Dieses Protokoll beschreibt die Extraktion flüchtiger organischer Verbindungen aus einer biologischen Probe mit der vakuumunterstützten Sorptionsextraktionsmethode, der Gaschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie unter Verwendung der Entech Sample Preparation Rail und der Datenanalyse. Es beschreibt auch die Kultur biologischer Proben und die Untersuchung stabiler Isotopen.
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Methodenartikel
Gewinnung aktiv produzierter mikrobieller flüchtiger organischer Verbindungen aus humanassoziierten Proben mit vakuumgestützter Sorptionsmittelextraktion
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Flüchtige organische Verbindungen (VOC) aus biologischen Proben haben unbekannte Ursprünge. VOCs können vom Host oder von verschiedenen Organismen innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft des Wirts stammen. Um den Ursprung mikrobieller VOCs zu entwirren, wurden flüchtige Kopfraumanalysen von bakteriellen Mono- und Co-Kulturen von Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa und Acinetobacter baumannii sowie stabile Isotopenuntersuchungen in biologischen Proben von Kot, Speichel, Abwasser und Sputum durchgeführt. Mono- und Co-Kulturen wurden verwendet, um die flüchtige Produktion einzelner Bakterienspezies zu identifizieren oder in Kombination mit stabiler Isotopensondierung, um den aktiven Stoffwechsel von Mikroben aus den biologischen Proben zu identifizieren.
Vakuum-unterstützte Sorptionsmittelextraktion (VASE) wurde verwendet, um die VOCs zu extrahieren. VASE ist ein einfach zu bedienendes, kommerzialisiertes, lösungsmittelfreies Headspace-Extraktionsverfahren für halbflüchtige und flüchtige Verbindungen. Der Mangel an Lösungsmitteln und die während der Extraktion verwendeten Beivakuumbedingungen machen die Entwicklung einer Methode im Vergleich zu anderen Extraktionsoptionen wie Tert-Butylierung und Festphasen-Mikroextraktion relativ einfach und schnell. Der hier beschriebene Workflow wurde verwendet, um spezifische flüchtige Signaturen aus Mono- und Co-Kulturen zu identifizieren. Darüber hinaus identifizierte die Analyse der stabilen Isotopenuntersuchung von humanassoziierten biologischen Proben VOCs, die entweder üblicherweise oder einzigartig produziert wurden. Dieses Papier präsentiert den allgemeinen Arbeitsablauf und die experimentellen Überlegungen von VASE in Verbindung mit der Untersuchung stabiler Isotopen lebender mikrobieller Kulturen.
Einleitung
Flüchtige organische Verbindungen (VOCs) sind vielversprechend für den bakteriellen Nachweis und die Identifizierung, da sie von allen Organismen emittiert werden und verschiedene Mikroben einzigartige VOC-Signaturen haben. Flüchtige Moleküle wurden als nicht-invasive Messung zum Nachweis verschiedener Atemwegsinfektionen verwendet, einschließlich chronisch obstruktiver Lungenerkrankung1, Tuberkulose2 im Urin3 und beatmungsassoziierter Pneumonie4, zusätzlich zur Unterscheidung von Probanden mit Mukoviszidose (CF) von gesunden Kontrollpersonen 5,6
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Protokoll
1. Überlegungen zu Headspace Sorbent Pen (HSP) und Probenanalyse
HINWEIS: Das HSP, das das Sorptionsmittel Tenax TA enthält, wurde ausgewählt, um eine breite Palette von flüchtigen Stoffen zu erfassen. Tenax hat im Vergleich zu anderen Sorbentien eine geringere Affinität zu Wasser, wodurch es mehr VOCs aus Proben mit höherer Feuchtigkeit einfangen kann. Tenax hat auch einen geringen Gehalt an Verunreinigungen und kann für die Wiederverwendung konditioniert werden. Die Auswahl der Sorptionsmittel wurde auch unter Berücksichtigung der im GC-MS installierten Säule getroffen (siehe Materialtabelle).
- Erzeugen Sie Negat....
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Ergebnisse
Mono- und Co-Kulturen von S. aureus, P. aeruginosa und A. baumannii
Die Mono- und Co-Kulturen bestanden aus den Bakterienarten S. aureus, P. aeruginosa und A. baumannii. Dies sind häufige opportunistische Erreger, die in menschlichen Wunden und chronischen Infektionen vorkommen. Um die in den Mono- und Co-Kulturen vorhandenen flüchtigen Moleküle zu identifizieren, wurde ein.......
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Diskussion
Zur Identifizierung der flüchtigen Produktion in In-vitro-Kulturen und humanassoziierten Proben wurden flüchtige Analysen von Mono- und Co-Kulturen von P. aeruginosa, S. aureus und A. baumanii sowie stabile Isotopenuntersuchungen verschiedener biologischer Proben durchgeführt. In der Analyse für die Mono- und Co-Kulturen wurden flüchtige Stoffe durch eine kurze Extraktion für 1 h bei 70 °C nachgewiesen. Die flüchtige Analyse von Mono- und Co-Kulturen ermöglichte die Untersuchung der Verbindung.......
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Offenlegungen
V. L. V und S. J.B. D. waren ehemalige Mitarbeiter von Entech Instruments Inc., und K. W. ist Mitglied des Universitätsprogramms von Entech. J. P., J. K. und C. I. R. haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Danksagungen
Wir danken Heather Maughan und Linda M. Kalikin für die sorgfältige Bearbeitung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom NIH NHLBI (Grant 5R01HL136647-04) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 13C Glukose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Membranpumpe | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA-Fläschchen | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Schwarze Kappen mit Loch, kein Septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | hält die Deckelauskleidung auf dem Fläschchen |
| fest 24 mm Fläschchenauskleidung für Sorptionsstifte | Mit dem Entech Instruments | SP-L024S | können Pens die Oberseite des Fläschchens vakuumieren |
| 5600 Sorbent Pen Extraction Unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-Well-Assay-Platten | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) Medien | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 Säule | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0,25 mm ID, 1,40 μm Schichtdicke, aus GC-MS |
| Deuteriumoxid | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi-Software | Dexsi (Open Source) | ||
| GC-MS (7890A GC und 5975C inert XL MSD mit Drei-Achsen-Detektor) | Agilent | 7890A GC und 5975C inert XL MSD mit Drei-Achse Detektor | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Artikel für die Durchführung der Headspace-Extraktion im Bundle enthalten |
| Headspace Sorptionsstift (HSP) - blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace Sorptionsstift (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-Ringe | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Probenvorbereitung Schiene | Entech Instruments | ||
| Sorptionsstift Wärmekonditionierer | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) Medien | Sigma | T1438-500G |
Referenzen
- Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
- Nakhleh, M. K., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
