Methodenartikel

In vitro Dreidimensionaler Keimtest der Angiogenese unter Verwendung embryonaler Stammzellen der Maus für die Modellierung von Gefäßerkrankungen und Arzneimitteltests

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DOI:

10.3791/62554

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11. Mai 2021

 ,  ,  , 
1Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Department of Internal Medicine (Nephrology), Leiden University Medical Center, 2Institute Physics for Medicine Paris, INSERM U1273, ESPCI Paris, CNRS FRE 2031, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and PSL Research University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Assay verwendet embryonale Stammzellen der Maus, die in Embryoidkörperchen differenziert sind, die in 3D-Kollagengel kultiviert werden, um die biologischen Prozesse zu analysieren, die die Keimangiogenese in vitro steuern. Die Technik kann zum Testen von Medikamenten, zur Modellierung von Krankheiten und zur Untersuchung spezifischer Gene im Zusammenhang mit embryonal tödlichen Deletionen eingesetzt werden.

Zusammenfassung

Jüngste Fortschritte bei induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) und Geneditierungstechnologien ermöglichen die Entwicklung neuartiger menschlicher zellbasierter Krankheitsmodelle für phänotypische Wirkstoffforschungsprogramme (PDD). Obwohl diese neuartigen Geräte die Sicherheit und Wirksamkeit von Prüfpräparaten beim Menschen genauer vorhersagen könnten, stützt sich ihre Entwicklung bis zur klinischen Entwicklung immer noch stark auf Daten von Säugetieren, insbesondere auf die Verwendung von Mauskrankheitsmodellen. Parallel zu humanen Organoid- oder Organ-on-Chip-Krankheitsmodellen ist die Entwicklung relevanter In-vitro-Mausmodelle daher ein ungedeckter Bedarf für die Bewertung direkter Arzneimittelwirksamkeits- und Sicherheitsvergleiche zwischen Spezies und In-vivo- und In-vitro-Bedingungen. In dieser Arbeit wird ein vaskulärer Keimtest beschrieben, der embryonale Stammzellen der Maus verwendet, die in Embryoidkörper (EBs) differenziert sind. Vaskularisierte EBs, die auf 3D-Kollagengel kultiviert werden, entwickeln neue Blutgefäße, die sich ausdehnen, ein Prozess, der als Keimangiogenese bezeichnet wird. Dieses Modell rekapituliert die wichtigsten Merkmale der in vivo sprießenden Angiogenese - Bildung von Blutgefäßen aus einem bereits bestehenden vaskulären Netzwerk - einschließlich der Selektion von Endothelspitzenzellen, der Migration und Proliferation von Endothelzellen, der Zellführung, der Röhrenbildung und der Rekrutierung von Muralzellen. Es ist für das Screening auf Medikamente und Gene geeignet, die die Angiogenese modulieren, und zeigt Ähnlichkeiten mit kürzlich beschriebenen dreidimensionalen (3D) vaskulären Assays, die auf humanen iPSC-Technologien basieren.

Einleitung

In den letzten drei Jahrzehnten wurde die zielgerichtete Wirkstoffforschung (TDD) von der pharmazeutischen Industrie in großem Umfang in der Arzneimittelforschung eingesetzt. TDD beinhaltet ein definiertes molekulares Ziel, das eine wichtige Rolle bei einer Krankheit spielt, und beruht auf der Entwicklung relativ einfacher Zellkultursysteme und Readouts für das Wirkstoff-Screening1. Zu den meisten typischen Krankheitsmodellen, die in TDD-Programmen verwendet werden, gehören traditionelle Zellkulturmethoden wie Krebszellen oder immortalisierte Zelllinien, die in künstlichen Umgebungen und unphysiologischen Substraten gezüchtet werden. Obwohl viele dieser Modelle praktikable Werkzeuge zur Identifizierung erfolgreicher Arzneimittelkandidaten zur Verfügung gestellt haben, kann der Einsatz solcher Systeme aufgrund ihrer geringen Krankheitsrelevanz fraglich sein2.

Bei den meisten Krankheiten sind die zugrunde liegenden Mechanismen in der Tat komplex und verschiedene Zelltypen, unabhängige Signalwege und mehrere Gensätze tragen oft zu einem bestimmten Krankheitsphänotyp bei. Dies gilt auch für Erbkrankheiten, bei denen die Hauptursache eine Mutation in einem einzigen Gen ist. Mit dem jüngsten Aufkommen von Technologien für humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) und Geneditierungswerkzeugen ist es nun möglich, 3D-Organoide und Organ-on-Chip-Krankheitsmodelle zu generieren, die die menschliche Komplexität in vivo besser rekapitulieren könnten 3,4. Die Entwicklung solcher Technologien ist mit einem Wiederaufleben des Interesses an phänotypischen Wirkstoffforschungsprogrammen (PDD) verbunden1. PDD kann mit empirischem Screening verglichen werden, da sie nicht auf dem Wissen über die Identität eines bestimmten Wirkstoffziels oder einer Hypothese über seine Rolle bei der Krankheit beruht. Der PDD-Ansatz wird heute zunehmend als wichtiger Beitrag zur Entdeckung von First-in-Class-Medikamenten anerkannt5. Da die Entwicklung menschlicher Organoid- und Organ-on-Chip-Technologien noch in den Kinderschuhen steckt, wird erwartet, dass iPSC-Modelle (ergänzt durch innovative Bildgebungs- und maschinelle Lernwerkzeuge 6,7) in naher Zukunft mehrere neuartige komplexe zellbasierte Krankheitsmodelle für das Wirkstoffscreening und die damit verbundenen PDD-Programme bereitstellen werden, um die geringe Produktivität des TDD-Ansatzes zu überwinden8. 9. Sonstiges

Während menschliche Organoid- und Organ-on-Chip-Modelle wichtige Einblicke in die Komplexität von Krankheiten und die Identifizierung neuer Medikamente liefern können, ist die Einführung von Medikamenten in die neue klinische Praxis auch stark auf Daten aus Tiermodellen angewiesen, um ihre Wirksamkeit und Sicherheit zu bewerten. Unter ihnen sind genetisch veränderte Mäuse sicherlich die am meisten bevorzugten Säugetiermodelle. Sie haben viele Vorteile, da sie eine relativ kurze Generationszeit für Säugetiere haben, viele ähnliche Phänotypen wie menschliche Krankheiten haben und leicht genetisch manipuliert werden können. Sie werden daher in großem Umfang in Arzneimittelforschungsprogrammen eingesetzt10. Die Überbrückung der Kluft zwischen Mäusen und Menschen bleibt jedoch eine wichtige Herausforderung11. Die Entwicklung von In-vitro-Mausmodellen, die humanen Organoid- und Organ-on-Chip-Modellen entsprechen, könnte diese Lücke zumindest teilweise schließen, da sie direkte Vergleiche der Wirksamkeit und Sicherheit von Medikamenten zwischen In-vivo-Maus- und In-vitro-Humandaten ermöglicht.

In dieser Arbeit wird ein vaskulärer Keimtest in Maus-Embryoidkörpern (EBs) beschrieben. Blutgefäße bestehen aus Endothelzellen (innere Auskleidung der Gefäßwände), Wandzellen (glatte Gefäßmuskelzellen und Perizyten)12. Dieses Protokoll basiert auf der Differenzierung von embryonalen Stammzellen (mES-Zellen) der Maus in vaskularisierte EBs unter Verwendung von hängenden Tröpfchen, die die de novo Endothelzell- und Muralzelldifferenzierung rekapitulieren13,14. ES-Zellen der Maus können leicht in Kultur aus isolierten Tag-3.5-Blastozysten der Maus mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund etabliert werden15. Sie bieten auch Möglichkeiten für klonale Analysen, die Rückverfolgung von Abstammungslinien und können leicht genetisch manipuliert werden, um Krankheitsmodelle zu erstellen13,16.

Da Blutgefäße alle Organe ernähren, ist es nicht verwunderlich, dass viele, wenn nicht sogar alle, Krankheiten mit Veränderungen der Mikrogefäße verbunden sind. Unter pathologischen Zuständen können Endothelzellen einen aktivierten Zustand annehmen oder dysfunktional werden, was zum Absterben von Muralzellen oder zur Abwanderung von Blutgefäßen führt. Diese können zu einer übermäßigen Angiogenese oder zu einer Verdünnung der Gefäße führen, können einen abnormalen Blutfluss und eine defekte Blutgefäßbarriere induzieren, was zu einer Extravasation von Immunzellen und Entzündungen führt12,17,18,19. Die Forschung für die Entwicklung von Medikamenten, die Blutgefäße modulieren, ist daher hoch, und es wurden bereits mehrere molekulare Akteure und Konzepte für die therapeutische Ausrichtung identifiziert. In diesem Zusammenhang eignet sich das beschriebene Protokoll besonders für die Erstellung von Krankheitsmodellen und für die Erprobung von Medikamenten, da es die wichtigsten Merkmale der in vivo keimenden Angiogenese rekapituliert, einschließlich der Selektion von Endothelspitzen- und Stielzellen, der Migration und Proliferation von Endothelzellen, der Führung von Endothelzellen, der Röhrenbildung und der Rekrutierung von Muralzellen. Es zeigt auch Ähnlichkeiten mit kürzlich beschriebenen 3D-vaskulären Assays, die auf humanen iPSC-Technologien basieren20.

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Protokoll

1. Medienvorbereitung und -kultur des mESC

  1. Bereiten Sie konditioniertes Medium +/- (CM+/-) mit dem Nahrungsergänzungsmittel 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) Medium mit 10% (vol/vol) hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FBS), 0,05 mM β-Mercaptoethanol, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA 1x), 2 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat zu.
  2. Bereiten Sie konditioniertes Medium +/+ (CM+/+) unter Verwendung des Nahrungsergänzungsmittels CM+/- medium mit Leukämie-Hemmfaktor (LIF) (1.500 U/ml) und 0,1 mM β-Mercaptoethanol zu.
  3. Konditioniertes Medium +/+ in Gegenwart von zwei Inhibitoren (CM+/+ 2i) unter Verwendung des Supplements CM+/+ Medium mit 1 μM PD0325901 und 3 μM CHIR99021 herstellen.
  4. Bereiten Sie eine 0,1%ige Gelatinelösung vor, indem Sie 25 ml vorgewärmte 2%ige Gelatinelösung in 500 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium (DPBS) mischen.
  5. Bereiten Sie 10x Trypsin-Versenphosphat-Puffer (TVP 10x) vor, indem Sie Trypsin (2,5 %) mit TVP 1x (9,5 %, 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0,01 % Hühnerserum, 0,01 % Trypsin (2,5 %) inH2O) mischen (Verhältnis 1:10, vol/vol).
    Anmerkungen: Filtern Sie alle Lösungen durch einen 0,22-μm-Porenfilter. Lagern Sie das Nährmedium langfristig bei -20 °C und bewahren Sie andere Reagenzien bis zu 3 Wochen bei 4 °C auf (siehe Materialtabelle).
  6. Zwei 12-Well-Zellkulturplatten mit 0,1%iger Gelatinelösung (500 μL pro Well) bestreichen und 30 min in einem CO 2 -Inkubator (37 °C, 5% CO2, feuchte Atmosphäre) inkubieren.
  7. Waschen Sie die gelatinebeschichteten Platten mit PBS und fügen Sie 500 μL CM+/- Medium hinzu.
  8. Tauen Sie zwei Fläschchen mit 1 x 106 kryokonservierten bestrahlten embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) bei 37 °C auf und überführen Sie die Zellsuspension in ein konisches Röhrchen mit 5 ml CM+/- Medium.
  9. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Saugen Sie das Medium an und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 12 ml CM+/- Medium mit einer Konzentration von 1,67 x 105 Zellen pro ml.
  10. Säen Sie 500 μl MEF-Suspension in eine 12-Well-Zellkulturplatte (2,4 x 10,5 Zellen procm2) und inkubieren Sie die Platte über Nacht (o/n) in einem CO2 -Inkubator.
  11. Eine Durchstechflasche mit kryokonservierten mES-Zellen (1 x 106) wird in CM+/+ 2i-Medium aufgetaut.
  12. Die mESC-Suspension wird auf einer vorgewaschenen 12-Well-Platte mit MEFs in 1 ml CM+/+ 2i-Medium ausgesät und die Platte in einen CO2 -Inkubator überführt. Frischen Sie das Medium täglich auf.
  13. Bei 70% Konfluenz werden die mESC-Kolonien mit DPBS gewaschen. Fügen Sie 150 μl warmen 10x TVP-Puffer hinzu und inkubieren Sie ihn 30 s lang bei RT, um die enzymatische Dissoziation zu initiieren.
  14. Entfernen Sie vorsichtig den TVP-Puffer, resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml CM+/+ 2i-Medium und dissoziieren Sie die Kolonien durch sanftes Pipettieren in einzelne Zellen.
  15. Passage der Zellen, indem man sie auf eine neue 12-Well-Zellkulturplatte mit MEFs überführt (Spaltungsverhältnis: 1:3-1:5). Mischen Sie vorsichtig, um die Zellen zu verteilen, und inkubieren Sie sie in einem CO2 - Inkubator.
  16. Frischen Sie das Nährmedium (2-3 ml) auf und beobachten Sie täglich das Zellwachstum/die Zellmorphologie. Wiederholen Sie die serielle Übergabe bei 70 % Konfluenz alle 2 Tage. Wechseln Sie für zwei Durchgänge auf CM+/+ Medium, bevor Sie die Zelldifferenzierung einleiten.

2. EB-Bildung im hängenden Tropfen

  1. Stellen Sie frisches Mesodermdifferenzierungsmedium her, indem Sie das CM+/- Medium mit basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) (50 ng·mL-1) und mit Bone Morphogenetic Protein 4 (BMP-4) (5 ng·mL-1) ergänzen und bis zur Verwendung bei 4 °C halten.
  2. Eine Vertiefung der 6-Well-Zellkulturplatte mit 500 μL 0,1%iger Gelatinelösung bestreichen und für 30 min in einen CO2 -Inkubator geben.
  3. Waschen Sie die gelatinebeschichteten Platten mit PBS und fügen Sie 500 μL CM+/- Medium hinzu.
  4. Um eine reine Population von mES-Zellen zu erhalten, trypsinisieren Sie die Zellkulturplatte mit 10x TVP-Puffer für 30 s bei RT, resuspendieren Sie die Zellen in 1 mL Mesoderm-Differenzierungsmedium und übertragen Sie sie dann für 30 min auf die gelatinebeschichtete 6-Well-Platte, damit sich die MEFs anlagern können, während die mESCs in Suspension bleiben.
  5. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem konischen 50-ml-Röhrchen und zählen Sie die Zellen mit einem Neubauer-Hämozytometer und einem Trypanblau-Farbstoff für einen Lebend-/Totzellausschluss.
  6. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in Mesodermdifferenzierungsmedium, um 4,55 x 104 Zellen pro ml zu erreichen.
  7. Füllen Sie den Boden von 94 mm Polystyrolschalen mit niedrigem Aufsatz mit 15 ml sterilem Wasser.
    HINWEIS: Vier Schalen mit hängenden Tropfen (1,6 x 105 Zellen in 3,52 ml Medium) sind erforderlich, um eine bestimmte Erkrankung mit dem 3D-Keimungsangiogenese-Assay zu testen.
  8. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles Kunststoffreservoir und beladen Sie vier Positionen einer Mehrkanalpipette mit 22 μl Zellsuspension pro Kanal (1 x 10,3 Zellen pro 22 μl Tropfen).
  9. Heben Sie den Deckel der 94-mm-Schüssel an, drehen Sie ihn um und legen Sie ihn mit der Innenseite nach oben auf die saubere Oberfläche des Durchlaufschranks.
  10. Geben Sie 40 Tropfen der Zellsuspension auf die Innenfläche jedes Deckels. Drehen Sie den Deckel vorsichtig und ungestört um und setzen Sie ihn wieder auf die Schale, so dass die Tropfen dem Wasser zugewandt sind.
  11. Inkubieren Sie die Gerichte in einem CO2 - Inkubator. Betrachten Sie dies als Differenzierungstag 0. Bewahren Sie die Platten 4 Tage lang auf, um EBs zu bilden.

3. Konkurrenz-Assay für die Position der Spitzenzelle

  1. Kultivieren Sie eine fluoreszierende und eine nicht fluoreszierende mESC-Linie, wie zuvor beschrieben13. Als Beispiel werden gelb markierte 7ACS/EYFP-mESCs und R1-mESCs verwendet.
  2. Bereiten Sie Mosaik-EBs vor, indem Sie die beiden mESC-Linien zu gleichen Teilen mischen (Verhältnis 1:1) und inkubieren Sie die hängenden Tropfenschalen in einem CO 2 -Inkubator, wie in Schritt2 beschrieben.

4. Schwimmende EBs-Kultur zur vaskulären Differenzierung

  1. Bevor Sie EBs aus den hängenden Tropfen sammeln, bereiten Sie Folgendes vor.
    1. Bereiten Sie 5%ige Agarlösung inH2Ovor und sterilisieren Sie sie durch Autoklavieren (20 min bei 120 °C).
    2. Verwenden Sie die warme 5%ige Agarlösung, um G-MEM BHK-21 Medium mit 1%igem Agar zuzubereiten, und gießen Sie schnell 3 ml in eine der 60-mm-Styroporschalen. Lassen Sie den Agar 1 h bei RT erstarren. Lagern Sie das Geschirr bis zur Verwendung bei 4 °C.
  2. Bereiten Sie frisches 2x vaskuläres Differenzierungsmedium zu, indem Sie das CM+/- Medium mit bFGF (100 ng·mL-1) und VEGF-A (50 ng·mL-1) ergänzen. Lagern Sie das Medium bis zur Verwendung bei 4 °C.
  3. Sammeln Sie die hängenden Tropfen in einem konischen 15-ml-Röhrchen mit einer P1000-Pipette und entfernen Sie den Überstand nach einigen Minuten EB-Sedimentation.
  4. Resuspendieren Sie die EBs in 3 mL 2x vaskulärem Differenzierungsmedium, überführen Sie die EB-Suspension in eine agarbeschichtete Schale und verteilen Sie die EBs homogen, um eine Aggregation zu vermeiden.
  5. Die Schalen werden im CO 2 -Inkubator inkubiert und das Medium alle2 Tage bis zum 9. Tag mit 1x vaskulärem Differenzierungsmedium in Gegenwart von bFGF (50 ng·mL-1) und VEGF-A (25 ng·mL-1) aufgefrischt.
  6. Alternativ kann Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) (10 ng·mL-1 an Tag 4 und 5 ng·mL-1 an Tag 6 und Tag 8) in das vaskuläre Differenzierungsmedium gegeben werden, um die Differenzierung der Muralzellen zu fördern.

5. Durchflusszytometrische Analyse

  1. Sammeln Sie die 9 Tage alten EBs in einem konischen 15-ml-Röhrchen mit einer P1000-Pipette und waschen Sie sie einmal mit warmem PBS.
  2. Fügen Sie 1 ml G-MEM BHK-21-Medium hinzu, das 0,2 mg·ml-1 Kollagenase A enthält, und inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang in einem CO2 -Inkubator.
  3. Dissoziieren Sie die EBs, indem Sie mit einer P1000-Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren.
  4. Stoppen Sie die Kollagenaseaktivität durch Zugabe von 1 ml kaltem G-MEM BHK-21-Medium mit 10 % FBS.
  5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei RT.
  6. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl PBS mit 2% FBS.
  7. Zählen Sie die Zellen mit einem Neubauer-Hämozytometer.
  8. Resuspendieren Sie 400.000 Zellen in 100 μl PBS mit 2 % FBS pro Färbebedingung.
  9. Die Zellen werden 45 min lang bei 4 °C mit folgenden Antikörpern inkubiert: APC-konjugierter Ratten-Anti-Maus-Anti-Maus-PECAM-1-Antikörper (Klon MEC13.3) und FITC-konjugierter Ratten-Anti-Maus-CD45 (Klon 30-F11) oder Isotyp-Kontroll-Antikörper.
  10. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 ml PBS, das 2 % FBS enthält.
  11. Resuspendieren Sie die Zellen, um eine Endkonzentration von 5 x 106 Zellen pro ml zu erreichen.
  12. Filtern Sie die Zellen mit einem Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden und einem Schnappverschluss für das Zellsieb.
  13. Analysieren Sie 20.000 PECAM-1 (+)-Ereignisse mittels Durchflusszytometrie.

6.3D Assay zur Keimangiogenese und Immunfluoreszenzfärbung

  1. Bereiten Sie an Tag 9 ein Keimmedium vor, indem Sie 10 % FBS (vol/vol), bFGF (50 ng·mL-1), VEGF-A (25 ng·mL-1), humanes rekombinantes Erythropoetin (hEPO) (20 ng·mL-1), humanes Interleukin-6 (IL-6) (10 ng·mL-1), 0,05 mM β-Mercaptoethanol, NEAA (1x), L-Glutamin (1x), Natriumpyruvat (1x), Typ-I-Rattenschwanzkollagen (1,25 mg·ml-1), und NaOH (3,1 mM) auf GMEM BHK-1 Medium.
  2. Um eine Kollagengelierung zu vermeiden, bewahren Sie das Keimmedium bis zur Verwendung auf Eis auf.
  3. Um die Wirkung von pro/anti-angiogenen Molekülen zu bewerten, fügen Sie dem Keimmedium das ausgewählte Medikament oder Vehikel in der ausgewählten Konzentration hinzu.
  4. Sammeln Sie 9 Tage alte EBs aus einer 60-mm-Agarschale in einem konischen 15-ml-Röhrchen (entspricht einer Bedingung) und entfernen Sie den Überstand nach einigen Minuten Sedimentation.
  5. Decken Sie den Boden einer 35-mm-Kulturschale mit 1 ml des Keimmediums ab und inkubieren Sie ihn 5 Minuten lang bei 37 °C, um die Gelierung einzuleiten.
  6. Resuspendieren Sie die EBs in 2 ml kaltem Keimmedium.
  7. Übertragen Sie die Suspension in die 35-mm-Kulturschale, die mit der ersten Schicht Keimmedium beschichtet ist.
  8. Verteilen Sie die EBs auf der gesamten Platte und stellen Sie sicher, dass sie sich in gleichem Abstand zueinander befinden. Inkubieren Sie das Gericht in einem CO2 - Inkubator. Die erste Sprossenbildung erfolgt innerhalb von 24-48 h.
  9. An Tag 12 wird das EBs-haltige Kollagengel vorsichtig mit einem Spatel auf einen Objektträger (75 x 26 mm) übertragen.
  10. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit einer Pipette (P1000) und dehydrieren Sie das Gel, indem Sie eine Mullfolie aus Nylonleinen und saugfähige Filterkarten (Gellöschpapier) auf das Gel legen. Üben Sie Druck aus, indem Sie ein Gewicht (250 g) für 2 Minuten platzieren. Entfernen Sie vorsichtig das Nylon-/Filterpapier und lassen Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei RT an der Luft trocknen.
  11. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS für 5 min bei RT.
  12. Fixieren Sie die EBs mit Zinklösung (siehe Materialtabelle) o/n bei 4 °C. Alternativ fixieren Sie die mosaikfluoreszierenden EBs mit Paraformaldehyd (PFA) (4%) o/n bei 4 °C im Dunkeln.
  13. Entferne das Fixiermittel. Waschen Sie die Objektträger fünfmal mit PBS für 5 min bei RT.
  14. Permeabilisieren Sie die EBs in PBS, die 0,1% Triton-X100 enthalten, für 15 min bei RT.
  15. Entfernen Sie die Permeabilisierungslösung. Waschen Sie die Objektträger fünfmal mit PBS für 5 Minuten.
  16. Inkubieren Sie die EBs im Blockierungspuffer (PBS mit 2% Kälberserumalbumin, BSA) für 1 h bei RT.
  17. Um die Endothelsprossen zu färben, verwenden Sie einen Anti-Maus-Anti-PECAM-1-Primärantikörper der Ratte (Verdünnung 1:100) im Blockierungspuffer o/n bei 4 °C.
  18. Waschen Sie die Objektträger fünfmal mit PBS für 5 Minuten.
  19. Inkubieren Sie die Objektträger mit dem Anti-Ratten-Sekundärantikörper Alexa 555 für Ziegen in Blockierungspuffer (1:250-Verdünnung) und bei Bedarf mit FITC-konjugiertem Anti-α-SMA-Antikörper im Blocking-Puffer (1:250-Verdünnung), um Wandzellen 2 h lang bei RT im Dunkeln zu färben.
  20. Waschen Sie die Objektträger dreimal 5 min lang mit PBS und einmal mit H20, bevor Sie sie montieren.

7. Konfokale Bildgebung, morphometrische und quantitative Analyse von EB-Endothelsprossen

  1. Hochauflösende Bilder der immungefärbten EBs durch Zusammenführung der Fokusebene (z-Stacking) mit einem konfokalen Mikroskop aufnehmen. Verwenden Sie ein Objektiv mit 10-facher Vergrößerung, um ganze EBs abzubilden.
  2. Analysieren Sie die mit ImageJ aufgenommenen Bilder, um die Morphologie zu bewerten und die Eigenschaften von PECAM-1-positiven Endothelsprossen gemäß etablierten Quantifizierungsmethoden zu quantifizieren13,14,21.
    1. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Endothelsprossen pro EBs, indem Sie die Gesamtzahl der Sprossen pro einzelnen EBs manuell zählen.
    2. Messen Sie die einzelnen Sprossenlängen mit dem ImageJ-Zeichenwerkzeug. Definieren Sie die Basis des Endothelsprosses beginnend im EB-Kernbereich und ziehen Sie manuell eine Linie bis zum Ende der Sprossenspitze.
    3. Berechnen Sie die mittlere Anzahl der Spitzenzellen pro Spross, indem Sie die Anzahl der Spitzenzellen pro einzelnen Spross manuell zählen, und berechnen Sie dann den Mittelwert pro EB.
    4. Berechnen Sie die Ausrichtung der Filopodien, indem Sie die Achse des Elternsprosses manuell bestimmen, und messen Sie den spitzen Winkel zwischen ihnen mit dem Winkelwerkzeug der ImageJ-Software. Berechnen Sie die Anzahl der Sprossen mit einer Ausrichtung >50° und teilen Sie sie durch die Gesamtzahl der Sprossen des gewünschten EB.
      HINWEIS: Die Winkel reichten immer von 0° bis 90°.
  3. Nehmen Sie hochauflösende Bilder der immungefärbten EBs mit einem konfokalen Mikroskop auf. Verwenden Sie ein Objektiv mit 40-facher Vergrößerung, um hochauflösende Bilder einzelner Endothelsprossen zu erstellen.
  4. Quantifizieren Sie die Gefäßabdeckung von PECAM-1-positiven EC-Sprossen, die von α-SMA-positiven MCs umgeben sind, mithilfe der ImageJ-Software.
    1. Teilen Sie die zusammengefügten Bilder in separate rote und grüne Kanäle auf.
    2. Konvertieren Sie die Bilder in ihre binäre Form.
    3. Messen Sie die gesamte Zellfläche des Sprosses, die separat von PECAM-1 (rot markierte Endothelzellen) und von α-SMA-positiven Zellen (grün markierte Wandzellen) besetzt ist.
    4. Generieren Sie das zusammengeführte Bild mit der Bildrechnerfunktion und dem AND-Operator. Messen Sie die gesamte zelluläre Fläche des Bildes. Um die Abdeckung zu berechnen, teilen Sie die Fläche des kolokalisierten Bildes durch die Fläche des PECAM-1-Binärbildes.
  5. Um die Zellkonkurrenz um die Position der Endothelspitzen-/Stielzellen von Sprossen, die von Mosaik-EBs entwickelt wurden, zu analysieren, wird die Anzahl der Spitzenzellen manuell bewertet und ihre genotypische Herkunft anhand des Fluoreszenzsignals markiert. Berechnen Sie die Mittelwerte pro EB.

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Ergebnisse

Die Protokollübersicht des Blutgefäß-Sprossen-Assays ist in Abbildung 1 dargestellt. Neun Tage alte EBs, die aus drei unabhängigen 129/Ola mESC-Linien (Z/Red, R1 und E14) stammten, wurden mit Hilfe von Kollagenase A enzymatisch in einzelne Zellen dissoziiert. Die Zellen wurden auf PECAM-1 gefärbt und wie beschrieben mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) analysiert. Alle Zelllinien zeigten eine robuste Endotheldifferenzierung, und es wurden keine Unterschiede in ihrer Fähigkei...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt einen unvoreingenommenen, robusten und reproduzierbaren 3D-EB-basierten vaskulären Sprouting-Assay, der für das Screening auf Medikamente und Gene geeignet ist, die die Angiogenese modulieren. Diese Methode bietet Vorteile gegenüber vielen weit verbreiteten zweidimensionalen (2D) Assays, bei denen Endothelzellkulturen wie Human Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) zur Überwachung der Migration (Lateral Scratch Assay oder der Boyden-Kammer-Assay)22,23 oder der Proliferation (Zählen der Zellanzahl...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), des Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND und der Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-MercaptoethanolMilipore, Merck805740Biologische Gefahr: Beim Umgang mit
Agar NobleDifco, BD Pharmigen214220
Alexa Fluo 555 Ziege Anti Ratte IgGLife TechnologiesA21434
APC konjugierter Ratte Anti-Maus PECAM-1 Antikörper (Klon MEC13.3)BD Biosciences551262
APC Ratte IgG2a & Kappa; Isotyp-Steuerung (Klonen  R35-95)BD Biosciences553932
Axiovert 25 Invers-Phasenkontrast-GewebekulturmikroskopZEISS
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)Peprotech450-33
Tischzentrifuge, Allegra X-15RBeckman Coulter392932
Biosicherheitswerkbank BioVanguard (Green Line)Telstar133H401001
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-AldrichA9418
Zellzählkammer, Buerker, 0,100 mmMarienfeld640211
Zellkulturschalen 60 x 15 mmCorning353802
Zellkulturschalen, 35 x 10 mmCorning353801
Zellkulturplatten 12 WellsCorning3512
CFX96 Touch Real-Time PCR NachweissystemBiorad1855196
HühnerserumSigma-AldrichC5405
CHIR-99021 (CT99021) HClSelleckchemS2924
Kollagen I, hohe Konzentration, Rattenschwanz, 100 mgCorning354249
Kollagenase ARoche10103586001
konfokales Laserscanning Mikroskop, TCS SP5Leica
Deckbrille, 24 & 50 mmVwr631-0146
DAPT γ? SekretasehemmerSigma AldrichD5942
DC101 Anti-Maus VEGFR-2 KlonBioXcellBP0060
DC101 Isotyp Ratte IgG1BioXcellBP0290
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-AldrichD2438-5XBiogefährdung: Beim Umgang mit
DPBS (10x) sollten angemessene Sicherheitshinweise befolgt werden, kein Kalzium, kein MagnesiumGibco, Thermofisher scientific14200067
EDTA 40 mMGibco, Thermofisher scientific15575-038
Embryonale Stammzellen Fötales RinderserumGibco, Thermofisher scientific16141-079Sollte auf maximale Lebensfähigkeit und Wachstum von ES-Zellen getestet werden. Heizung bei 60° inaktivieren; C und speichern bei − 20 &Grad; C für bis zu 1 Jahr
Eppendorf Mikrozentrifuge 5415REppendorf AG 
Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2,5 & Mikro; g) (1 ml)Roche11120166001
ESGRO rekombinantes Maus-LIF-Protein (10? Einheiten    1 mL)Milipore, MerckESG1107
Falcon Röhrchen 15 mLGreiner Bio-One188271
Falcon Röhrchen 50 mLGreiner Bio-0ne227270
Filterspitze, klar, steril F.Gilson, P-200Greiner Bio-One739288
Filterspitze, klar, steril F.Gilson, P10Greiner Bio-One771288
Filterspitze, klar , steril F.Gilson, P1000Greiner Bio-One740288
FITC konjugiert anti-α Aktin der glatten Muskulatur (SMA) (Klon 1A4)Sigma AldrichF3777
FITC-konjugiertes Ratten-Anti-Maus-CD45 (Klon 30-F11)Biolegend103107
FITC Ratte IgG2b, κ Isotyp Ctrl Antikörper (Klon RTK4530)Biolegend400605
Fluorzierende EindeckmedienDAKOS3023
GaskompresseCutisoft45846
Gaze Cutisoft 10 x 10 cmBsn Medical45844_00
Gel-Löschpapier, Sorte GB003WhatmanWHA10547922
Gelatinelösung, Typ BSigma-AldrichG1393-100 ml
Glasgow's MEM (GMEM)Gibco, Thermofisher wissenschaftliches21710082
IHC Zink FixativBD Pharmigen550523
IncuSafe CO2 InkubatorPHCBiMCO-170AICUV-PE
Interleukin-6, human (hIL-6)Roche11138600001
L-Glutamin 200 mMGibco, Thermofisher scientific25030-024
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)Gibco, Thermofisher scientific11140035
ObjektträgerboxKartell Labware278
Objektträger, StarfrostKnittel GlasVS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00110467
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00148981
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00093576
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00154014
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00096292
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagen
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT01658692
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00097020
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT00156982
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00153104
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT01052044
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00114576
Maus (ICR) inaktivierte embryonale Fibroblasten  (2 M)Gibco, Thermofisher scientificA24903Fläschchen in flüssigem Stickstoff (195,79 &Grad; C) auf unbestimmte Zeit
embryonale Stammzelllinie der Maus 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)ATCCSCRC-1033Erzeugt von Dr. A. Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Kanada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1– 2), 79– 90 (1998)].
Embryonale Stammzelllinien Acvrl1 +/- und Acvrl1 +/+Erzeugt am Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698– 2712 (2018)].
Embryonale Stammzellen der Maus Linie E14Zur Verfügung gestellt vom Labor M Letarte und erzeugt nach Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635– 3642 (2001).
Embryonale Stammzellen der Maus Linie R1 (ATCC SCRC-1011)ATCCSCRC-1011Erzeugt von Dr. A. Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Kanada. [Nagy, A., et al., Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424– 8428 (1993)].
Embryonale Stammzellen der Maus Linie Z/Red (Stamm 129/Ola)Erzeugt von Dr. A. Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Kanada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241– 246 (2004)].
NanoDrop 1000 UV/VIS SpektralphotometerThermo Fischer ScientificND-1000
PD0325901SelleckchemS1036
PDGF-BB, rekombinant humanPeprotech100-14B
Pecam-1 Antikörper, Ratte Anti-MausBD Biosciences550274
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Gibco, Thermofisher scientific
Petrischale, PS, 94/16 mm, Standard, mit Belüftungsöffnungen, sterilGreiner Bio-One633181
Pipetboy acu 2Integra-Biosciences155 019
Pipetman G Mehrkanal P8 x 200GGilsonF144072
Pipetman G Starter Kit, 4 Pipetten Kit, P2G, P20G, P200G, P1000GGilsonF167360
rekombinant human BMP-4 ProteinR& T D Systems314-BP
RNeasy Plus mini KitQIAGEN74134
Serologische Pipetten, 10 mLGreiner Bio-One607 180
Serologische Pipetten, 25 mLGreiner Bio-One760 180
Serologische Pipetten, 5mL Greiner Bio-One606 180
Natriumhydroxid (NaOH)Merck106498
Natriumpyruvat 100 mMGibco, Thermofisher wissenschaftliche11360039
Reagenzgläser 5ml Rundboden mit ZellsiebkappeCorning352235
Thermocycler, T100Biorad1861096
Triton X-100 (BioXtra)Sigma AldrichT9284
Trypanblau Lösung, 0,4%Gibco, Thermofisher wissenschaftlich
Trypsin (2,5%)Gibco, Thermofisher wissenschaftliches15090046
Vakuumfilter-/Vorratsflaschensystem, 500 mLCorning430758
VEGFA165 , rekombinante MausPeprotech450-32
Wasser, sterilesFresenius-KabiB230531
Wasserbad, Lab-Line DigitalThermo Fischer Scientific18052A
Z605212QT000990641514012215250061

Referenzen

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