Färbung des Cytoplasma Ca2+ mit Fluo-4/AM in Apfelzellstoff

Zusammenfassung

Isolierte Protoplasten von Apfelpulpazellen wurden mit einem kalziumfluoreszierenden Reagenz beladen, um eine zytoplasmatische^{Ca2+-Konzentration} nachzuweisen.

Zusammenfassung

Zytosolisches Ca²⁺ spielt eine Schlüsselrolle bei der Pflanzenentwicklung. Die Calcium-Bildgebung ist die vielseitigste Methode, um dynamische Veränderungen von Ca²⁺ im Zytoplasma zu erkennen. In dieser Studie erhielten wir lebensfähige Protoplasten von Pulpazellen durch enzymatische Hydrolyse. Isolierte Protoplasten wurden mit dem niedermolekularen fluoreszierenden Reagenz (Fluo-4/AM) für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die fluoreszierenden Sonden färbten erfolgreich zytosolisches Ca^2+, sammelten sich aber nicht in Vakuolen an. La³⁺, ein Ca²⁺ Kanalblocker, verringerte die zytoplasmatische Fluoreszenzintensität. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Fluo-4 / AM verwendet werden kann, um Veränderungen des zytosolischen Ca²⁺ im Fruchtfleisch zu erkennen. Zusammenfassend stellen wir eine Methode vor, um Protoplasten effektiv aus Fleischzellen der Frucht zu isolieren und Ca²⁺ nachzuweisen, indem ein niedermolekulares Calciumfluoreszenzreagenz in das Zytoplasma von Pulpazellen geladen wird.

Einleitung

Ca²⁺ spielt eine wichtige Rolle bei der signaltransduktion und im Stoffwechsel^1,2. Darüber hinaus reguliert es die Fruchtqualitätsmerkmale^3,4 , einschließlich^Härte,Zuckergehalt und Anfälligkeit für physiologische Störungen während der Lagerung^5,6. Cytoplasmatisches Ca²⁺ spielt eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion und reguliert das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen⁷. Störung der zellulären Calciumhomöostase kann bittere Gruben in Äpfeln⁸, Braunfleckenkrankheit in Birnen⁹und Nabelschnurfäule in Tomaten¹⁰induzieren , die die Fruchtqualität beeinträchtigen und schwere wirtschaftliche Verluste verursachen^3,11. Die Calciumbildgebung hat eine ausreichende räumliche und zeitliche Auflösung und ist eine wichtige Methode zur Beobachtung der Ca²⁺ Dynamik in lebenden Zellen^12,13.

Derzeit gibt es zwei Hauptmethoden für die intrazelluläre Kalziumbildgebung in lebenden Zellen: Eine verwendet chemische kleinmolekulare Fluoreszenzsonden¹⁴und die andere ist der Genkodierungssensor (GECI)^15,16. Angesichts der Schwierigkeit, ein stabiles transgenes System in Obstbäumen und einer längeren Fruchtentwicklung aufzubauen, ist GECI_S für die Fluoreszenzbildgebung von Früchten Ca²⁺ ungeeignet.

Niedermolekulare Fluoreszenzsonden wie Fluo-4/AM haben einen besonderen Vorteil: Ihre AM-Esterform (zelldurchlässiges Acetoxymethylesterderivat) kann ohne Transfektion leicht in lebende Zellen geladen werden, was sie flexibel, schnell und nicht zytotoxisch macht¹⁷. Fluo-4/AM konnte erfolgreich in die Pollenröhre von Pyrus pyrifolia¹⁸ und Petunia,¹⁹ sowie in die Schließzellen²⁰ und Wurzelhaare von Arabidopsis²¹geladen werden.

Derzeit gibt es nur wenige Berichte über die Calciumfluoreszenzfärbung von Zellstoffzellen²². Als wichtiger Mineralstoff spielt Kalzium eine Schlüsselrolle beim Wachstum und der Qualitätskontrolle von Baumfrüchten wie Äpfeln. Apfelbäume sind weltweit als wichtige Wirtschaftsart anerkannt, und Äpfel gelten als gesundes Lebensmittel²³. In dieser Studie erhielten wir lebensfähige Protoplasten aus Apfelfruchtfleisch durch enzymatische Hydrolyse und luden dann niedermolekulare fluoreszierende Reagenzien in das Zytoplasma, um Ca²⁺nachzuweisen.

Protokoll

1. Protoplastenextraktion

1. Bereiten Sie die Basislösung vor: 20 mM CaCl_2,5 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure und 0,4 M D-Sorbit.
   HINWEIS: Der pH-Wert der Basislösung wurde mit 0,1 M Tris-Puffer auf 5,8 eingestellt, durch 0,22 μm wasserlösliche Filter filtriert und bei 4 °C gelagert.
2. Bereiten Sie die enzymatische Lösung vor: Mischen Sie 0,3% (w / v) Macerozym R-10 und 0,5% (w / v) Cellulase R-10 mit der Basislösung.
3. 0,5 ml enzymatische Lösung werden in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen gegeben. Pflücken Sie einen gesunden und reifen Apfel. Dann schneiden Sie das Fruchtfleisch in 10 x 5 x 1 mm³ Größe (Abbildung 1A-1C).
4. Die Fruchtfleischstücke in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit enzymatischer Lösung geben und dann das Röhrchen schließen (Abbildung 1D).
5. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 28 °C für 1 h und schütteln Sie es mit 70 U / min in einem Shaker im Dunkeln.
6. Waschen Sie die Zellstoffstücke. Saugen Sie die gesamte enzymatische Lösung ab und fügen Sie dann 0,5 ml der Basislösung hinzu.
7. Zentrifuge bei 300 x g für 2 min bei Raumtemperatur.
8. Um eine Protoplastensuspension zu erhalten, saugen Sie die Lösung vom Boden des Zentrifugenröhrchens ab (Abbildung 1E).

2. Niedermolekulare Calciumionenfluoreszenzfärbung

1. Bereiten Sie die Fluo-4/AM-Ladelösung mit 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127 und 10x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS:80 mM_Na2HPO_4,1,36 M NaCI, 20 mM KH₂PO₄und 26 mM KCI) im Verhältnis 1:1:2 vor.
2. 1 μL Fluo-4/AM-Ladelösung wird zu 99 μL der Protoplastensuspension in den 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen hinzugefügt. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration des Fluoreszenzfarbstoffs 5 μM beträgt. Mischen Sie die Lösung und schließen Sie dann die Tube.
3. La³⁺ Behandlung: Bereiten Sie 100 μM La³⁺ Lösung mit 98 μL der Protoplastensuspension, 1 μL von 10 mM La³⁺und 1 μL Fluo-4/AM-Ladelösung vor. Mischen Sie die Lösung und schließen Sie die Tube.
4. 30 min bei 37 °C im Dunkeln inkubieren.
5. Waschen Sie die Protoplasten durch Zentrifugation bei 300 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Saugen Sie 70 μL der Lösung an und fügen Sie 70 μL der Basislösung hinzu.
6. Inkubieren Sie die Protoplastensuspension bei 37 °C für 30 min, um sie vollständig zu entestern.
7. 15 μL der Protoplastensuspension absaugen und auf einen Objektträger tropfen.
8. Unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachten (Ergänzende Abbildung S1).
   HINWEIS: Verwenden Sie eine Farbkamera mit hoher Empfindlichkeit, d. h. 3,2 MP (2048 x 1536) CMOS-Sensor mit 3,45 μm Pixelauflösung.
9. Wählen Sie den GFP-Kanal für die Bildgebung (20x). Stellen Sie die Helligkeit auf 0,5 ein.
   HINWEIS: Beleuchtung ist einstellbare Intensität LED-Lichtwürfel mit einem integrierten hart beschichteten Filterset. Die Anregungswellenlänge von Fluo-4/AM beträgt 490 nm.

3. Protoplast-Lebensfähigkeitstest

1. Bereiten Sie die Fluoresceindiacetat (FDA) Stammlösung vor: FDA in Aceton auflösen, bis die Endkonzentration 1 mg / ml beträgt.
2. Bereiten Sie die FDA-Arbeitslösung mit 1 μL der Stammlösung und 99 μL Aceton vor.
3. Fügen Sie 1 μL FDA-Arbeitslösung zu 99 μL Protoplastensuspension hinzu. Mischen Sie die Lösung durch Pipettieren nach oben und unten und schließen Sie dann das Rohr.
   HINWEIS: Die Endkonzentration der FDA beträgt 100 μg/L.
4. Bei Raumtemperatur 5 min im Dunkeln einfärben.
5. Bereiten Sie die Objektträger vor und beobachten Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop.
6. Wählen Sie den GFP-Kanal für die Bildgebung aus (Abbildung 1F).

4. Bildanalyse

1. Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder mit Bildanalyse- und Tabellenkalkulationssoftware (z. B. Image-Pro Plus und Excel 2010).
2. Wählen Sie zwei vertikale Durchmesser aus den Protoplasten aus, um die Fluoreszenzintensität zu berechnen (Ergänzende Abbildung S2). Messung der Fluoreszenzintensität aller Protoplasten unter verschiedenen Behandlungen wurde gemessen. Für die endgültige Verarbeitung verwenden Sie eine Fotobearbeitungssoftware.

5. Statistische Auswertung

1. Führen Sie statistische Analysen mit statistischer Software durch (Ergänzende Abbildung S3). Die Daten werden in Mittelwert ± SD dargestellt. Der t-Testdes Schülers wurde verwendet, um die Unterschiede zwischen den experimentellen Gruppen zu analysieren.

Ergebnisse

Nach dem oben beschriebenen Protokoll haben wir die enzymatische Methode verwendet, um lebensfähige Protoplasten aus der Pulpa zu erhalten (Abbildung 1). Einige Protoplasten hatten Vakuolen, andere nicht. Während die Protoplasten keine Fluoreszenz zeigten, wenn der Ca²⁺ Fluoreszenzindikator nicht in sie geladen wurde. Wenn Fluo-4/AM in die Protoplasten geladen wurde, wurde das Zytoplasma, aber nicht die Vakuole, fluoreszierend (Abbildung 2). Dieses Er...

Diskussion

In dieser Studie wurden lebensfähige Protoplasten durch enzymatische Hydrolyse gewonnen. Beachten Sie, dass diese Methode frische Äpfel erfordert. Das vorliegende Protokoll ermöglicht die schnelle Isolierung einer großen Anzahl von Protoplasten aus Fruchtfleisch für den Einsatz in Forschungsstudien. Die Anwendbarkeit dieser Methode ist nicht auf "Fuji" beschränkt; die Protoplasten des Apfelmarks von 'Dounan' und 'Honey Crisp' können ebenfalls über dasselbe Protokoll extrahiert werden (Ergänzende Abbildung S4

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10-fache phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Solarbio	P1022	PBS (phosphatgepufferte Lösung) ist eine Phosphatpufferlösung, die eine relativ stabile ionenische Umgebung und pH-Pufferkapazität bieten kann. Es ist eine Puffersalzlösung, die in der Biologie häufig für die molekulare Klonierung und Zellkultur verwendet wird. Der pH-Wert liegt bei 7,4.
2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure	Solarbio	M8010	Biologischer Puffer
CaCl2· 2H2O	Solarbio	C8370	Calciumchlorid-Dihydrat ist eine weiße oder graue Chemikalie, meist in körniger Form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Baut pflanzliche Zellwände ab.
D-Sorbit	Solarbio	S8090	Es hat gute feuchtigkeitsspendende Eigenschaften, verhindert das Austrocknen und verhindert, dass Zucker, Salz usw. kristallisieren.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 ist ein nichtionisches Tensidpolyol (Molekulargewicht von ca. 12500 Dalton), das sich als vorteilhaft erwiesen hat, um die Auflösung von wasserunlöslichen Farbstoffen und anderen Materialien in physiologischen Medien zu fördern.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA ist ein zellpermeiertes Esterase-Substrat, das als Viabilitätssonde dienen kann, die sowohl die enzymatische Aktivität misst, die zur Aktivierung ihrer Fluoreszenz erforderlich ist, als auch die Integrität der Zellmembran, die für die intrazelluläre Retention ihres fluoreszierenden Produkts erforderlich ist.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	Der grün fluoreszierende Calciumindikator Fluo-4/AM ist eine verbesserte Version des Calciumindikators Fluo-3/AM. Das Fluo-4/AM lädt schneller und ist bei gleicher Konzentration heller. Er lässt sich gut mit einem 488 nm Argon-Ionenlaser anregen.
Fluoreszenzmikroskop	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Beobachten Sie das Fluoreszenzbild.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Baut pflanzliches Gewebe ab, um einzelne Zellen zu trennen.
Tris	Solarbio	T8060	Es wird häufig bei der Herstellung von Puffern in biochemischen und molekularbiologischen Experimenten verwendet.