Gewinnung aktiv produzierter mikrobieller flüchtiger organischer Verbindungen aus humanassoziierten Proben mit vakuumgestützter Sorptionsmittelextraktion

Flüchtige organische Verbindungen (VOCs) sind vielversprechend für den bakteriellen Nachweis und die Identifizierung, da sie von allen Organismen emittiert werden und verschiedene Mikroben einzigartige VOC-Signaturen haben. Flüchtige Moleküle wurden als nicht-invasive Messung zum Nachweis verschiedener Atemwegsinfektionen verwendet, einschließlich chronisch obstruktiver Lungenerkrankung¹, Tuberkulose² im Urin³ und beatmungsassoziierter Pneumonie⁴, zusätzlich zur Unterscheidung von Probanden mit Mukoviszidose (CF) von gesunden Kontrollpersonen ^5,6. Flüchtige Signaturen wurden sogar verwendet, um spezifische Erregerinfektionen bei CF zu unterscheiden (Staphylococcus aureus ⁷, Pseudomonas aeruginosa ^8,9 und S. aureus vs. P. aeruginosa¹⁰). Angesichts der Komplexität solcher biologischer Proben ist es jedoch oft schwierig, die Quelle spezifischer VOCs zu lokalisieren.

Eine Strategie zur Entflechtung der flüchtigen Profile von mehreren infizierenden Mikroben besteht darin, eine Headspace-Analyse von Mikroorganismen sowohl in Mono- als auch in Co-Kultur^{durchzuführen 11}. Die Headspace-Analyse untersucht die Analyten, die in den "Headspace" über einer Probe emittiert werden, und nicht diejenigen, die in die Probe selbst eingebettet sind. Mikrobielle Metaboliten wurden oft in Monokulturen charakterisiert, da es schwierig ist, den Ursprung mikrobieller Metaboliten in komplexen klinischen Proben zu bestimmen. Durch die Profilierung flüchtiger Stoffe aus bakteriellen Monokulturen können die Arten von flüchtigen Stoffen, die eine Mikrobe in vitro produziert, eine Grundlage ihres flüchtigen Repertoires darstellen. Die Kombination von Bakterienkulturen, z. B. die Bildung von Co-Kulturen, und die Profilierung der produzierten flüchtigen Moleküle kann die Wechselwirkungen oder die gegenseitige Fütterung zwischen den Bakterien^{aufdecken 12}.

Eine weitere Strategie zur Identifizierung des mikrobiellen Ursprungs flüchtiger Moleküle besteht darin, eine Nährstoffquelle bereitzustellen, die mit einem stabilen Isotop markiert ist. Stabile Isotope sind natürlich vorkommende, nicht radioaktive Formen von Atomen mit einer unterschiedlichen Anzahl von Neutronen. In einer Strategie, die seit den frühen 1930er Jahren verwendet wird, um den aktiven Stoffwechsel bei Tieren¹³ zu verfolgen, ernährt sich der Mikroorganismus von der markierten Nährstoffquelle und integriert das stabile Isotop in seine Stoffwechselwege. In jüngerer Zeit wurde ein stabiles Isotop in Form von schwerem Wasser (_D2O) verwendet, um metabolisch aktiven S. aureus in einer klinischen CF-Sputumprobe¹⁴ zu identifizieren. In einem anderen Beispiel wurde ¹³C-markierte Glukose verwendet, um das Cross-Feed von Metaboliten zwischen CF-klinischen Isolaten von P. aeruginosa und Rothia mucilaginosa^{12 zu demonstrieren.}

Mit der Weiterentwicklung der Massenspektrometrietechniken haben sich die Methoden zum Nachweis flüchtiger Hinweise von qualitativen Beobachtungen zu quantitativeren Messungen entwickelt. Durch den Einsatz der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) ist die Verarbeitung biologischer Proben für die meisten Labor- oder klinischen Umgebungen in Reichweite gekommen. Viele Methoden zur Untersuchung flüchtiger Moleküle wurden verwendet, um Proben wie Lebensmittel, Bakterienkulturen und andere biologische Proben sowie Luft und Wasser zum Nachweis von Kontaminationen zu profilieren. Einige gängige Methoden der flüchtigen Probenahme mit hohem Durchsatz erfordern jedoch Lösungsmittel und werden nicht mit den Vorteilen der Vakuumextraktion durchgeführt. Darüber hinaus sind für die Analyse 15,16,17,18,19 häufig größere Volumina oder Mengen (größer als 0,5 ml) an beprobten Materialien erforderlich^, obwohl dies substratspezifisch ist und eine Optimierung für jeden Probentyp und jede Methode erfordert.

Hier wurde die vakuumunterstützte Sorptionsmittelextraktion (VASE) mit anschließender thermischer Desorption auf einer GC-MS eingesetzt, um die flüchtigen Profile bakterieller Mono- und Co-Kulturen zu untersuchen und aktiv produzierte flüchtige Stoffe mit stabiler Isotopensondierung aus menschlichen Kot-, Speichel-, Abwasser- und Sputumproben zu identifizieren (Abbildung 1). Mit begrenzten Probenmengen wurden VOCs aus nur 15 μL Sputum extrahiert. Isotopenuntersuchungsexperimente mit menschlichen Proben erforderten die Zugabe einer stabilen Isotopenquelle wie ^13-C-Glukoseund Medien, um das Wachstum der mikrobiellen Gemeinschaft zu kultivieren. Die aktive Produktion von flüchtigen Stoffen wurde von GC-MS als schwereres Molekül identifiziert. Die Extraktion flüchtiger Moleküle unter statischem Vakuum ermöglichte den Nachweis flüchtiger Moleküle mit erhöhter Empfindlichkeit^20,21,22.

1. Überlegungen zu Headspace Sorbent Pen (HSP) und Probenanalyse

HINWEIS: Das HSP, das das Sorptionsmittel Tenax TA enthält, wurde ausgewählt, um eine breite Palette von flüchtigen Stoffen zu erfassen. Tenax hat im Vergleich zu anderen Sorbentien eine geringere Affinität zu Wasser, wodurch es mehr VOCs aus Proben mit höherer Feuchtigkeit einfangen kann. Tenax hat auch einen geringen Gehalt an Verunreinigungen und kann für die Wiederverwendung konditioniert werden. Die Auswahl der Sorptionsmittel wurde auch unter Berücksichtigung der im GC-MS installierten Säule getroffen (siehe Materialtabelle).

1. Erzeugen Sie Negativkontrollen, indem Sie Medien und/oder Probenrohlinge mit den gleichen Bedingungen extrahieren, die für die Probenextraktion verwendet werden.
2. Analysieren Sie ein leeres HSP (von dem zuvor bestätigt wurde, dass es sauber und frei von signifikantem Hintergrund ist) auf dem GC-MS, bevor Sie extrahierte Proben analysieren. Führen Sie Leerzeichen zwischen den Probentypen aus (z. B. drei Replikate von Bakterienmonokultur, Leerzeichen, drei Replikate von Bakterienkokultur, Leerzeichen usw.).
3. Begrenzen Sie die Verwendung von duftenden Körperpflegeprodukten oder den Verzehr von stinkenden Lebensmitteln vor der Probenextraktion und -analyse. Idealerweise bereiten Sie Proben in einer Biosicherheitshaube vor, die mindestens 30 Minuten lang nicht mit Alkohol oder anderen flüchtigen Reinigern gereinigt wurde. Schalten Sie den Luftstrom in der Biosicherheitshaube für 30-60 Minuten vor der Probenvorbereitung ein.
4. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf, um die flüchtige Freisetzung während der Probenvorbereitung zu begrenzen.

2. Mono- und Co-Kultur-Zubereitung

1. In der Biosicherheitshaube impfen Kulturen von A. baumannii, S. aureus und P. aeruginosa in Todd Hewitt Wachstumsmedien. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C mit 200 U / min Rühren.
2. Nach der Inkubation über Nacht führen Sie die Kulturhandhabung in der Biosicherheitshaube durch. Verdünnen Sie jede Kultur auf eine optische Dichte von 0,05 bei 500 nm.
3. Mischen Sie Co-Kulturen zu gleichen Teilen und pipettieren Sie 200 μL Kontrollmedien, Mono- oder Co-Kultur in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte und legen Sie sie für 24 h in den 37 °C-Inkubator. Bereiten Sie eine zweite Platte für eine 48-Stunden-Inkubation vor.
4. Bereiten Sie am Ende der Inkubationszeit die Proben für die Extraktion in Abschnitt 4 vor. Flüssigkulturen in Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren und bei -80 °C lagern.
   HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Proben bei -80 ° C gelagert werden, um sie später bei Bedarf zu extrahieren.

3. Stabile Isotopensondierung in der biologischen Probenvorbereitung

HINWEIS: Die Kot- und Speichelproben wurden von anonymen Spendern mit Genehmigung des University of California Irvine Institutional Review Board (HS# 2017-3867) gespendet. Das Abwasser kam aus San Diego, CA. Die Sputumproben wurden von Probanden mit Mukoviszidose im Rahmen einer größeren Studie entnommen, die vom University of Michigan Medical School Institutional Review Board (HUM00037056) genehmigt wurde.

1. Führen Sie alle biologischen Probenvorbereitungen in der Biosicherheitshaube durch.
   1. Um Stuhlproben vorzubereiten, fügen Sie 1 ml deionisiertes Wasser zu 100 mg Kot in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Wirbel für 3 min hinzu. Bei Nichtgebrauch auf Eis legen.
      1. Zu 15 μL Fäkalien- und Wassermischung fügen Sie 485 μL Brain Heart Infusion (BHI) -Medium mit 20 mM ¹³C Glukose oder BHI mit 30% Deuterium (D 2 O) hinzu_. Stellen Sie sicher, dass das Endvolumen der Probe 500 μL beträgt. Bereiten Sie Proben in technischen Triplikaten vor.
   2. Um Abwasserproben vorzubereiten, fügen Sie 500 μL Abwasser zu 500 μL BHI mit 20 mM ¹³C Glucose oder BHI mit 30% D₂O für ein Gesamtvolumen von 1 ml hinzu. Bereiten Sie Proben in dreifacher Ausfertigung vor. Bei Nichtgebrauch auf Eis legen.
   3. Um Speichelproben herzustellen, fügen Sie 50 μL Speichel zu 500 μL BHI mit 20 mM ¹³C Glucose oder BHI mit 30% D 2 O für ein Gesamtvolumen von 550 μL hinzu. Proben in_dreifacherAusfertigung vorbereiten. Bei Nichtgebrauch auf Eis legen.
   4. Um Sputumproben vorzubereiten, um die in der Probe vorhandenen flüchtigen Stoffe vor und nach der Kultivierung zu vergleichen, führen Sie eine erste Extraktion mit 15 μL Sputum durch. Bereiten Sie Proben in dreifacher Ausfertigung vor. Bei Nichtgebrauch auf Eis legen. Fahren Sie mit Abschnitt 4 für die Probenextraktion fort und extrahieren Sie für 18 Stunden bei 37 ° C mit 200 U / min Rühren.
   5. Nach Abschluss der ersten Extraktion der unkultivierten Sputumproben bewahren Sie die Fläschchen mit Sputum auf. 500 μL BHI mit 20 mM ¹³C Glucose in die Durchstechflaschen mit Sputum aus 3.5.1 geben. Bei Nichtgebrauch auf Eis legen.
2. Fahren Sie mit Abschnitt 4 für die Probenextraktion fort.

4. Probenextraktion

1. Legen Sie leere Durchstechflaschen für flüchtige organische Analysen (VOA) (20 ml) auf die Kühlplatte und legen Sie die kalte Platte auf Eis in die Biosicherheitshaube.
2. Schalten Sie die 5600 Sorptionsstift-Extraktionseinheit (SPEU) ein und passen Sie sie an die gewünschte Temperatur an, die für jede Methode erforderlich ist.
   HINWEIS: Bei stabilen Isotopensondierungsexperimenten bei 37 °C kann das Erreichen des Sollwerts bis zu 15 Minuten dauern. Für Mono- und Co-Kultur-Experimente bei 70 °C kann das Erreichen des Sollwerts bis zu 60 Minuten dauern.
3. Sammeln Sie saubere HSPs, die der Anzahl der vorbereiteten Proben entsprechen, einschließlich HSPs für Medien oder Probenkontrollen.
4. Etikettieren Sie 20 ml VOA-Fläschchen nach Proben, Replikaten und HSP-IDs nach Bedarf. Verwenden Sie einen Marker, der Wasser widersteht, falls sich auf dem Eis Kondenswasser an der Außenseite der Durchstechflasche bildet.
5. Schrauben Sie im Inneren der Biosicherheitshaube die weiße Kappe der Durchstechflasche ab, pipettieren Sie schnell Proben in die Durchstechflasche und montieren Sie die schwarze Kappe, die Deckelfolie und die HSP.
   HINWEIS: Die Proben sollten nicht mit dem HSP in Berührung kommen, und das Probenvolumen hängt vom Probentyp ab.
6. Legen Sie die Durchstechflasche mit der Probe und HSP wieder auf die Kühlplatte.
7. Wiederholen Sie die Schritte 4.5 und 4.6 für jede Probe. Führen Sie diese Schritte pro Probe und nicht alle auf einmal aus, um eine Erwärmung der Probe und damit eine vorzeitige flüchtige Freisetzung zu verhindern.
8. Nachdem alle Proben in den Glasfläschchen vorbereitet wurden, führen Sie die folgenden Schritte außerhalb der Biosicherheitshaube auf der Bank durch. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein, stellen Sie die Durchstechflaschen unter Vakuum bis 30 mmHg und entfernen Sie die Vakuumquelle.
   HINWEIS: Die Fläschchen müssen sich nach Abschluss der Vakuumanwendung nicht auf der Kühlschale befinden.
9. Überprüfen Sie den Druck, nachdem Sie alle Proben mit dem Manometer unter Vakuum gestellt haben. Wenn eine Durchstechflasche ein Leck aufweist, stellen Sie sicher, dass die Kappe fest verschraubt ist und dass die weißen O-Ringe der HSP- und Deckelauskleidungen ordnungsgemäß angebracht sind.
   HINWEIS: Eine kompromittierte Dichtung kann im Vergleich zu einer Durchstechflasche unter Vakuum zu einer verminderten flüchtigen Erkennung führen.
10. Stellen Sie Fläschchen in den SPEU für die optimierte Zeit und Temperatur mit Bewegung bei 200 U / min. Kulturen für 1 h bei 70 °C extrahieren. Extrahieren Sie stabile Isotopenuntersuchungsexperimente mit Stuhl-, Abwasser-, Speichel- und Sputumproben für 18 h bei 37 ° C.
11. Stellen Sie die Kühlplatte bei -80 °C auf, um sie nach Ablauf der Extraktionszeit zu verwenden.
12. Wenn die Extraktion abgeschlossen ist, legen Sie die Proben für 15 Minuten auf die Kühlplatte, um Wasserdampf aus dem HSP- und Durchstechflaschenkopfraum abzuleiten.
13. Bringen Sie die HSPs auf ihre Ärmel.
    HINWEIS: Das Experiment kann hier für bis zu ~ 1 Woche bei Raumtemperatur pausiert werden, bevor die höher flüchtigen Verbindungen aus den HSPs verloren gehen.

5. Proben auf der Gaschromatographie analysieren - Massenspektrometer (GC-MS)

1. Verwenden Sie die folgenden GC-MS-Einstellungen (siehe Materialtabelle): 35 °C mit 5 min Halt, 10 °C/min Rampe bis 170 °C und 15 °C/min Rampe bis 230 °C mit einem Split-Verhältnis von 20:1 und einer Gesamtlaufzeit von 38 min.
2. Stellen Sie die Desorptionsmethode wie folgt ein: 2 min, 70 °C vorheizen; 2 min 260 °C Desorption; 34 min, 260 °C Backen; und 2 min, 70 °C nach dem Backen.
3. Richten Sie die Ablaufreihenfolge der Samples ein, und starten Sie den Lauf entsprechend der Instrumentierung.
   1. Um eine Sequenz auf der Entech-Software einzurichten, öffnen Sie das Programm. Wählen Sie in den Optionen rechts neben dem Instrumenten-Dropdown-Menü 5800 | aus. Reihenfolge.
   2. Beachten Sie die Sequenztabelle in der Entech-Software ähnlich der in der GC-MS-Software. Benennen Sie die Spalte Beispiel-ID entsprechend der Nummer Aktuelle date_vial. Beachten Sie, dass Name in der GC-MS-Sequenztabelle analog zu Name ist und die 5800-Methode die Rate der Temperaturrampe, Haltezeiten usw. bestimmt (öffnet ein Menü, um die in Schritt 5.2 generierte Methode auszuwählen).
   3. Beachten Sie, dass die Spalten Tray und Position bestimmen, wohin die Sample Preparation Rail (SPR) gehen wird, um die HSPs abzuholen.
      1. Beobachten Sie die beiden Tabletts mit jeweils 30 Flecken unmittelbar links, die als sechs Spalten mit jeweils fünf Flecken angeordnet sind. Die Tray-Position, die dem Benutzer am meisten links und am nächsten ist (vorne), ist Position 1, während die rechteste, am weitesten entfernte Position 30 ist.
      2. Beachten Sie, dass es sich bei diesen Trays um HSP A oder B handelt, wobei HSP B das Tray näher am SPR (innerstes Tray) ist und direkt hinter HSP B HSP Blank steht. Legen Sie die extrahierten Proben in die Schalen und wählen Sie die Stelle in der Sequenz entsprechend aus.
   4. Speichern Sie die Sequenztabelle, wählen Sie Ausführen auf der linken Seite und dann Beginnen Sie mit leer im Desorber , wenn sich der leere HSP im Desorber befindet (gekennzeichnet durch einen HSP, der durch eine gelb markierte Beschriftung gekennzeichnet ist).
4. Beachten Sie, dass HSPs vom SPR für jede Probe in der Sequenz behandelt werden. Lassen Sie den SPR aufwärmen, dann erscheint oben auf dem Bildschirm eine Meldung, um zu bestätigen, ob sich das Leerzeichen im Desorber befindet. Klicken Sie auf Überspringen , um zu bestätigen, dass der Stift vorhanden ist. Lassen Sie den SPR alle Samples automatisch ausführen, und die Sequenz auf der GC-MS-Seite zeichnet die Daten automatisch in separaten Dateien auf.

6. Datenanalyse

1. Qualitätsfilterdaten auf GC-MS-Software (Table of Materials).
   1. Überprüfen Sie jeden Peak auf dem Chromatogramm und kommentieren Sie Peaks, die mit der Bibliothek des National Institute of Standards & Technology (NIST) (oder mit einer anderen verfügbaren Bibliothek) übereinstimmen.
   2. Fügen Sie der Verarbeitungsmethode annotierte Chromatogrammspitzen hinzu. Legen Sie die Kriterien für die Auswahl von Peaks fest, um Verbindungen mit einer Wahrscheinlichkeit von mehr als 75% einzuschließen, und stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung jedes identifizierenden Ions der Verbindung innerhalb des Zentrums des Peaks liegt.
      1. Um der Verarbeitungsmethode einen Peak hinzuzufügen, wählen Sie | kalibrieren aus. Zusammengesetzte | bearbeiten Vorname | Fügen Sie die Verbindung unter Externe Standardverbindung ein. Fügen Sie den Namen der Verbindung, die Retentionszeit, das Quant Signal Target Ion hinzu. Fügen Sie die drei größten Gipfel hinzu. Wählen Sie zum Speichern OK | aus Methode | Speichern.
   3. Sobald die Prozessmethode eingerichtet ist, fahren Sie mit | Quantifizierung fort Berechnen und Anzeigen von | QEdit Quant Ergebnis.
   4. Prüfen Sie jede Verbindung, um sicherzustellen, dass die Spitzen mit ihren erwarteten Verweilzeiten übereinstimmen und über dem Hintergrundrauschen liegen.
   5. Sobald QEdit abgeschlossen ist, wählen Sie | beenden Ja, um die QEdits zu speichern und zum Hauptchromatogramm zurückzukehren. Exportieren Sie die Bereichsintegrationen, indem Sie die Datei auf der linken Seite öffnen. Wählen Sie | quantifizieren aus. Bericht generieren.
   6. Um Dateien zur Verwendung in DExSI zu exportieren, wählen Sie Datei | Exportieren von Daten in | im AIA-Format Erstellen Sie ein neues Verzeichnis, und wählen Sie einen Speicherort für die Datei oder Vorhandenes Verzeichnis verwenden aus.
   7. Beobachten Sie, dass sich ein neues Fenster öffnet, in dem Sie Dateien für den Export auswählen können. Verschieben Sie die Dateien auf die rechte Seite des Fensters und klicken Sie auf Verarbeiten. Warten Sie einige Sekunden bis einige Minuten, abhängig von der Anzahl der zu konvertierenden Dateien.
2. Korrigieren Sie die Isotopenhäufigkeit in DExSI gemäß den Anweisungen für die DExSI-Software (https://github.com/DExSI/DExSI) und führen Sie die Analyse mit einer bevorzugten Software oder einem bevorzugten Programm (z. B. R) durch. Skripte, die zur Generierung der Zahlen verwendet werden, befinden sich unter https://github.com/joannlp/ VOC_SIP.

Mono- und Co-Kulturen von S. aureus, P. aeruginosa und A. baumannii
Die Mono- und Co-Kulturen bestanden aus den Bakterienarten S. aureus, P. aeruginosa und A. baumannii. Dies sind häufige opportunistische Erreger, die in menschlichen Wunden und chronischen Infektionen vorkommen. Um die in den Mono- und Co-Kulturen vorhandenen flüchtigen Moleküle zu identifizieren, wurde eine kurze 1-h-Extraktion bei 70 °C mit 200 U/min Rührung durchgeführt. Aus den Mono- und Co-Kulturen zu 24- und 48-h-Zeitpunkten wurden 43 annotierte flüchtige Moleküle nachgewiesen (Abbildung 2), darunter Aldehyde, Ketone, Alkohole, Schwefelverbindungen, Kohlenwasserstoffe, Carbonsäuren oder Ester und Aromaten. Es gab eine kleine Anzahl flüchtiger Moleküle, die nur in bestimmten Mono- oder Co-Kulturen zu bestimmten Zeitpunkten nachgewiesen wurden. Beispielsweise wurden Acetoin und 3-Hydroxy-2-butanonacetat nur in den S. aureus-Kulturen zum 48-Stunden-Zeitpunkt nachgewiesen (Abbildung 2).

Flüchtiges 1-Propanol-2-methyl wurde nur in der Kokultur von P. aeruginosa und A. baumannii bei 48 h nachgewiesen (Abbildung 2). Ethylacetat war in A. baumannii-Kokulturen mit entweder S. aureus oder P. aeruginosa bei 48 h vorhanden (Abbildung 2). Die Metaboliten Heptan, 2,3-Dimethyl und Pentan, 2-methyl wurden in der A. baumannii-Kultur erst bei 24 h nachgewiesen (Abbildung 2). Acetaldehyd und Ethanol wiesen in der A. baumannii- und S. aureus-Kokultur zum 24-Stunden-Zeitpunkt höhere relative Häufigkeiten auf als 48 h und einer der Stämme in Kultur allein (Abbildung 2). Einige der flüchtigen Stoffe waren in Kulturen entweder zum 24- oder 48-Stunden-Zeitpunkt häufiger. Kurzkettige Fettsäuren, einschließlich Essigsäure, Butansäure und Propansäure, wiesen in Kulturen bei 48 h hohe relative Häufigkeiten auf, wurden aber in den 24-h-Kulturen nicht nachgewiesen (Abbildung 2). Hexan war in der TH-Kontrolle bei 24 h im Vergleich zu 48 h häufiger vorhanden (Abbildung 2).

Stabile Isotopenmarkierung von Stuhl-, Abwasser- und Speichelproben
Um die aktive Produktion flüchtiger Moleküle aus einer biologischen Probe zu identifizieren, wurden eine markierte Nährstoffquelle, 13° C Glucose oderD2O und Medien hinzugefügt, um das Wachstum der mikrobiellen Gemeinschaft zu unterstützen. Aus jeder der verschiedenen Probentypen von Stuhl-, Abwasser- und Speichelproben wurde eine einzigartige Probe in dreifacher Ausfertigung analysiert. Es gab mehr Einbau des 13C in vollständig markierte flüchtige Moleküle (Abbildung 3A-D) im Vergleich zum Einbau in Deuterium (Abbildung 3E). Das 13C wurde in 2-Butanon, 3-Hydroxy eingebaut; 2,3-Butandion; Essigsäure; und Phenol für alle Stuhl-, Abwasser- und Speichelproben (Abbildung 3A).

Die anderen markierten flüchtigen Stoffe wurden entweder in zwei oder einem Probentyp nachgewiesen. Zum Beispiel wurden Aceton, Butansäure und Propansäure als in Speichel und Abwasser markiert nachgewiesen (Abbildung 3B). Die markierten flüchtigen Stoffe, Dimethyltrisulfid und Disulfiddimethyl, wurden sowohl in Stuhl- als auch in Speichelproben angereichert (Abbildung 3C). Flüchtige Stoffe, 1-Propanol, 2-Butanon, Benzophenon, Ethanol und Methylthiolacetat wurden nur im Abwasser angereichert (Abbildung 3D). Das markierte flüchtige 2,3-Pentandoin wurde mit Speichel angereichert (Abbildung 3D). Deuterium wurde in die flüchtigen Stoffe Essigsäure eingebaut; Benzaldehyd, 4-methyl; Dimethyltrisulfid; und Phenol entweder aus Speichel- oder Abwasserproben (Abbildung 3E). Zusätzlich zu den isotopenangereicherten flüchtigen Stoffen wurden flüchtige Stoffe nachgewiesen, die keine eingebauten stabilen Isotope enthielten. Zum Beispiel wurden Pyrazinverbindungen, mit Ausnahme von Pyrazin, 2,5-Dimethyl, in Stuhl-, Abwasser- und Speichelproben nachgewiesen, aber nicht vollständig mit 13C angereichert (Ergänzende Abbildung S1).

Stabile Isotopenmarkierung von Sputumproben
Die stabile Isotopenmarkierungsstrategie wurde implementiert, um aktiv produzierte flüchtige Stoffe mit Sputumproben von sieben menschlichen Probanden mit Mukoviszidose zu identifizieren. Die flüchtigen Stoffe in der Probe wurden mit denen verglichen, die aus Proben hervorgingen, die mit einer stabilen Isotopenmarkierung kultiviert waren. Jede flüchtige Komponente jeder Probe wurde zweimal analysiert: vor und nach der Untersuchung stabiler Isotopen mit 13° C Glukose und Medien. Die von den Probanden gesammelten Proben umfassten drei verschiedene Zeitpunkte oder klinische Zustände: Ausgangswert, Exazerbation und Behandlung23. Die flüchtigen Stoffe, die in den kultivierten Sputumproben als markiert nachgewiesen wurden, wiesen im Vergleich zu den unmarkierten flüchtigen Stoffen aus den unkultivierten Sputumproben unterschiedliche relative Häufigkeiten auf. Die Kultivierung der Bedingungen in den stabilen Isotopenuntersuchungsexperimenten mit Sputum kann das Wachstum bestimmter Mikroben begünstigen, was zu Unterschieden in der relativen Häufigkeit flüchtiger Stoffe im Vergleich zu den unkultivierten Sputumproben führt.

Zum Beispiel waren Essigsäure, Dimethyltrisulfid, Aceton und Propanal, 2-Methyl in den kultivierten Sputumproben im Vergleich zu den unkultivierten Sputumproben häufiger vorhanden (Abbildung 4). Der Nachweis von 13 C-markiertem Ethanol, das in variablen Mengen in der Hintergrundraumluft vorhanden sein kann, liefert den Nachweis, dass das Ethanol aktiv durch mikrobiellen Stoffwechsel aus 13-C-Glukosehergestellt wurde. Das Ausmaß der Variation wurde nach Probanden erklärt, wie durch Permutational Multivariate Analysis of Variance (PERMANOVA) bewertet, und war auch für die beiden verschiedenen volatilen Datensätze unterschiedlich (Tabelle 1 und Supplemental Figure S2). Für den 13C-markierten kultivierten Sputum wurden 51% der Variation vom Probanden erklärt, während 33% der Variation durch das Subjekt aus den flüchtigen Stoffen in den unkultivierten Sputumproben erklärt wurden (Tabelle 1). Die Zusammensetzung der Mikrobiomgemeinschaft, wie sie durch die 16S rRNA-Amplikonsequenzierung der sieben Probanden bestimmt wurde, war für jedes Subjekt einzigartig (Ergänzende Abbildung S3), und die einzelnen Signaturen spiegelten sich auch in den kultivierten und unkultivierten flüchtigen Sputummolekülen wider, die nachgewiesen wurden.

Im kultivierten Sputum wurden 23 flüchtige Stoffe nachgewiesen, die vollständig mit 13Kohlenstoff markiert waren. Die mit Isotopen angereicherten (aktiven) flüchtigen Stoffe, die aus den Sputumproben nachgewiesen wurden, waren für jedes Subjekt unterschiedlich. Die flüchtigen Stoffe mit Isotopenanreicherung, die in den Sputumproben aller sieben Probanden nachgewiesen wurden, waren 2,3-Butandion; Essigsäure; Aceton; Dimethyltrisulfid; Disulfid, Dimethyl; und Pyrazin, 2,5-Dimethyl (Abbildung 5). Obwohl diese flüchtigen Stoffe bei allen Probanden nachgewiesen wurden, variierte die Isotopenanreicherung für jedes Subjekt. Proben aus Probanden 7 wiesen im Vergleich zu den anderen sechs Probanden eine höhere Isotopenanreicherung von Disulfiddimethyl auf (Abbildung 5B). Das Aceton war in den Fächern 4 und 6 höher (Abbildung 5). Einige flüchtige Stoffe wurden nur in bestimmten Fächern mit 13 °Cangereichert. Zum Beispiel wurden 1-Butanol, 3-Methyl und Propansäure, 2-Methyl nur in einer Teilmenge von Proben aus Subjekt 2 angereichert (Abbildung 5). Neben den isotopenangereicherten flüchtigen Stoffen wurden auch flüchtige Stoffe als unmarkiert aus demselben kultivierten Sputum nachgewiesen (Ergänzende Abbildung S4). Flüchtige 2-Piperidinan; Benzaldehyd, 4-methyl; Benzothiazol; Butansäure, 3-Methyl; hexanal; Hexan; Isopropylalkohol; Phenol; Propansäure, 2-Methyl; und Pyrrolo 1,2-apyrazin-1,4-dion, hexahydro wurden in den Sputumproben nachgewiesen, waren aber nicht isotopenangereichert (Ergänzende Abbildung S4).

Abbildung 1: Protokollschema Eine biologische Probe wird in eine Glasdurchstechflasche gegeben und mit der Deckelfolie und dem Headspace Sorbent Pen zusammengesetzt. Ein Vakuum wird auf die Durchstechflasche aufgebracht, bis ein Druck von ca. 30 mmHg erreicht ist. Die Vakuumquelle wird entfernt und die Durchstechflaschen werden in die Sorptionsstift-Extraktionseinheit gelegt, wo eine statische Extraktion mit Hilfe von Wärme, Bewegung und Zeit durchgeführt wird. Nach der Extraktion werden Fläschchen auf einen kalten Metallblock gelegt, um Wasser aus dem Kopfraum und HSP zu entfernen. Die HSPs werden gesammelt und mittels thermischer Desorption auf der GC-MS betrieben. Die Daten werden mit ChemStation, DExSI und R analysiert. Abkürzungen: HSP = Headspace Sorbent Pen; GC-MS = Gaschromatographie-Massenspektrometrie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Heatmap von Mono- und Co-Kulturen. VOCs, die aus Mono- und Co-Kulturen zu 24- und 48-Stunden-Zeitpunkten nachgewiesen wurden. Die Co-Kulturen sind die Kombinationen der Buchstaben, die jede Sorte darstellen. Alle Proben wurden für 1 h bei 70 °C mit 200 U/min Rühren extrahiert. Heatmap-Intensitätswerte sind Spalten-Z-Scores, normalisiert durch Metaboliten. Der Z-Score wurde durch die Differenz des Wertes vom Mittelwert der Werte, dividiert durch die Standardabweichung der Werte, berechnet. Das Dendrogramm wurde mit der Option cluster_cols in der Pheatmap-Funktion von R erzeugt. Das Dendrogramm stellt eine hierarchische Clusterbildung dar, bei der Metaboliten, die sich gruppieren, über Proben hinweg ähnlichere Z-Scores aufweisen. Abkürzungen: A = A. baumanii; P = P. aeruginosa; S = S. aureus; TH = Todd Hewitt media (Kontrolle). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Prozentuale Umwandlung von 13 ° C in flüchtige Molekülmasse in Stuhl-, Speichel- und Abwasserproben während 18Stunden gleichzeitiger Inkubation und Extraktion. Die prozentuale Umwandlung wurde für vollständig markierte Verbindungen berechnet, indem die Masse der vollständig markierten Verbindung (M + N) genommen und durch (M + N) + die Masse der unmarkierten flüchtigen Masse (M) dividiert wurde, wobei N die maximale Anzahl möglicher Kohlenstoffe (in A-D) oder Wasserstoff (in E) ist, die in jedem flüchtigen Molekül markiert werden können. Verbindungen gelten als vollständig markiert, wenn alle Kohlenstoffe des flüchtigen Stoffes durch 13C ersetzt werden. Wo Daten fehlen, wurde der flüchtige Wert nicht erkannt. Zum Beispiel wurde in (D) 1-Propanol in Stuhl- oder Speichelproben nicht nachgewiesen. Anzahl der Replikate pro Stichprobe = 3. (A) Die 13C-markierten flüchtigen Stoffe, die in allen Probentypen (Kot, Speichel und Abwasser) nachgewiesen wurden. (B) Die 13C-gekennzeichneten flüchtigen Stoffe wurden nur in Speichel- und Abwasserproben nachgewiesen. (C) Die 13C-markierten flüchtigen Stoffe, die in Kot- und Speichelproben nachgewiesen wurden. (D) Die 13C-markierten flüchtigen Stoffe, die in einem der drei verschiedenen Stichprobentypen nachgewiesen wurden. (E) Die deuteriummarkierten flüchtigen Moleküle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Heatmap von 13C-markierten flüchtigen Stoffen aus kultiviertem Sputum und flüchtigen Molekülen, die aus unkultiviertem Sputum nachgewiesen wurden. Die markierten flüchtigen Stoffe stammen aus den stabilen Isotopen-Sondierungsexperimenten, bei denen 13° C Glukose und Hirnherzinfusionsmedium während des Extraktionsschritts dem Sputum zugesetzt wurden, um das mikrobielle Wachstum zu kultivieren und die aktive flüchtige Produktion zu erfassen. Die unmarkierten flüchtigen Moleküle wurden direkt aus Sputumproben nachgewiesen. Die Heatmap-Intensitäten sind Z-Werte, wie in der Beschriftung von Abbildung 2 beschrieben. Die Z-Scores wurden jedoch innerhalb jedes Experiments für die kultivierten und unkultivierten Sputumexperimente berechnet. Das Dendrogramm wurde wie in Abbildung 2 beschrieben generiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Prozentuale Umwandlung von 13 ° C in flüchtige Molekülmasse in Sputumproben von sieben Probanden mit Mukoviszidose während 18Stunden gleichzeitiger Inkubation und Extraktion. Die prozentuale Umrechnung wurde wie in der Überschrift von Abbildung 3 beschrieben berechnet. Flüchtige Stoffe, die in Proben nicht nachgewiesen wurden, werden durch das Fehlen von Daten angezeigt. N = 1-3. (A) Die 13C-markierten flüchtigen Stoffe, die in der Mehrzahl der Sputumproben mit einem höheren prozentualen Umsatz nachgewiesen wurden. (B) Die 13C-markierten flüchtigen Stoffe, die in der Mehrzahl der Sputumproben mit einem niedrigeren prozentualen Umsatz nachgewiesen wurden. (C) Die 13C-markierten flüchtigen Stoffe, die in einer Minderheit der Sputumproben mit einem niedrigeren prozentualen Umsatz nachgewiesen wurden. Abkürzungen: B = Baseline; E = Exazerbation; T = Behandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Permutierte multivariate Varianzanalyse (PERMANOVA) von Sputumproben. Die PERMANOVA wurde mit der adonis-Funktion aus dem veganen Paket in R generiert.

Ergänzende Abbildung S1: Die relativen Häufigkeiten von markierten (M+N(max)) und unmarkierten (M+0) flüchtigen Abständen über Stuhl-, Speichel- und Abwasserproben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Nicht-metrische mehrdimensionale Skalierung von kultiviertem Sputum mit stabiler Isotopensondierung und unkultiviertem Sputum. (A) Das NMDS von kultiviertem Sputum mit 13C Glucose und Medien wurde mit k = 3 Dimensionen erzeugt. Der Spannungswert betrug 0,07. (B) Das NMDS von unkultiviertem Sputum wurde mit k = 3 Dimensionen erzeugt. Der Spannungswert lag bei 0,13. Abkürzungen: NMDS = non-metric multidimensional scaling; B = Ausgangswert; E = Exazerbation; T = Behandlung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Mikrobielle Zusammensetzung der Gemeinschaft von Sputumproben von Probanden mit Mukoviszidose. Bewertet durch 16S rRNA Amplicon Sequenzierung als Teil einer größeren Studie, weitere Informationen über den Ansatz gefunden in Carmody et al.2020 19. von Probanden mit Mukoviszidose. Jeder gestapelte Balken ist ein anderer Zeitpunkt. Abkürzungen: B = Ausgangswert, E = Exazerbation, T = Behandlung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S4: Die relativen Häufigkeiten von markierten (M+N(max)) und unmarkierten (M+0) flüchtigen Vorkommen über Sputumproben von sieben Probanden mit Mukoviszidose. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

V. L. V und S. J.B. D. waren ehemalige Mitarbeiter von Entech Instruments Inc., und K. W. ist Mitglied des Universitätsprogramms von Entech. J. P., J. K. und C. I. R. haben keine Interessenkonflikte zu erklären.