Wir beschreiben ein Protokoll, um aus Makrophagen gewonnene kleine extrazelluläre Vesikel mit PKH-Farbstoffen zu kennzeichnen und ihre Aufnahme in vitro und im Rückenmark nach intrathekaler Entbindung zu beobachten.
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Methodenartikel
Aufnahme fluoreszierender markierter kleiner extrazellulärer Vesikel in vitro und im Rückenmark
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) sind 50-150 nm Vesikel, die von allen Zellen abgesondert werden und in Körperflüssigkeiten vorhanden sind. sEVs übertragen Biomoleküle wie RNA, Proteine und Lipide von Donor- zu Akzeptorzellen und sind damit wichtige Signalvermittler zwischen Zellen. Im zentralen Nervensystem (ZNS) können sEVs interzelluläre Signalübertragungen vermitteln, einschließlich Neuroimmuninteraktionen. sEV-Funktionen können untersucht werden, indem die Aufnahme von markierten sEVs in Empfängerzellen sowohl in vitro als auch in vivoverfolgt wird. Dieser Artikel beschreibt die Markierung von sEVs aus den konditionierten Medien von RAW 264.7-Makrophagenzellen unter Verwendung eines PKH-Membranfarbstoffs. Es zeigt die Aufnahme unterschiedlicher Konzentrationen markierter sEVs zu mehreren Zeitpunkten durch Neuro-2a-Zellen und primäre Astrozyten in vitro. Ebenfalls gezeigt wird die Aufnahme von sEVs, die intrathekal in Rückenmarksneuronen, Astrozyten und Mikroglia der Maus abgegeben werden, die durch konfokale Mikroskopie visualisiert werden. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen zeitabhängige Variationen in der Aufnahme von sEVs durch verschiedene Zellen, was dazu beitragen kann, eine erfolgreiche sEVs-Abgabe in das Rückenmark zu bestätigen.
Einleitung
Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) sind nanogroße, membranbasierte Vesikel mit einem Größenbereich von 50-150 nm. Sie stammen aus multi-vesikulären Körpern (MVBs) und werden bei der Fusion der MVBs mit der Plasmamembran aus Zellen freigesetzt. sEVs enthalten miRNAs, mRNAs, Proteine und bioaktive Lipide, und diese Moleküle werden in Form von Zell-zu-Zell-Kommunikation zwischen Zellen übertragen. sEVs können von Empfängerzellen durch eine Vielzahl von endozytischen Wegen internalisiert werden, und diese Erfassung von sEVs durch Empfängerzellen wird durch die Erkennung von Oberflächenmolekülen sowohl auf EVs als auch auf den Zielzellenvermittelt 1
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Protokoll
HINWEIS: Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Institutional Animal Care & Use Committee des Drexel University College of Medicine genehmigt. Zeitschwangere CD-1-Mäuse wurden für die astrozytäre Kultur verwendet, und alle Dämme wurden 15 Tage nach der Imprägnierung erhalten. Zehn bis zwölf Wochen alte C57BL/6-Mäuse wurden für In-vivo-Aufnahmeexperimente verwendet.
1. Isolierung von sEVs aus RAW 264.7 Makrophagenzellen
- Kultur RAW 264,7 Zellen in 75 cm2 Kolben in DMEM Exosomen-erschöpftem Medium mit 10% Exosomen-depleted f....
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Ergebnisse
Nach der Isolierung von sEVs aus RAW 264.7-konditionierten Medien durch Zentrifugation wurde NTA verwendet, um die Konzentration und Größenverteilung der gereinigten sEVs zu bestimmen. Die durchschnittliche mittlere Größe von RAW 264,7-abgeleiteten sEVs betrug 140 nm und die Spitzenpartikelgröße betrug 121,8 nm, was bestätigt, dass die meisten nachweisbaren Partikel in der Lichtstreumessung in den Größenbereich von Exosomen oder sEVs bei 50-150 nm fielen (Abbildung 1A). Wie in den minimalen .......
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Diskussion
In diesem Protokoll zeigten wir die Markierung von sEVs mit PKH-Farbstoffen und die Visualisierung ihrer Aufnahme im Rückenmark. PKH lipophile Fluoreszenzfarbstoffe werden häufig zur Markierung von Zellen durch Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie3,5,6,12,24,25verwendet. Aufgrund ihrer relativ langen Halbwertszeit .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Studie wurde durch Zuschüsse von NIH NINDS R01NS102836 und dem Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) unterstützt, die an Seena K. Ajit vergeben wurden. Wir danken Dr. Bradley Nash für die kritische Lektüre des Manuskripts.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Amicon Ultra 0,5 mL Zentrifugalfilter | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antikörper | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antikörper | Abcam | ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antikörper | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoklonaler Antikörper (14C10) | Zellsignalisierung Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Sauric Protein Antikörper | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 für IF; 1:1000 für IHC |
| Anti-Iba1 Antikörper | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antikörper | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Rinderserumalbumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Zellsieb, 40 μ m | VWR | 15-1040-1 | |
| Zentrifugenröhrchen | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12.000 x g |
| Deckglas, 12 mm, #1.5 | Elektronenmikroskopie Sciences | 72230-01 | |
| Deckglas, 18 mm, #1.5 | Elektronenmikroskopie Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µ g/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Desoxyribonuklease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Esel Anti-Kaninchen IgG H& L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Esel Anti-Kaninchen IgG H& L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Mikroskop-Objektträger, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS ohne Calcium und Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosom-abgereichertes fötales Rinderserum | Gibco | A27208-01 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M Bildgebungssystem | ProteinSimple | ||
| FV3000 Konfokales Mikroskop | Olympus | ||
| Ziege Anti-Maus IgG H& L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Ziege Anti-Maus IgG H& L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Ziege Anti-Maus IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | 1:500 |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrat | Thermo Scientific | 34094 | |
| Abfang-Blockierungspuffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Probenpuffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 System | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 Software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a-Zelllinie | ATCC | CCL-131 | |
| Normales Ziegenserum | Vektor Laboratorien | S-1000 | |
| O.C.T. Verbindung | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyd | Elektronenmikroskopie Wissenschaften | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Proteaseinhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF-Transfermembran | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Zelllinie | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Puffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Natriumchlorid | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Objektträger | Thermo Scientific | 15-188-48 | Selbstklebende Objektträger |
| T-75 Flaschen | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digitales Transmissionselektronenmikroskop | FEI Unternehmen | ||
| TEM Grids | Elektronenmikroskopie Wissenschaft | FSF300-cu | |
| Tris-Glycin Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycin SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycin Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | Zelldissoziationsenzym |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0,25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ultrazentrifugenröhrchen | Beckman | 344058 | 110.000 x g |
Referenzen
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641(2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in viv....
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Nachdrucke und Genehmigungen
