Method Article

Gewinnung aktiv produzierter mikrobieller flüchtiger organischer Verbindungen aus humanassoziierten Proben mit vakuumgestützter Sorptionsmittelextraktion

DOI:

10.3791/62547

⸱

June 1st, 2022

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1Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California Irvine, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California Irvine, 3Entech Instruments Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt die Extraktion flüchtiger organischer Verbindungen aus einer biologischen Probe mit der vakuumunterstützten Sorptionsextraktionsmethode, der Gaschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie unter Verwendung der Entech Sample Preparation Rail und der Datenanalyse. Es beschreibt auch die Kultur biologischer Proben und die Untersuchung stabiler Isotopen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Flüchtige organische Verbindungen (VOC) aus biologischen Proben haben unbekannte Ursprünge. VOCs können vom Host oder von verschiedenen Organismen innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft des Wirts stammen. Um den Ursprung mikrobieller VOCs zu entwirren, wurden flüchtige Kopfraumanalysen von bakteriellen Mono- und Co-Kulturen von Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa und Acinetobacter baumannii sowie stabile Isotopenuntersuchungen in biologischen Proben von Kot, Speichel, Abwasser und Sputum durchgeführt. Mono- und Co-Kulturen wurden verwendet, um die flüchtige Produktion einzelner Bakterienspezies zu identifizieren oder in Kombination mit stabiler Isotopensondierung, um den aktiven Stoffwechsel von Mikroben aus den biologischen Proben zu identifizieren.

Vakuum-unterstützte Sorptionsmittelextraktion (VASE) wurde verwendet, um die VOCs zu extrahieren. VASE ist ein einfach zu bedienendes, kommerzialisiertes, lösungsmittelfreies Headspace-Extraktionsverfahren für halbflüchtige und flüchtige Verbindungen. Der Mangel an Lösungsmitteln und die während der Extraktion verwendeten Beivakuumbedingungen machen die Entwicklung einer Methode im Vergleich zu anderen Extraktionsoptionen wie Tert-Butylierung und Festphasen-Mikroextraktion relativ einfach und schnell. Der hier beschriebene Workflow wurde verwendet, um spezifische flüchtige Signaturen aus Mono- und Co-Kulturen zu identifizieren. Darüber hinaus identifizierte die Analyse der stabilen Isotopenuntersuchung von humanassoziierten biologischen Proben VOCs, die entweder üblicherweise oder einzigartig produziert wurden. Dieses Papier präsentiert den allgemeinen Arbeitsablauf und die experimentellen Überlegungen von VASE in Verbindung mit der Untersuchung stabiler Isotopen lebender mikrobieller Kulturen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Flüchtige organische Verbindungen (VOCs) sind vielversprechend für den bakteriellen Nachweis und die Identifizierung, da sie von allen Organismen emittiert werden und verschiedene Mikroben einzigartige VOC-Signaturen haben. Flüchtige Moleküle wurden als nicht-invasive Messung zum Nachweis verschiedener Atemwegsinfektionen verwendet, einschließlich chronisch obstruktiver Lungenerkrankung1, Tuberkulose2 im Urin3 und beatmungsassoziierter Pneumonie4, zusätzlich zur Unterscheidung von Probanden mit Mukoviszidose (CF) von gesunden Kontrollpersonen 5,6. Flüchtige Signaturen wurden sogar verwendet, um spezifische Erregerinfektionen bei CF zu unterscheiden (Staphylococcus aureus 7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 und S. aureus vs. P. aeruginosa10). Angesichts der Komplexität solcher biologischer Proben ist es jedoch oft schwierig, die Quelle spezifischer VOCs zu lokalisieren.

Eine Strategie zur Entflechtung der flüchtigen Profile von mehreren infizierenden Mikroben besteht darin, eine Headspace-Analyse von Mikroorganismen sowohl in Mono- als auch in Co-Kulturdurchzuführen 11. Die Headspace-Analyse untersucht die Analyten, die in den "Headspace" über einer Probe emittiert werden, und nicht diejenigen, die in die Probe selbst eingebettet sind. Mikrobielle Metaboliten wurden oft in Monokulturen charakterisiert, da es schwierig ist, den Ursprung mikrobieller Metaboliten in komplexen klinischen Proben zu bestimmen. Durch die Profilierung flüchtiger Stoffe aus bakteriellen Monokulturen können die Arten von flüchtigen Stoffen, die eine Mikrobe in vitro produziert, eine Grundlage ihres flüchtigen Repertoires darstellen. Die Kombination von Bakterienkulturen, z. B. die Bildung von Co-Kulturen, und die Profilierung der produzierten flüchtigen Moleküle kann die Wechselwirkungen oder die gegenseitige Fütterung zwischen den Bakterienaufdecken 12.

Eine weitere Strategie zur Identifizierung des mikrobiellen Ursprungs flüchtiger Moleküle besteht darin, eine Nährstoffquelle bereitzustellen, die mit einem stabilen Isotop markiert ist. Stabile Isotope sind natürlich vorkommende, nicht radioaktive Formen von Atomen mit einer unterschiedlichen Anzahl von Neutronen. In einer Strategie, die seit den frühen 1930er Jahren verwendet wird, um den aktiven Stoffwechsel bei Tieren13 zu verfolgen, ernährt sich der Mikroorganismus von der markierten Nährstoffquelle und integriert das stabile Isotop in seine Stoffwechselwege. In jüngerer Zeit wurde ein stabiles Isotop in Form von schwerem Wasser (D2O) verwendet, um metabolisch aktiven S. aureus in einer klinischen CF-Sputumprobe14 zu identifizieren. In einem anderen Beispiel wurde 13C-markierte Glukose verwendet, um das Cross-Feed von Metaboliten zwischen CF-klinischen Isolaten von P. aeruginosa und Rothia mucilaginosa12 zu demonstrieren.

Mit der Weiterentwicklung der Massenspektrometrietechniken haben sich die Methoden zum Nachweis flüchtiger Hinweise von qualitativen Beobachtungen zu quantitativeren Messungen entwickelt. Durch den Einsatz der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) ist die Verarbeitung biologischer Proben für die meisten Labor- oder klinischen Umgebungen in Reichweite gekommen. Viele Methoden zur Untersuchung flüchtiger Moleküle wurden verwendet, um Proben wie Lebensmittel, Bakterienkulturen und andere biologische Proben sowie Luft und Wasser zum Nachweis von Kontaminationen zu profilieren. Einige gängige Methoden der flüchtigen Probenahme mit hohem Durchsatz erfordern jedoch Lösungsmittel und werden nicht mit den Vorteilen der Vakuumextraktion durchgeführt. Darüber hinaus sind für die Analyse 15,16,17,18,19 häufig größere Volumina oder Mengen (größer als 0,5 ml) an beprobten Materialien erforderlich, obwohl dies substratspezifisch ist und eine Optimierung für jeden Probentyp und jede Methode erfordert.

Hier wurde die vakuumunterstützte Sorptionsmittelextraktion (VASE) mit anschließender thermischer Desorption auf einer GC-MS eingesetzt, um die flüchtigen Profile bakterieller Mono- und Co-Kulturen zu untersuchen und aktiv produzierte flüchtige Stoffe mit stabiler Isotopensondierung aus menschlichen Kot-, Speichel-, Abwasser- und Sputumproben zu identifizieren (Abbildung 1). Mit begrenzten Probenmengen wurden VOCs aus nur 15 μL Sputum extrahiert. Isotopenuntersuchungsexperimente mit menschlichen Proben erforderten die Zugabe einer stabilen Isotopenquelle wie 13-C-Glukoseund Medien, um das Wachstum der mikrobiellen Gemeinschaft zu kultivieren. Die aktive Produktion von flüchtigen Stoffen wurde von GC-MS als schwereres Molekül identifiziert. Die Extraktion flüchtiger Moleküle unter statischem Vakuum ermöglichte den Nachweis flüchtiger Moleküle mit erhöhter Empfindlichkeit20,21,22.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Überlegungen zu Headspace Sorbent Pen (HSP) und Probenanalyse

HINWEIS: Das HSP, das das Sorptionsmittel Tenax TA enthält, wurde ausgewählt, um eine breite Palette von flüchtigen Stoffen zu erfassen. Tenax hat im Vergleich zu anderen Sorbentien eine geringere Affinität zu Wasser, wodurch es mehr VOCs aus Proben mit höherer Feuchtigkeit einfangen kann. Tenax hat auch einen geringen Gehalt an Verunreinigungen und kann für die Wiederverwendung konditioniert werden. Die Auswahl der Sorptionsmittel wurde auch unter Berücksichtigung der im GC-MS installierten Säule getroffen (siehe Materialtabelle).

  1. Erzeugen Sie Negativkontrollen, indem Sie Medien und/oder Probenrohlinge mit den gleichen Bedingungen extrahieren, die für die Probenextraktion verwendet werden.
  2. Analysieren Sie ein leeres HSP (von dem zuvor bestätigt wurde, dass es sauber und frei von signifikantem Hintergrund ist) auf dem GC-MS, bevor Sie extrahierte Proben analysieren. Führen Sie Leerzeichen zwischen den Probentypen aus (z. B. drei Replikate von Bakterienmonokultur, Leerzeichen, drei Replikate von Bakterienkokultur, Leerzeichen usw.).
  3. Begrenzen Sie die Verwendung von duftenden Körperpflegeprodukten oder den Verzehr von stinkenden Lebensmitteln vor der Probenextraktion und -analyse. Idealerweise bereiten Sie Proben in einer Biosicherheitshaube vor, die mindestens 30 Minuten lang nicht mit Alkohol oder anderen flüchtigen Reinigern gereinigt wurde. Schalten Sie den Luftstrom in der Biosicherheitshaube für 30-60 Minuten vor der Probenvorbereitung ein.
  4. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf, um die flüchtige Freisetzung während der Probenvorbereitung zu begrenzen.

2. Mono- und Co-Kultur-Zubereitung

  1. In der Biosicherheitshaube impfen Kulturen von A. baumannii, S. aureus und P. aeruginosa in Todd Hewitt Wachstumsmedien. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C mit 200 U / min Rühren.
  2. Nach der Inkubation über Nacht führen Sie die Kulturhandhabung in der Biosicherheitshaube durch. Verdünnen Sie jede Kultur auf eine optische Dichte von 0,05 bei 500 nm.
  3. Mischen Sie Co-Kulturen zu gleichen Teilen und pipettieren Sie 200 μL Kontrollmedien, Mono- oder Co-Kultur in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte und legen Sie sie für 24 h in den 37 °C-Inkubator. Bereiten Sie eine zweite Platte für eine 48-Stunden-Inkubation vor.
  4. Bereiten Sie am Ende der Inkubationszeit die Proben für die Extraktion in Abschnitt 4 vor. Flüssigkulturen in Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren und bei -80 °C lagern.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Proben bei -80 ° C gelagert werden, um sie später bei Bedarf zu extrahieren.

3. Stabile Isotopensondierung in der biologischen Probenvorbereitung

HINWEIS: Die Kot- und Speichelproben wurden von anonymen Spendern mit Genehmigung des University of California Irvine Institutional Review Board (HS# 2017-3867) gespendet. Das Abwasser kam aus San Diego, CA. Die Sputumproben wurden von Probanden mit Mukoviszidose im Rahmen einer größeren Studie entnommen, die vom University of Michigan Medical School Institutional Review Board (HUM00037056) genehmigt wurde.

  1. Führen Sie alle biologischen Probenvorbereitungen in der Biosicherheitshaube durch.
    1. Um Stuhlproben vorzubereiten, fügen Sie 1 ml deionisiertes Wasser zu 100 mg Kot in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Wirbel für 3 min hinzu. Bei Nichtgebrauch auf Eis legen.
      1. Zu 15 μL Fäkalien- und Wassermischung fügen Sie 485 μL Brain Heart Infusion (BHI) -Medium mit 20 mM 13C Glukose oder BHI mit 30% Deuterium (D 2 O) hinzu. Stellen Sie sicher, dass das Endvolumen der Probe 500 μL beträgt. Bereiten Sie Proben in technischen Triplikaten vor.
    2. Um Abwasserproben vorzubereiten, fügen Sie 500 μL Abwasser zu 500 μL BHI mit 20 mM 13C Glucose oder BHI mit 30% D2O für ein Gesamtvolumen von 1 ml hinzu. Bereiten Sie Proben in dreifacher Ausfertigung vor. Bei Nichtgebrauch auf Eis legen.
    3. Um Speichelproben herzustellen, fügen Sie 50 μL Speichel zu 500 μL BHI mit 20 mM 13C Glucose oder BHI mit 30% D 2 O für ein Gesamtvolumen von 550 μL hinzu. Proben indreifacherAusfertigung vorbereiten. Bei Nichtgebrauch auf Eis legen.
    4. Um Sputumproben vorzubereiten, um die in der Probe vorhandenen flüchtigen Stoffe vor und nach der Kultivierung zu vergleichen, führen Sie eine erste Extraktion mit 15 μL Sputum durch. Bereiten Sie Proben in dreifacher Ausfertigung vor. Bei Nichtgebrauch auf Eis legen. Fahren Sie mit Abschnitt 4 für die Probenextraktion fort und extrahieren Sie für 18 Stunden bei 37 ° C mit 200 U / min Rühren.
    5. Nach Abschluss der ersten Extraktion der unkultivierten Sputumproben bewahren Sie die Fläschchen mit Sputum auf. 500 μL BHI mit 20 mM 13C Glucose in die Durchstechflaschen mit Sputum aus 3.5.1 geben. Bei Nichtgebrauch auf Eis legen.
  2. Fahren Sie mit Abschnitt 4 für die Probenextraktion fort.

4. Probenextraktion

  1. Legen Sie leere Durchstechflaschen für flüchtige organische Analysen (VOA) (20 ml) auf die Kühlplatte und legen Sie die kalte Platte auf Eis in die Biosicherheitshaube.
  2. Schalten Sie die 5600 Sorptionsstift-Extraktionseinheit (SPEU) ein und passen Sie sie an die gewünschte Temperatur an, die für jede Methode erforderlich ist.
    HINWEIS: Bei stabilen Isotopensondierungsexperimenten bei 37 °C kann das Erreichen des Sollwerts bis zu 15 Minuten dauern. Für Mono- und Co-Kultur-Experimente bei 70 °C kann das Erreichen des Sollwerts bis zu 60 Minuten dauern.
  3. Sammeln Sie saubere HSPs, die der Anzahl der vorbereiteten Proben entsprechen, einschließlich HSPs für Medien oder Probenkontrollen.
  4. Etikettieren Sie 20 ml VOA-Fläschchen nach Proben, Replikaten und HSP-IDs nach Bedarf. Verwenden Sie einen Marker, der Wasser widersteht, falls sich auf dem Eis Kondenswasser an der Außenseite der Durchstechflasche bildet.
  5. Schrauben Sie im Inneren der Biosicherheitshaube die weiße Kappe der Durchstechflasche ab, pipettieren Sie schnell Proben in die Durchstechflasche und montieren Sie die schwarze Kappe, die Deckelfolie und die HSP.
    HINWEIS: Die Proben sollten nicht mit dem HSP in Berührung kommen, und das Probenvolumen hängt vom Probentyp ab.
  6. Legen Sie die Durchstechflasche mit der Probe und HSP wieder auf die Kühlplatte.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 4.5 und 4.6 für jede Probe. Führen Sie diese Schritte pro Probe und nicht alle auf einmal aus, um eine Erwärmung der Probe und damit eine vorzeitige flüchtige Freisetzung zu verhindern.
  8. Nachdem alle Proben in den Glasfläschchen vorbereitet wurden, führen Sie die folgenden Schritte außerhalb der Biosicherheitshaube auf der Bank durch. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein, stellen Sie die Durchstechflaschen unter Vakuum bis 30 mmHg und entfernen Sie die Vakuumquelle.
    HINWEIS: Die Fläschchen müssen sich nach Abschluss der Vakuumanwendung nicht auf der Kühlschale befinden.
  9. Überprüfen Sie den Druck, nachdem Sie alle Proben mit dem Manometer unter Vakuum gestellt haben. Wenn eine Durchstechflasche ein Leck aufweist, stellen Sie sicher, dass die Kappe fest verschraubt ist und dass die weißen O-Ringe der HSP- und Deckelauskleidungen ordnungsgemäß angebracht sind.
    HINWEIS: Eine kompromittierte Dichtung kann im Vergleich zu einer Durchstechflasche unter Vakuum zu einer verminderten flüchtigen Erkennung führen.
  10. Stellen Sie Fläschchen in den SPEU für die optimierte Zeit und Temperatur mit Bewegung bei 200 U / min. Kulturen für 1 h bei 70 °C extrahieren. Extrahieren Sie stabile Isotopenuntersuchungsexperimente mit Stuhl-, Abwasser-, Speichel- und Sputumproben für 18 h bei 37 ° C.
  11. Stellen Sie die Kühlplatte bei -80 °C auf, um sie nach Ablauf der Extraktionszeit zu verwenden.
  12. Wenn die Extraktion abgeschlossen ist, legen Sie die Proben für 15 Minuten auf die Kühlplatte, um Wasserdampf aus dem HSP- und Durchstechflaschenkopfraum abzuleiten.
  13. Bringen Sie die HSPs auf ihre Ärmel.
    HINWEIS: Das Experiment kann hier für bis zu ~ 1 Woche bei Raumtemperatur pausiert werden, bevor die höher flüchtigen Verbindungen aus den HSPs verloren gehen.

5. Proben auf der Gaschromatographie analysieren - Massenspektrometer (GC-MS)

  1. Verwenden Sie die folgenden GC-MS-Einstellungen (siehe Materialtabelle): 35 °C mit 5 min Halt, 10 °C/min Rampe bis 170 °C und 15 °C/min Rampe bis 230 °C mit einem Split-Verhältnis von 20:1 und einer Gesamtlaufzeit von 38 min.
  2. Stellen Sie die Desorptionsmethode wie folgt ein: 2 min, 70 °C vorheizen; 2 min 260 °C Desorption; 34 min, 260 °C Backen; und 2 min, 70 °C nach dem Backen.
  3. Richten Sie die Ablaufreihenfolge der Samples ein, und starten Sie den Lauf entsprechend der Instrumentierung.
    1. Um eine Sequenz auf der Entech-Software einzurichten, öffnen Sie das Programm. Wählen Sie in den Optionen rechts neben dem Instrumenten-Dropdown-Menü 5800 | aus. Reihenfolge.
    2. Beachten Sie die Sequenztabelle in der Entech-Software ähnlich der in der GC-MS-Software. Benennen Sie die Spalte Beispiel-ID entsprechend der Nummer Aktuelle date_vial. Beachten Sie, dass Name in der GC-MS-Sequenztabelle analog zu Name ist und die 5800-Methode die Rate der Temperaturrampe, Haltezeiten usw. bestimmt (öffnet ein Menü, um die in Schritt 5.2 generierte Methode auszuwählen).
    3. Beachten Sie, dass die Spalten Tray und Position bestimmen, wohin die Sample Preparation Rail (SPR) gehen wird, um die HSPs abzuholen.
      1. Beobachten Sie die beiden Tabletts mit jeweils 30 Flecken unmittelbar links, die als sechs Spalten mit jeweils fünf Flecken angeordnet sind. Die Tray-Position, die dem Benutzer am meisten links und am nächsten ist (vorne), ist Position 1, während die rechteste, am weitesten entfernte Position 30 ist.
      2. Beachten Sie, dass es sich bei diesen Trays um HSP A oder B handelt, wobei HSP B das Tray näher am SPR (innerstes Tray) ist und direkt hinter HSP B HSP Blank steht. Legen Sie die extrahierten Proben in die Schalen und wählen Sie die Stelle in der Sequenz entsprechend aus.
    4. Speichern Sie die Sequenztabelle, wählen Sie Ausführen auf der linken Seite und dann Beginnen Sie mit leer im Desorber , wenn sich der leere HSP im Desorber befindet (gekennzeichnet durch einen HSP, der durch eine gelb markierte Beschriftung gekennzeichnet ist).
  4. Beachten Sie, dass HSPs vom SPR für jede Probe in der Sequenz behandelt werden. Lassen Sie den SPR aufwärmen, dann erscheint oben auf dem Bildschirm eine Meldung, um zu bestätigen, ob sich das Leerzeichen im Desorber befindet. Klicken Sie auf Überspringen , um zu bestätigen, dass der Stift vorhanden ist. Lassen Sie den SPR alle Samples automatisch ausführen, und die Sequenz auf der GC-MS-Seite zeichnet die Daten automatisch in separaten Dateien auf.

6. Datenanalyse

  1. Qualitätsfilterdaten auf GC-MS-Software (Table of Materials).
    1. Überprüfen Sie jeden Peak auf dem Chromatogramm und kommentieren Sie Peaks, die mit der Bibliothek des National Institute of Standards & Technology (NIST) (oder mit einer anderen verfügbaren Bibliothek) übereinstimmen.
    2. Fügen Sie der Verarbeitungsmethode annotierte Chromatogrammspitzen hinzu. Legen Sie die Kriterien für die Auswahl von Peaks fest, um Verbindungen mit einer Wahrscheinlichkeit von mehr als 75% einzuschließen, und stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung jedes identifizierenden Ions der Verbindung innerhalb des Zentrums des Peaks liegt.
      1. Um der Verarbeitungsmethode einen Peak hinzuzufügen, wählen Sie | kalibrieren aus. Zusammengesetzte | bearbeiten Vorname | Fügen Sie die Verbindung unter Externe Standardverbindung ein. Fügen Sie den Namen der Verbindung, die Retentionszeit, das Quant Signal Target Ion hinzu. Fügen Sie die drei größten Gipfel hinzu. Wählen Sie zum Speichern OK | aus Methode | Speichern.
    3. Sobald die Prozessmethode eingerichtet ist, fahren Sie mit | Quantifizierung fort Berechnen und Anzeigen von | QEdit Quant Ergebnis.
    4. Prüfen Sie jede Verbindung, um sicherzustellen, dass die Spitzen mit ihren erwarteten Verweilzeiten übereinstimmen und über dem Hintergrundrauschen liegen.
    5. Sobald QEdit abgeschlossen ist, wählen Sie | beenden Ja, um die QEdits zu speichern und zum Hauptchromatogramm zurückzukehren. Exportieren Sie die Bereichsintegrationen, indem Sie die Datei auf der linken Seite öffnen. Wählen Sie | quantifizieren aus. Bericht generieren.
    6. Um Dateien zur Verwendung in DExSI zu exportieren, wählen Sie Datei | Exportieren von Daten in | im AIA-Format Erstellen Sie ein neues Verzeichnis, und wählen Sie einen Speicherort für die Datei oder Vorhandenes Verzeichnis verwenden aus.
    7. Beobachten Sie, dass sich ein neues Fenster öffnet, in dem Sie Dateien für den Export auswählen können. Verschieben Sie die Dateien auf die rechte Seite des Fensters und klicken Sie auf Verarbeiten. Warten Sie einige Sekunden bis einige Minuten, abhängig von der Anzahl der zu konvertierenden Dateien.
  2. Korrigieren Sie die Isotopenhäufigkeit in DExSI gemäß den Anweisungen für die DExSI-Software (https://github.com/DExSI/DExSI) und führen Sie die Analyse mit einer bevorzugten Software oder einem bevorzugten Programm (z. B. R) durch. Skripte, die zur Generierung der Zahlen verwendet werden, befinden sich unter https://github.com/joannlp/ VOC_SIP.

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Results

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Mono- und Co-Kulturen von S. aureus, P. aeruginosa und A. baumannii
Die Mono- und Co-Kulturen bestanden aus den Bakterienarten S. aureus, P. aeruginosa und A. baumannii. Dies sind häufige opportunistische Erreger, die in menschlichen Wunden und chronischen Infektionen vorkommen. Um die in den Mono- und Co-Kulturen vorhandenen flüchtigen Moleküle zu identifizieren, wurde ein...

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Discussion

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Zur Identifizierung der flüchtigen Produktion in In-vitro-Kulturen und humanassoziierten Proben wurden flüchtige Analysen von Mono- und Co-Kulturen von P. aeruginosa, S. aureus und A. baumanii sowie stabile Isotopenuntersuchungen verschiedener biologischer Proben durchgeführt. In der Analyse für die Mono- und Co-Kulturen wurden flüchtige Stoffe durch eine kurze Extraktion für 1 h bei 70 °C nachgewiesen. Die flüchtige Analyse von Mono- und Co-Kulturen ermöglichte die Untersuchung der Verbindung...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

V. L. V und S. J.B. D. waren ehemalige Mitarbeiter von Entech Instruments Inc., und K. W. ist Mitglied des Universitätsprogramms von Entech. J. P., J. K. und C. I. R. haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgements

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Wir danken Heather Maughan und Linda M. Kalikin für die sorgfältige Bearbeitung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom NIH NHLBI (Grant 5R01HL136647-04) unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
13C GlukoseSigma-Aldrich389374-1G
2-Stg MembranpumpeEntech Instruments01-10-20030
20 mL VOA-FläschchenFisher Scientific5719110
24 mm Schwarze Kappen mit Loch, kein SeptumEntech Instruments01-39-76044Bhält die Deckelauskleidung auf dem Fläschchen
fest 24 mm Fläschchenauskleidung für SorptionsstifteMit dem Entech InstrumentsSP-L024Skönnen Pens die Oberseite des Fläschchens vakuumieren
5600 Sorbent Pen Extraction Unit (SPEU)Entech Instruments5600-SPES5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC
96-Well-Assay-PlattenGenesee25-224
Brain Heart Infusion (BHI) MedienSigma-Aldrich53286-500G
ChemStation StofwareAgilent
DB-624 SäuleAgilent122-1364E60 m, 0,25 mm ID, 1,40 μm Schichtdicke, aus GC-MS
DeuteriumoxidSigma-Aldrich151882-1L
Dexsi-SoftwareDexsi (Open Source)
GC-MS (7890A GC und 5975C inert XL MSD mit Drei-Achsen-Detektor)Agilent7890A GC und 5975C inert XL MSD mit Drei-Achse Detektor
Headspace Bundle HS-B01, 120VAEntech InstrumentsSP-HS-B01Artikel für die Durchführung der Headspace-Extraktion im Bundle enthalten
Headspace Sorptionsstift (HSP) - blankEntech InstrumentsSP-HS-0
Headspace Sorptionsstift (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)Entech InstrumentsSP-HS-T3560
Mikrozentrifugenröhrchen (2 mL)VWR53550-792
O-RingeEntech InstrumentsSP-OR-L024
Probenvorbereitung SchieneEntech Instruments
Sorptionsstift WärmekonditioniererEntech Instruments3801-SPTC
Todd Hewitt (TH) MedienSigmaT1438-500G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
  2. Nakhleh, M. K., et al. Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors. European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).
  3. Lim, S. H., et al. Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds. ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).
  4. Schnabel, R., et al. Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia. Scientific Reports. 5, 17179(2015).
  5. Paff, T., et al. Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).
  6. Robroeks, C. M. H. H. T., et al. Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls. Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).
  7. Neerincx, A. H., et al. Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus. European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).
  8. Goeminne, P. C., et al. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis. Respiratory Research. 13, 87(2012).
  9. Joensen, O., et al. Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections. PLOS ONE. 9 (12), 115584(2014).
  10. Nasir, M., et al. Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients. Scientific Reports. 8 (1), 826(2018).
  11. Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. Volatiles in inter-specific bacterial interactions. Frontiers in Microbiology. 6, 1412(2015).
  12. Gao, B., et al. Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites. mSphere. 3 (2), 00151(2018).
  13. Schoenheimer, R., Rittenberg, D. Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism. Science. 82 (2120), 156-157 (1935).
  14. Neubauer, C., et al. Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365(2018).
  15. Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).
  16. Mayor, A. S. R. Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184(2014).
  17. Camarasu, C. C. Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).
  18. Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID. Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).
  19. Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).
  20. Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples. Talanta. 208, 120390(2020).
  21. Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater. Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).
  22. Psillakis, E. The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).
  23. Carmody, L. A., et al. The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation. Microbiome. 3, 12(2015).
  24. Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLOS ONE. 13 (3), 0194060(2018).
  25. Mahboubi, M. A., et al. Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).

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