Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

Jaimeson Veldhuizen; Mehdi Nikkhah

doi:10.3791/62539

Methodenartikel

Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

DOI:

10.3791/62539

⸱

15. Juni 2021

Jaimeson Veldhuizen¹ , Mehdi Nikkhah¹^,²

¹School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University, ²Biodesign Virginia G. Piper Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Entwicklung eines dreidimensionalen (3D) mikrofluidischen Modells von hoch ausgerichtetem menschlichem Herzgewebe zu erklären und zu demonstrieren, das aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten besteht, die mit Herzfibroblasten (CFs) in einem biomimetischen, kollagenbasierten Hydrogel in Kokulturiert sind, für Anwendungen in der Kardgewebeentwicklung, im Arzneimittelscreening und in der Krankheitsmodellierung.

Zusammenfassung

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Die weltweit häufigste Todesursache bleibt herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD). Die Modellierung der physiologischen und biologischen Komplexität des Herzmuskels, des Myokards, ist jedoch notorisch schwierig in vitro zu erreichen. Hindernisse liegen hauptsächlich in der Notwendigkeit menschlicher Kardiomyozyten (CMs), die entweder erwachsen sind oder erwachsene Phänotypen aufweisen und die zelluläre Komplexität und komplizierte 3D-Architektur des Myokards erfolgreich replizieren können. Leider war aufgrund ethischer Bedenken und des Mangels an primärem, vom Patienten abgeleitetem menschlichem Herzgewebe in Kombination mit der minimalen Proliferation von CMs die Beschaffung lebensfähiger menschlicher CMs ein limitierender Schritt für das Herzgewebe-Engineering. Zu diesem Zweck hat sich die meiste Forschung in Richtung kardialer Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) als primäre Quelle menschlicher CMs entwickelt, was zu einer breiten Einbeziehung von hiPSC-CMs in In-vitro-Assays für die Kardiengewebemodellierung führte.

Hier in dieser Arbeit demonstrieren wir ein Protokoll zur Entwicklung eines 3D-reifen Stammzell-abgeleiteten menschlichen Herzgewebes in einem mikrofluidischen Gerät. Wir erklären und demonstrieren insbesondere die Herstellung eines 3D-in-vitro-anisotropen Herzgewebe-on-a-Chip-Modells aus hiPSC-abgeleiteten CMs. Wir beschreiben in erster Linie ein Reinigungsprotokoll zur Auswahl für CMs, die Co-Kultur von Zellen mit einem definierten Verhältnis durch Mischen von CMs mit menschlichen CFs (hCFs) und die Suspension dieser Co-Kultur innerhalb des kollagenbasierten Hydrogels. Wir demonstrieren außerdem die Injektion des zellbeladenen Hydrogels in unser gut definiertes mikrofluidisches Gerät, eingebettet in versetzte elliptische Mikropfosten, die als Oberflächentopographie dienen, um ein hohes Maß an Ausrichtung der umgebenden Zellen und der Hydrogelmatrix zu induzieren und die Architektur des nativen Myokards nachzuahmen. Wir stellen uns vor, dass das vorgeschlagene anisotrope 3D-Kardiengewebe-on-Chip-Modell für grundlegende biologische Studien, Krankheitsmodellierung und durch seine Verwendung als Screening-Tool für pharmazeutische Tests geeignet ist.

Einleitung

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Tissue Engineering-Ansätze wurden in den letzten Jahren umfassend erforscht, um klinische In-vivo-Befunde in der regenerativen Medizin und Krankheitsmodellierung zu begleiten¹^,². Aufgrund der inhärenten Schwierigkeiten bei der Beschaffung von humanem primärem Herzgewebe und der Herstellung physiologisch relevanter In-vitro-Surrogate wurde insbesondere der In-vitro-Kardgewebemodellierung besondere Bedeutung beigemischt, was das grundlegende Verständnis der komplexen Mechanismen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs) einschränkt¹^,³.

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Protokoll

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Führen Sie die gesamte Zellhandhabung und Reagenzienvorbereitung in einer Biosicherheitswerkbank durch. Stellen Sie sicher, dass alle Oberflächen, Materialien und Geräte, die mit Zellen in Kontakt kommen, steril sind (d. h. mit 70% Ethanol besprühen). Die Zellen sollten in einem befeuchteten 37 °C, 5% CO₂ Inkubator kultiviert werden. Die gesamte hiPSC-Kultur und -Differenzierung erfolgt in 6-Well-Platten.

1. Erstellung mikrofluidischer Geräte (ungefähre Dauer: 1 Woche)

fotolithografie
HINWEIS: Die Maske, die mit der CAD-Datei (als Zusatzdatei 1bereitgestellt) entworfen wurde, enthäl....

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Ergebnisse

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Um eine hochgereinigte Population von CMs aus hiPSCs zu erhalten, wird eine modifizierte Version verwendet, die eine Kombination aus dem Lian-Differenzierungsprotokoll³³ und den Tohyama-Reinigungsschritten³⁴ beinhaltet (siehe Abbildung 1A für den experimentellen Zeitplan). Die hiPSCs müssen kolonieartig sein, ~85% konfluent und gleichmäßig in der Kultur gut 3-4 Tage nach der Passage zu Beginn der CM-Differenzierung verteilt sein (

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Diskussion

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Die Bildung eines in vitro humanen Herzgewebemodells mit verbesserten Zell-Zell-Interaktionen und biomimetischer 3D-Struktur ist für die kardiovaskuläre Grundlagenforschung und entsprechende klinische Anwendungen unerlässlich¹. Dieses skizzierte Protokoll erklärt die Entwicklung von 3D-humanem anisotropem Herzgewebe in einem mikrofluidischen Gerät unter Verwendung der Co-Kultur von Stammzell-abgeleiteten CMs mit verbindenden CFs, die in einem Kollagenhydrogel verkapselt sind, um die kompl.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Wir danken dem NSF CAREER Award #1653193, dem Arizona Biomedical Research Commission (ABRC) New Investigator Award (ADHS18-198872) und dem Flinn Foundation Award für die Bereitstellung von Finanzierungsquellen für dieses Projekt. Die hiPSC-Linie, SCVI20, wurde von Joseph C. Wu, MD, PhD am Stanford Cardiovascular Institute, finanziert durch NIH R24 HL117756, erworben. Die hiPSC-Linie, IMR90-4, wurde vom WiCell Research Institute⁵⁵^,⁵⁶bezogen.

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,65 mL Zentrifugenröhrchen	VWR	87003-290
1 mm Biopsiestempel	VWR	95039-090
1,5 mm Biopsiestempel	VWR	95039-088
15 mL Falcon Röhrchen	VWR	89039-670
18x18mm Deckgläser	VWR	16004-308	Die Deckgläser sollten Nr. 1 sein, um eine Bildgebung
mit hoher Vergrößerung zu ermöglichen4% Paraformaldehyd	ThermoFisher	101176-014
6-Well-Flachflaschen-Gewebekulturplatten	VWR	82050-844
B27 minus Insulin	LifeTech	A1895602
B27 plus Insulin	LifeTech	17504001
CHIR99021	VWR	10188-030
Kollagen I, Rattenschwanz	Corning	47747-218
DMEM F12	ThermoFisher	11330057
DPBS	ThermoFisher	21600069
E8	ThermoFisher	A1517001	können auch im eigenen Haus hergestellt
werden EDTA	VWR	45001-122
Ethanol
FGM3	VWR	10172-048
GFR-Matrigel	VWR	47743-718
Glycin	Sigma	G8898-500G
Ziegenserum	VWR	10152-212
hESC-Matrigel	Corning	BD354277
IPA
IWP2	Sigma	I0536-5MG
Kimwipes	VWR	82003-820
MTCS	Sigma	440299-1L
NaN₃	Sigma	S2002-25G
NaOH	Sigma	S5881-500G
Stift/Strep	VWR	15140122
Petrischale (150x15mm)	VWR	25384-326
Petrischale (60x15mm)	VWR	25384-092
Phenolrot	Sigma	P3532-5G
RPMI 1640	ThermoFisher	MT10040CM
RPMI 1640 minus Glukose	VWR	45001-110
Silizium Wafer (100mm)	University Wafer	1196
Natriumlactat	Sigma	L4263-100ML
SU8 2075	Microchem	Y111074 0500L1GL
SU8 Entwickler	ThermoFisher	NC9901158
Sylgard Elastomer	Essex Brownell	DC-184-1.1
T75 Kolben	VWR	82050-856
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
TrypLE	ThermoFisher	12604021
Trypsin-EDTA (0,5%)	ThermoFisher	15400054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Y-27632	Stem Cell Technologies	72304
EVG620 Aligner	EVG
Plasmareiniger PDC-32G	Harrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 Mikroskop	Nikon
Leica SP8 Konfokales Mikroskop	Leica

Referenzen

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Savoji, H., et al. Cardiovascular disease models: A game changing paradigm in drug discovery and screening. Biomaterials. 198, 3-26 (2019).
Patino-Guerrero, A., Veldhuizen, J., Zhu, W., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimen....

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3D Herzgewebe Cardiac Tissue Engineering induzierte pluripotente Stammzellen Kardiomyozyten Differenzierung Cardiac Tissue on a Chip Kollagen Hydrogel Verkapselung Zellausrichtung Kokultur mit Herzfibroblasten Gewebepolymerisation

Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

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Protokoll

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