Medium haben sich alle am Boden des Brunnens sedimentiert, in Kontakt mit der steifen Kunststoffoberfläche und manchmal mit anderen Zellen. Im Gegensatz dazu sind zellen, die in Methylcellulosehydrogel eingebettet sind, homogen im Gel verteilt und werden...

Es ist jetzt anerkannt, dass die dreidimensionale Umgebung von Zellen eine wichtige Rolle bei ihrem Verhalten, ihrer Reifung und / oder Differenzierung spielen kann. Dieses Protokoll beschreibt ein dreidimensionales Zellkulturmodell, das entwickelt wurde, um die Auswirkungen von physikalischer Eindämmung und mechanischen Einschränkungen auf Megakaryozyten zu untersuchen.

Megakaryozytenkultur in 3D-Methylcellulose-basiertem Hydrogel zur Verbesserung der Zellreifung und Untersuchung der Auswirkungen von Steifigkeit und Einschluss

The 3D environment leading to both confinement and mechanical constraints is increasingly recognized as an important determinant of cell behavior. 3D ...

Dieses Protokoll ermöglicht eine In-vitro-Bewertung der Auswirkungen von Einschluss und mittlerer Steifigkeit, denen native Megakaryozyten im Knochenmark ausgesetzt sind, auf ihr Verhalten und ihre Reifung. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ein vereinfachtes Modell, das Zell-Zell- und Zellmatrix-Interaktionen eliminiert und sich auf die mechanischen Aspekte konzentriert. Gute Laborpraxis und sterile Arbeitsbedingungen sind strikt einzuhalten.Tatsächlich kann selbst eine leichte Kontamination des Hydrogels einen dramatischen Einfluss auf die Differenzierung der Megakaryozyten haben. Um eine einzelne Vertiefung der Hydrogel-Zellkultur zu erhalten, beginnen Sie mit dem Auftauen von zwei Ein-Milliliter-Aliquoten von 3% Methylcellulose bei Raumtemperatur, dann beschichten Sie eine Ein-Milliliter-Luer-Lock-Spritze mit der Methylcellulose, indem Sie zuerst einen Milliliter ziehen und dann alles ausstoßen. Als nächstes ziehen Sie mit derselben Spritze und Nadel 333 Mikroliter Methylcellulose aus einem frischen Aliquot.Nachdem Sie die Nadel vorsichtig entfernt haben, schrauben Sie mit einer sterilisierten Pinzette einen Luer-Lock-Anschluss an das Ende der Spritze und befestigen Sie dann eine zweite unbeschichtete Luer-Lock-Spritze mit einem Milliliter am Stecker. Verteilen Sie die Methylcellulose gleichmäßig auf die beiden Spritzen und legen Sie sie beiseite. Als nächstes resuspendieren sie die zuvor isolierten negativen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen der Mauslinie im konzentrierten Kulturmedium mit einer Dichte von einmal 10 zu den sechs Zellen pro 167 Mikroliter.Trennen Sie eine der Spritzen vom Stecker und pipettieren Sie 167 Mikroliter der Zellsuspension direkt in den Verbinder, während Sie gleichzeitig den Spritzenkolben langsam ziehen, um Platz für die Zellsuspension zu schaffen. Nachdem Sie die gesamte Zellsuspension in den Verbinder gegeben haben, ziehen Sie den Kolben weiter, um die Aufhängung vom Stecker zu ziehen, und schließen Sie die zweite Spritze vorsichtig wieder an, wobei Sie darauf achten, dass keine Aufhängung im Schraubgewinde verloren geht. Um das Methylcellulosemedium mit der Zellsuspension zu homogenisieren, bewegen Sie die Kolben langsam 10 Mal zwischen den beiden Spritzen hin und her, ziehen Sie dann das Gesamtvolumen in eine Spritze und trennen Sie die beiden Spritzen, wobei Sie den Stecker auf der leeren belassen.Leeren Sie den Inhalt der Spritze in eine Vertiefung einer Vier-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad unter 5% Kohlendioxid. Um Proplatelets zu analysieren, werden am dritten Tag der Kultur alle Zellen vorsichtig von einer Vertiefung in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Milliliter DMEM mit 1% PSG übertragen. Resuspendieren Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren, um die Methylcellulose vollständig zu verdünnen, und zentrifugieren Sie dann das Röhrchen fünf Minuten lang bei 300 mal G bei Raumtemperatur.Nach dem Verwerfen des Überstandes wird das Zellpellet in einem Milliliter des vollständigen Kulturmediums resuspendiert und die Zellen mit 500 Mikrolitern pro Vertiefung einer Vier-Well-Platte erneut ausgesät. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid. Am nächsten Tag erfassen Sie mit einem Hellfeldmikroskop mit einem 20-fachen Objektiv nach dem Zufallsprinzip 10 Bilder pro Vertiefung, um sicherzustellen, dass nicht zu viele Zellen im Sichtfeld vorhanden sind und mindestens fünf Megakaryozyten pro Feld erfasst werden.Zählen Sie mit ImageJ die Gesamtzahl der Megakaryozyten und der sich verlängernden Proplatelets in jedem Bild, um den Anteil der Megakaryozyten zu berechnen, die Proplatelets verlängern. Um die Zellen für zukünftige Analysen zu fixieren, fügen Sie die fixierende Lösung auf die Methylcellulose auf, ohne das Gel zu stören. Nachdem Sie je nach verwendetem Fixiermittel eine angemessene Zeit abgewartet haben, verwenden Sie eine P1000-Pipette, um das Fixiermittel und das Gel vorsichtig zu pipettieren, bis die Methylcellulose homogen verdünnt ist.Und mit der gleichen Pipettenspitze den gesamten Inhalt der Vertiefung in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Milliliter DPBS geben und durch Mischen homogenisieren. Zentrifugieren Sie die Mischung. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Megakaryozytenpellet in einem für die gewünschte Analyse geeigneten Medium.Am dritten Tag der Kultur haben sich Megakaryozyten im flüssigen Medium am Boden des Bohrlochs sedimentiert und stehen in Kontakt mit der steifen Kunststoffoberfläche sowie anderen Zellen. Im Gegensatz dazu sind Zellen, die in das Methylcellulose-Hydrogel eingebettet sind, homogen verteilt und von benachbarten Zellen isoliert. Eine Analyse des mittleren Durchmessers von Megakaryozyten unter verschiedenen Kulturbedingungen zeigt, dass 2% Methylcellulose den mittleren Megakaryozytendurchmesser im Vergleich zur Flüssigkultur leicht erhöht.Eine Erhöhung der Methylcellulosekonzentration um 0,5% beeinträchtigt jedoch die Megakaryozytendifferenzierung, wie ein kleinerer mittlerer Durchmesser zeigt. In repräsentativen Transmissionselektronenmikroskopiebildern scheinen die intrazytoplasmatischen Membranen in Megakaryozyten, die in vivo im Knochenmark differenziert sind, eng mit abgegrenzten zytoplasmatischen Territorien kontrastiert zu sein. In flüssiger Kultur haben die Membranen meist ein kleines rundes ovales Aussehen oder längliche Vesikel ohne Abgrenzung von zytoplasmatischen Territorien.Im Gegensatz dazu hat die 2%ige Methylcellulosekultur dicht gegenüberliegende Membranen mit abgrenzenden zytoplasmatischen Territorien, die der In-situ-Struktur ähneln. Am vierten Tag der Kultur zeigen Megakaryozyten, die zuvor in Hydrogel kultiviert wurden, eine erhöhte Proplatletbildung im Vergleich zu denen, die in flüssigem Medium kultiviert wurden. Der mittlere Anteil an Megakaryozyten-verlängernden Proplaten beträgt bei einer flüssigen Präkultur in der Regel etwa 15 bis 20% im Vergleich zu 35 bis 40% mit einer Methylcellulose-Hydrogel-Präkultur.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die entsprechenden Volumina sehr genau zu pipettieren, da eine geringfügige Änderung der endgültigen Methylcellulosekonzentration die Mediensteifigkeit erheblich verändern kann. Nach der Zellreifung im Hydrogel können Megakaryozyten für die Ploidie und Zellmarkeranalyse durch Durchflusszytometrie gewonnen oder für die Elektronenmikroskopie oder Immunfärbung des interessierenden Proteins fixiert werden.

megakaryocyte-culture-3d-methylcellulose-based-hydrogel-to-improve

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Biologie

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Megakaryozytenkultur in 3D-Methylcellulose-basiertem Hydrogel zur Verbesserung der Zellreifung und Untersuchung der Auswirkungen von Steifigkeit und Einschluss (Video) | JoVE Journal

Megakaryozytenkultur in 3D-Methylcellulose-basiertem Hydrogel zur Verbesserung der Zellreifung und Untersuchung der Auswirkungen von Steifigkeit und Einschluss

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