Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تقييم الاستجابات المناعية التنفسية للمستدمية النزلية

Published: June 29, 2021 doi: 10.3791/62572
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 2,4, 5, 1,2
1Monash Lung and Sleep, Monash Medical Centre, 2Monash University Department of Medicine, Monash Medical Centre, 3Flow Cytometry Science Technology Platform, Francis Crick Institute, 4Clinical Immunology, Monash Medical Centre, 5Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University

Summary

المستدمية النزلية تحفز الالتهاب في الجهاز التنفسي. ستركز هذه المقالة على استخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر لتحديد الاستجابات المناعية بواسطة الخلايا البلعمية والخلايا الليمفاوية استجابة لهذه البكتيريا.

Abstract

المستدمية النزلية (Hi) هي بكتيريا منتشرة توجد في مجموعة من أمراض الجهاز التنفسي. يمكن استخدام مجموعة متنوعة من المقايسات / التقنيات المختلفة لتقييم الاستجابة المناعية التنفسية / الالتهابية لهذه البكتيريا. قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر هي تقنيات قائمة على التألق تسمح بالتوصيف التفصيلي للاستجابات البيولوجية. يمكن استخدام أشكال مختلفة من مستضد Hi ، بما في ذلك مكونات جدار الخلية ، والمستحضرات المقتولة / المعطلة ، والبكتيريا الحية. Hi هي بكتيريا شديدة الحساسية تتطلب وسائط مخصبة ولكن من السهل عموما أن تنمو في إعدادات المختبر القياسية. يمكن الحصول على عينات الأنسجة للتحفيز باستخدام Hi من الدم المحيطي أو تنظير القصبات أو الرئة المقطوعة (على سبيل المثال ، في المرضى الذين يخضعون لعملية جراحية لعلاج سرطان الرئة). يمكن تقييم وظيفة البلاعم والعدلات بشكل شامل باستخدام قياس التدفق الخلوي مع مجموعة متنوعة من المعلمات التي تم قياسها ، بما في ذلك البلعمة وأنواع الأكسجين التفاعلية وإنتاج السيتوكين داخل الخلايا. يمكن تقييم وظيفة الخلايا الليمفاوية (على سبيل المثال ، الخلية التائية ووظيفة الخلية القاتلة الطبيعية) على وجه التحديد باستخدام قياس التدفق الخلوي ، بشكل أساسي لإنتاج السيتوكين داخل الخلايا. عدوى Hi هي محفز قوي لإنتاج المصيدة خارج الخلية ، سواء عن طريق العدلات (NETs) أو الضامة (METs). يمكن القول إن الفحص المجهري متحد البؤر هو الطريقة المثلى لتقييم تعبير NET و MET ، والذي يمكن استخدامه أيضا لتقييم نشاط الأنزيم البروتيني. يمكن تقييم مناعة الرئة ضد المستدمية النزلية باستخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر.

Introduction

المستدمية النزلية (Hi) هي بكتيريا متعايشة طبيعية موجودة في البلعوم لدى معظم البالغين الأصحاء. قد تحتوي Hi على كبسولة عديد السكاريد (الأنواع A-F ، على سبيل المثال ، النوع B أو HiB) أو تفتقر إلى كبسولة وتكون غير قابلة للكتابة (NTHi) 1. يبدأ استعمار الغشاء المخاطي بهذه البكتيريا في مرحلة الطفولة المبكرة ، وهناك دوران لسلالات استعمارية مختلفة2. هذه البكتيريا قادرة أيضا على غزو كل من الجهاز التنفسي العلوي والسفلي. في هذا السياق ، قد يحفز تنشيط الاستجابة المناعية والالتهاب 3,4. قد تسبب هذه الاستجابة الالتهابية مرضا سريريا وتساهم في مجموعة متنوعة من أمراض الجهاز التنفسي المهمة ، بما في ذلك التهاب الجيوب الأنفية والتهاب الأذن الوسطى والتهاب الشعب الهوائية والتليف الكيسي والالتهاب الرئوي ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). معظم هذه الحالات ناتجة عن سلالات NTHi2. سوف تصف هذه المقالة طرق تقييم الاستجابات المناعية التنفسية ل Hi باستخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر.

تم تكييف الطرق الموضحة أدناه من التقنيات الراسخة التي تم تعديلها لتقييم الاستجابة الالتهابية ل Hi. يعد اختيار شكل مستضد مناسب من Hi جزءا أساسيا من هذا التقييم. تتراوح المستحضرات المستضدية من مكونات جدار الخلية إلى البكتيريا الحية. لإنشاء وتوحيد المقايسات ، قد يكون استخدام عينات الدم المحيطية مفيدا جدا في البداية.

يتيح قياس التدفق الخلوي قياس مجموعة متنوعة من المعلمات والمقايسات الوظيفية من عينة واحدة على المستوى الخلوي. تتميز هذه التقنية بميزة أنه يمكن تقييم استجابات خلوية محددة (على سبيل المثال ، إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) أو إنتاج السيتوكين داخل الخلايا) عند مقارنتها بطرق أخرى أكثر عمومية مثل مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) أو ELISspot.

يتم التعبير عن الفخاخ خارج الخلية بواسطة العدلات (NETs)5،6،7 وبواسطة خلايا أخرى مثل الضامة (METs)8. يتم التعرف عليها بشكل متزايد كاستجابة التهابية رئيسية ، لا سيما في العدوى في الرئة9. يمكن تقييمها عن طريق الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر. تسمح هذه التقنية بالتحديد النهائي لشبكات / METs وتميز تعبيرها عن الأشكال الأخرى لموت الخلايا6.

كل من قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر عبارة عن مقايسات قائمة على التألق. يعتمد نجاحها على بروتوكولات الإجهاد المثلى للعينات البيولوجية. تستغرق هذه الأساليب بعض الوقت للتعلم وتتطلب خبرة إشرافية مناسبة. الأدوات المعنية هي أيضا مكلفة على حد سواء لشراء وتشغيل. يشمل الإعداد الأمثل لاستخدامها الجامعات الكبرى ومستشفيات الإحالة من الدرجة الثالثة.

الطرق المستخدمة في هذا البروتوكول قابلة للنقل لدراسة الكائنات الحية المماثلة الأخرى المشاركة في أمراض الجهاز التنفسي (على سبيل المثال ، Moxarella catarrhalis والعقدية الرئوية). NTHi يتفاعل أيضا مع بكتيريا الجهاز التنفسي الشائعة الأخرى10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على هذا العمل من قبل لجنة أخلاقيات البحوث البشرية في موناش هيلث. يتبع البروتوكول المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث البشرية.

1. إعداد مستضد

ملاحظة: يمكن استخدام ثلاثة مستحضرات مستضدية مختلفة لتقييم الاستجابة المناعية ل Hi. هذه هي 1) مكون تحت خلوي (عادة من جدار الخلية البكتيرية) ؛ 2) البكتيريا المقتولة والمعطلة. و 3) البكتيريا الحية. تحديد استخدام كل مستضد قبل بدء أي تجارب.

  1. المكونات تحت الخلوية
    1. الحصول على المكونات تحت الخلوية من المصادر ، بما في ذلك المستحضرات التجارية والمكونات المطورة داخليا و / أو من محققين آخرين.
      ملاحظة: يمكن استخدام المكونات تحت الخلوية عادة من جدار الخلية البكتيرية وتشمل بروتينات الغشاء الخارجي مثل P6 و lipooligosaccharide (LOS) 11،12. عادة ما يتم اشتقاق هذه المكونات تحت الخلوية في مراكز متخصصة. وصف كيفية صنعها خارج نطاق هذه المقالة. يوصى بالاتصال المباشر مع الخبراء في هذا المجال للحصول على هذه المكونات.
  2. البكتيريا المقتولة / المعطلة
    1. الحصول على البكتيريا من العينة المناسبة (على سبيل المثال ، البلغم أو تنظير القصبات). تأكد من أن السلالة هي H. influenzae باستخدام مختبر علم الأحياء الدقيقة المناسب. قم بإجراء طباعة عينات H. influenzae للتأكد من أنها غير قابلة للكتابة (بواسطة مختبر متخصص في علم الأحياء الدقيقة).
    2. للحصول على مستضد تمثيلي ، استخدم سلالات NTHi متعددة (5 على الأقل ، كل منها بنفس الكمية تقريبا) لعمل مستضد مجمع. قم بتخزين السلالات عند -70 درجة مئوية في مرق الجلسرين في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.
      ملاحظة: في هذه التجربة ، تم استخدام عشر سلالات متميزة.
    3. قم بإذابة السلالات (أنبوب طرد مركزي دقيق واحد في كل مرة) على أطباق أجار الشوكولاتة وتنمو طوال الليل في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. أضف البكتيريا إلى 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) واغسلها مرتين (تدور بسرعة 300 × جم لمدة 5 دقائق). استخدم معيار MacFarland 10 أو مقياس الطيفالضوئي 13 لقسمة NTHi بتركيز10 8 مل (باستخدام حاوية 5 مل أو ما يعادلها).
    4. تعمل الحرارة على تعطيل البكتيريا عن طريق وضعها في حمام مائي عند درجة حرارة 56 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    5. قم بتسخين البكتيريا باستخدام إعداد صوتنة مستمر بسرعة منخفضة إلى متوسطة المدى لمدة 30 ثانية.
    6. تقسيم الحجم المناسب للعينات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. بالنسبة لعينة من 108 مل ، استخدم حصص 50 ميكرولتر (أي 20 عينة لكل مل) ، وقم بتجميدها عند -70 درجة مئوية حتى14 المطلوبة.
  3. البكتيريا الحية
    1. أولا ، قم بتوصيف البكتيريا الحية كما هو مذكور في الخطوة 1.2.1. استخدم سلالة واحدة مميزة جيدا. تأكد من تخزين السلالة أيضا في مرق الجلسرين عند -70 درجة مئوية كاحتياطي.
    2. تنمو البكتيريا على وسائط غنية مثل أطباق أجار الشوكولاتة أو في المرق.
      1. لاستخدام أطباق أجار الشوكولاتة ، انشر البكتيريا لمدة لا تقل عن 3-4 أيام باستخدام موزعات معقمة.
      2. بدلا من ذلك ، استخدم مرق ضخ قلب الدماغ (BHI) المخصب بالعوامل X (هيمين) و V (β-نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد) لزراعة البكتيريا. قم بتلقيح NTHi من الأطباق الليلية في 5-10 مل من مرق BHI المكمل بكل من الهيمين و β-نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (كلاهما 10 ميكروغرام / مل) واستزراع طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
        ملاحظة: يتميز هذا بميزة التكاثر ، وارتفاع عدد وحدات تكوين المستعمرات (CFU) ، وجميع البكتيريا في مرحلة مماثلة من نمو السجل (على الألواح ، يمكن أن تكون الصلاحية البكتيرية أكبر اعتمادا على الموضع في الثقافة)13,15.
    3. استخدم تعدد العدوى (MOI) من 100 بكتيريا إلى خلية واحدة لاستنباط استجابة مناعية قوية مع الحفاظ على صلاحية الخلية. استخدم معيار ماكفارلاند10 أو مقياس الطيفالضوئي 13 لتقييم عدد البكتيريا.
    4. تأكد من أن الوسائط المستخدمة في فحوصات NTHi الحية خالية من أي مصل بشري ، لأن هذا سيقتل البكتيريا16. عينات مصل الحيوانات (على سبيل المثال ، مصل عجل الجنين) لا تسبب أي مشكلة بشكل عام.
      ملاحظة: استخدم الطرق الموضحة أدناه لتحليل عينات الأنسجة القياسية مثل الدم المحيطي وعينات تنظير القصبات (خاصة غسل القصبات الهوائية (BAL)) وأنسجة الرئة المقطوعة. احتضان العينات مع مستضد Hi من 10 دقائق إلى 24 ساعة أو أكثر.

2. تقييم وظيفة البلعمة عن طريق قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: يتطلب هذا الفحص خلايا في محلول ويتم إجراؤه عادة في الدم الكامل أو باستخدام سائل BAL. تم تعديل هذا الفحص من بروتوكول تم نشره مسبقا بناء على استخدام إعداد المكورات العنقودية الذهبية المعطل و Pansorbin17. يتم استبدال الدم الكامل المعطل و H. influenzae الثابت ب Pansorbin17.

  1. امزج NTHi المقتول والمعطل (1.2) مع يوديد البروبيديوم (PI) عند 100 ميكروغرام / مل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بنسبة 1: 1 لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم يغسل في 500 ميكرولتر من PBS. قم بالدوران لأسفل عند 450 × جم لمدة 5 دقائق وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من PBS.
  2. احتضان 450 ميكرولتر من الدم المحيطي (من البزل الوريدي لموضوع بشري) مع 50 ميكرولتر من PI المعطل المسمى H. influenzae لمدة 20 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية في أنبوب 5 مل.
  3. أخرج العينات من الحمام المائي وأضف 5 ميكرولتر من ثنائي هيدرورودامين -1،2،3 (DHR). دوامة لمدة 10 ثوان ، ثم ضعها مرة أخرى في حمام مائي لمدة 10 دقائق أخرى.
  4. قم بإزالة العينات من الحمام المائي وقم بتحليل كريات الدم الحمراء (500 ميكرولتر من الحجم كما هو مذكور أعلاه في الخطوة 2.2) باستخدام محلول 10: 1 (أي 5 مل) من محلول كلوريد الأمونيوم 0.8٪ (150 mM NH4Cl و 1 mM NaHCO3 و 0.1 mM EDTA).
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام نظام آلي مثل Q-prep.
  5. تحليل العينات على مقياس التدفق الخلوي في غضون ساعة. تحليل ما لا يقل عن 3000-5000 خلية (من كل مجموعة فرعية من الاهتمام) من كل عينة للحصول على نتائج تمثيلية (الشكل 1).
    1. لتحليل عينات البلعمة ، حدد نسبة الخلايا التي ابتلعت البكتيريا المصنفة (قم بقياس نسبة الخلايا التي تحتوي على صبغة الفلورسنت).
    2. تحديد كمية ROS عن طريق أكسدة DHR ، مما ينتج عنه إشارة فلورية (تتم مقارنة التحول في متوسط التألق بين خط الأساس والعينات المحفزة).
      ملاحظة: العدلات أكثر حبيبية ولها تشتت جانبي أكثر ، في حين أن البلاعم أكبر ولها تشتت أمامي أكثر.
    3. التمييز بين العدلات والبلاعم شكليا عن بعضها البعض من خلال حجمها (الضامة أكبر) والتحبب (العدلات أكثر حبيبية).
      ملاحظة: لا يتم استخدام علامات محددة للعدلات والبلاعم بشكل عام ، على الرغم من أنه يمكن استخدام CD14 لتسمية وحيدات الدم. يمكن استخدام قياس التدفق الخلوي للتمييز بين الأشكال الوظيفية المختلفة للخلايا الوحيدة والبلاعم (على سبيل المثال ، مجموعات فرعية M1 و M2)18.
  6. قم بتعديل الفحص حسب الاقتضاء (على سبيل المثال ، استخدم NTHi الحي غير المسمى لتحفيز الخلايا البلعمية وقياس تعبير ROS عن طريق انشقاق DHR).
    1. عزل خلايا الدم الطرفية أحادية النواة عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة. ضع طبقة الدم فوق البوليمر المخصص للطرد المركزي المتدرج الكثافة وقم بالدوران بسرعة 2300 × جم لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة الطبقة أحادية النواة باستخدام ماصة ، واغسلها مرتين باستخدام PBS وأعد تعليق الخلايا في PBS بمعدل 106 خلايا لكل مل.
    2. كبديل ، استخدم البلاعم BAL.
    3. تعليق الخلايا الوحيدة/البلاعم بتركيز 106 خلايا/مل في وسط الاستزراع (RPMI). أصابهم ب NTHi الحي في MOI من 100: 1 لمدة ساعة واحدة كما هو موضح في الخطوة 1.3.
    4. أضف DHR إلى التعليق كما هو موضح في الخطوة 2.3 لمدة 10 دقائق. قم بإجراء تحليل ROS باستخدام قياس التدفق الخلوي.

3. تقييم وظيفة الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي

  1. استخدم مستحضرات الدم الكامل أو الخلايا أحادية النواة لفحوصات قياس التدفق الخلوي14.
  2. الحصول على عينات من كل موضوع عن طريق البزل الوريدي. اجمع 4 مل من الدم من الوريد المحيطي في أنبوب هيبارين الليثيوم وقسم العينات إلى حصص للتحكم وتحفيز المستضد.
  3. أضف الأجسام المضادة المكلفة (anti-CD28 و CD49d ، 1 ميكرولتر / مل) إلى كلتا العينتين. أضف NTHi إلى عينة المستضد واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة. لتحضير NTHi المقتول ، أضف 200 ميكرولتر من مولد الضد إلى 2 مل من الدم. بالنسبة إلى NTHi الحية ، أضف خلايا NTHi الحية بمعدل MOI 100: 1 إلى الخلايا البيضاء (كما تم قياسها بواسطة مقياس الدم).
  4. أضف عامل حجب جولجي Brefeldin A (10 ميكرولتر / مل) إلى العينات واحتضانها لمدة 5 ساعات أخرى.
    ملاحظة: منع جهاز جولجي يمنع تصدير السيتوكينات خارج الخلية.
  5. إذا تم استخدام الدم الكامل ، قم بتحليل كريات الدم الحمراء مع 0.8٪ كلوريد الأمونيوم (الخطوة 2.4) لترك الكريات البيض فقط في المحلول. إصلاح الكريات البيض باستخدام 500 ميكرولتر من 1 ٪ -2 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 1 ساعة.
  6. عد الخلايا بواسطة مقياس الدم ، ونفاذ 106 خلايا مع 100 ميكرولتر من الصابونين 0.1 ٪ لمدة 15 دقيقة واحتضان الخلايا مع الأجسام المضادة المسمى الفلورسنت. اغسل الخلايا وقم بتحليلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: ستكون كمية الأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت محددة لكل سيتوكين. اتبع تعليمات الشركات المصنعة. عادة ، سيتم تلطيخ 106 خلايا في 100 ميكرولتر من المحلول لمدة 1 ساعة. معظم الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها تجاريا ستكون كافية لإجراء 25-100 اختبار.
  7. أوجد نسبة الخلايا المستجيبة لمولد الضد عن طريق تحديد مجموعات الخلايا الليمفاوية ذات الصلة (يتم تثبيت الخلايا بواسطة CD45 ، ثم بواسطة CD3 ، وبعد ذلك بواسطة تعبير CD4 أو CD8) كما هو موضح في الشكل 2. قم بإجراء تلطيخ الخلفية على الخلايا غير المحفزة لتحليل جميع السيتوكينات. فحص 100000 خلية لتحليل كل سيتوكين لكل من الخلايا المحفزة والتحكم.

4. تقييم وظيفة الخلايا الليمفاوية / الوسطاء الالتهابية في أنسجة الرئة

  1. ليس من الممكن عادة الحصول على ما يكفي من الخلايا الليمفاوية من تنظير القصبات. لذلك ، استخدم أنسجة الرئة من عينات استئصال الفص. يتطلب تحسين عينات أنسجة الرئة اتصالا وثيقا بخدمة علم الأمراض التشريحية. تأكد من أن الأنسجة لديها هامش لا يقل عن 3 سم من الورم وأنه النسيج الخلوي دون انتفاخ الرئة بشكل كبير (على النحو الذي يحدده أخصائي علم الأمراض).
  2. قسم أنسجة الرئة إلى معلق خلوي قبل استخدامها في فحوصات قياس التدفق الخلوي. هضم أنسجة الرئة كيميائيا (على سبيل المثال ، مع كولاجيناز) أو تفكيكها ميكانيكيا.
    ملاحظة: قد يفضل التقسيم الميكانيكي للأنسجة لأن هذا يرتبط بتلطيخ سطح الخلايا بشكل أفضل (على سبيل المثال ، وضع العلامات CD3 / 4)19.
    1. الحصول على عينات استئصال الفص من أخصائي علم الأمراض (عادة ما يتم الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لعلاج سرطان الرئة). شريحة حوالي 20-40 غرام من العينة إلى 3-5 مم3 أقسام. ضعها داخل غرفة معقمة سعة 50 ميكرولتر قبل تجزئتها ميكانيكيا باستخدام أداة تجميع مناسبة.
    2. بعد تكسير الأنسجة، قم بتحليل خلايا الدم الحمراء بنسبة 0.8٪ NH 4 Cl كما هو مذكور في الخطوة2.4.
    3. أعد تعليق الخلايا في RPMI المعقم (يعتمد الحجم على أرقام الخلايا وعموما هو 10-20 مل) ، ثم قم بترشيحها من خلال شبكة نايلون معقمة 100 ميكرومتر. احسب عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام طريقة استبعاد التريبان الأزرق.
  3. مقايسة العدوى NTHi
    1. أعد تعليق خلايا الرئة إلى تركيز الخلية النهائي 4 × 106 خلايا / مل لكل أنبوب (عينات التحكم والتحفيز).
    2. استخدم معلقا من 4 × 10 6-6 × 106 خلايا في 1 مل من RPMI لأنبوب التحكم (السلبي). استخدم نفس الكمية لأنبوب NTHi (يمكن استخدام أي عينة إضافية كعنصر تحكم إيجابي مع SEB). تصيب الخلايا في أنبوب NTHi بمعدل 100 بكتيريا لكل خلية. قم بفك الغطاء نصف دوران للسماح بنقل الغاز في الأنابيب.
    3. ضع الخلايا في دوار أنبوب واحتضنها عند 37 درجة مئوية أثناء الدوران عند 12 دورة في الدقيقة.
    4. لمنع تصدير السيتوكينات خارج الخلية ، أضف حاصرات جولجي (Brefeldin A) إلى معلقات الخلايا بعد ساعة واحدة من التحفيز إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام / مل. أعد معلقات الخلية لحضانة أخرى مدتها 16-22 ساعة عند الدوران (الخطوة 4.3.3).
    5. اغسل معلق الخلية ب 500 ميكرولتر من PBS تحتوي على 1٪ ألبومين مصل بقري (BSA) و 0.01٪ NaN3. إصلاح ونفاذية الخلايا كما هو موضح في الخطوة 3.5 والخطوة 3.6، على التوالي.
    6. أضف الأجسام المضادة لتلطيخ السيتوكين داخل الخلايا (يتم تحديد اختيار الأجسام المضادة من قبل الباحث ، كما هو مدرج في الملاحظة في الخطوة 3.6). قم بتلطيخ معلق الخلية لعلامات سطح خلية الخلايا الليمفاوية البشرية المحددة (على سبيل المثال ، CD45 ، CD3 ، إلخ) لمدة 1 ساعة. اغسل الخلايا باستخدام PBS ، وقم بإصلاحها واختراقها كما هو موضح في الخطوات 3.5-3.6.
    7. احتضان الخلايا بأجسام مضادة تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا (على سبيل المثال ، IFN-γ و TNF-α أو IL-13 و IL-17A) لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: يوصى بتلطيخ علامات السطح أولا ، ثم داخل الخلايا لأن التثبيت يمكن أن يسبب تغيرات توافقية في البروتينات السطحية التي ترتبط بها الأجسام المضادة.
    8. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من PBS وأعد تعليقها في 100 ميكرولتر من PBS قبل الحصول على البيانات على مقياس التدفق الخلوي.
  4. يمكن استخدام مقايسة صفيف الخرز جنبا إلى جنب لتحليل المادة الطافية الموصوفة في الخطوة 3.2 (قم بإجراء ذلك بدون Brefeldin A). هذا يسمح بتحليل مجموعة واسعة من الوسطاء الالتهابيين المختلفين (يحتمل أن يصل إلى 40-50 وسيطا). اجمع المادة الطافية في 100 ميكرولتر من القسمة وخزنها في -70 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للتحليل. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء استخدام مقايسات الإضاءة الكيميائية المتعددة20.
    1. استخدم صفائف الخرز المتعددة لتحليل العينات المذابة. استخدم المادة الطافية المخزنة لتحليل إنتاج السيتوكين باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    2. إجراء الحصول على مجموعة حبة متعددة على مقياس التدفق الخلوي. استخدم البرامج ذات الصلة لإجراء تحليل البيانات النهائية.
      ملاحظة: يمكن أيضا إجراء فحص صفيف الخرزة هذا على طافي من الدم المحيطي و / أو عينات BAL.

5. تقييم التحلل البروتيني للرئة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر

ملاحظة: الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر مكمل لقياس التدفق الخلوي ويمكن استخدامه لتقييم استجابات البروتياز والتهابات ROS. تتكون الفخاخ خارج الخلية مثل NETs و METs من الكروماتين خارج الخلية (DNA) مع وسطاء التهابيين آخرين ، وخاصة البروتياز مثل إيلاستاز العدلات (NE) ومصفوفة البروتينات المعدنية (MMP). يمكن تقييمها في BAL وأنسجة الرئة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ، وقد تم وصف ذلك سابقا بواسطة Sharma، R. et al.21.

  1. تقييم التعبير البروتيني المباشر في أنسجة الرئة (كما هو موضح في الخطوة 4.2.1) باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر والتصوير الزيموغرافي في الموقع 15،17.
    1. استخدم أنسجة الرئة الطازجة أو المجمدة غير المثبتة. قم بتركيب المقاطع المقطوعة بسمك 4 ميكرومتر على شرائح فائقة الصقيع / الالتصاق. قم بتسخين الأقسام مسبقا في مخزن مؤقت للتفاعل 1x لمدة 5 دقائق.
    2. أضف ركيزة الجيلاتين التي تحمل علامة الفلوريسئين (30 ميكروغرام / مل لكل قسم) مباشرة على شرائح فردية لقياس التحلل البروتيني عن طريق عمل البروتينات المعدنية.
    3. ضع الشرائح في وضع أفقي واحتضنها في غرفة مرطبة محمية بالضوء عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    4. اشطف الأقسام في مخزن تفاعل 1x قبل تركيبها.
    5. كعنصر تحكم سلبي ، أضف فقط مخزن التفاعل المؤقت بدون الجيلاتين الفلوري إلى الأقسام.
    6. استخدم مجهرا متحد البؤر لفحص تحلل الركيزة عن طريق الفحص. استخدم ImageJ لتحديد منطقة الرئة مع وجود دليل على التحلل البروتيني. لهذا ، قم بقياس منطقة الرئة التي بها تلطيخ فوق خلفية العينة المروية. كعنصر تحكم آخر ، استخدم أنسجة الرئة بدون إضافة الجيلاتين الفلوري15.
      ملاحظة: قم بإجراء ذلك على ما لا يقل عن 10 مجالات رؤية عالية الطاقة (FOV) لكل عينة.
  2. قم بقياس تعبير أنواع الأكسجين التفاعلية خارج الخلية في أنسجة الرئة عن طريق النشاط المناعي ل 3-nitrotyrosine (منتج إجهاد تأكسدي سام)13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تظهر النتائج التمثيلية كيف يمكن تقييم / قياس الاستجابات المناعية الالتهابية ل NTHi عن طريق قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر. جزء رئيسي من تفسير النتائج هو المقارنة في التألق بين العينات الضابطة والمحفزة. عادة ما تكون هناك حاجة إلى عدد من التجارب الأولية لتحسين تلطيخ العينات. يعتمد عدد الألوان المختلفة التي يمكن فحصها في وقت واحد على عدد القنوات المتاحة على مقياس التدفق الخلوي / المجهر متحد البؤر. تظهر النتائج لتقييم 1) إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، 2) تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا لأنسجة الرئة البشرية ، و 3) التصوير الزيموغرافي في الموقع لقياس التحلل البروتيني للرئة.

يوضح الشكل 1 تمثيل إنتاج ROS بواسطة الخلايا الوحيدة. يتم قياس أنواع الأكسجين التفاعلية عن طريق أكسدة DHR123 لإنتاج مضان. يتم إغلاق الخلايا ، ويتم تقييم متوسط مضانها عن طريق قياس التدفق الخلوي. تتم مقارنة متوسط التألق للعينة المحفزة بالسيطرة.

يوضح الشكل 2 إنتاج السيتوكينات داخل الخلايا بواسطة الخلايا الليمفاوية المشتقة من أنسجة الرئة البشرية. يجب تقسيم أنسجة الرئة إلى تعليق أحادي الخلية قبل إجراء فحوصات قياس التدفق الخلوي لتقييم إنتاج الوسيط الالتهابي ، على سبيل المثال ، إنتاج السيتوكين بواسطة الخلايا الليمفاوية. يمكن تكسير أنسجة الرئة ميكانيكيا أو هضمها كيميائيا ، على سبيل المثال ، عن طريق الكولاجيناز. قد تؤدي طرق الانهيار الميكانيكي إلى نتائج متفوقة ، لا سيما فيما يتعلق بالاحتفاظ بتلطيخ سطح الخلية (على سبيل المثال ، CD3 و CD4). يعد ترشيح العينات أمرا مهما لاستبعاد الحطام الذي قد يتداخل مع التحليل.

يوضح الشكل 3 التعبير عن نشاط البروتياز كما تم قياسه بواسطة التصوير الزيموجرافي الموضعي . يستخدم النسيج غير الثابت لتقييم نشاط الأنزيم البروتيني. عادة ما يتم تجميد هذه العينات عند -70 درجة مئوية حتى التحليل. يتم قياس منطقة الأنسجة التي تحتوي على مضان البروتياز ، وتتم مقارنة النتائج بين العينات الضابطة والمحفزة.

Figure 1
الشكل 1: إنتاج ROS بواسطة الخلايا الوحيدة. (أ) توضح اللوحة استراتيجية بوابة خلايا الدم الطرفية أحادية النواة (PBMC)، مع استخدام التشتت الأمامي والتشتت الجانبي لتحديد عدد الخلايا البلعمية. في اللوحة (ب)، يعرف مجتمع الخلايا البلعمية أيضا بتعبير CD14 لتسمية الخلايا الوحيدة. يتم تحليل هذه المجموعة من الخلايا الوحيدة من أجل مضان DHR في السيطرة (C) والعينات المحفزة (D). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: إنتاج السيتوكينات في أنسجة الرئة. يتم تحليل الخلايا أولا لتعبيرها عن علامة الكريات البيض CD45 (A) باستخدام قياس التدفق الخلوي. ثم يتم تحليل هذا المجتمع بشكل أكبر لتعبير CD3 (B) وتعبير CD4 / CD8 (C). يتم تقييم خلايا CD3 / CD4 + لإنتاج السيتوكينات داخل الخلايا في السيطرة (D) والعينات المحفزة NTHi (E). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: التصوير الزيموجرافي الموضعي للرئة. توضح اللوحة (A) تعبير الكروماتين / DAPI في أقسام أنسجة الرئة. تظهر اللوحة (B) تلطيخ الفلورسنت ، مما يشير إلى وجود نشاط MMP. تعرض اللوحة (C) الصورة المدمجة التي تشير إلى أن نشاط MMP مرتبط أيضا بالتعبير عن الكروماتين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تستخدم الطرق المذكورة هنا قياس التدفق الخلوي القائم على التألق وتقنيات الفحص المجهري متحد البؤر التي يمكن استخدامها جنبا إلى جنب للحصول على معلومات مفصلة حول استجابة الرئة الالتهابية ل Hi.

يعد إنشاء الصيغة المستضدية المناسبة ل Hi لاستخدامها أمرا بالغ الأهمية ، ومن المستحسن الحصول على مدخلات محددة من عالم الأحياء الدقيقة في هذا الصدد. Live Hi يحفز استجابة أقوى ، في حين أن الاستعدادات Hi ومكونات Hi المقتولة أكثر توحيدا وأسهل في التخزين. سيقوم PI فقط بتسمية البكتيريا الميتة22 ؛ يمكن استخدام أصباغ أخرى مثل كربوكسي فلوريسئين سكسينيميديليستر (CFSE) لتسمية البكتيريا الحية لمقايسات البلعمة23. يجب إجراء سلسلة من التجارب الأولية لتحسين المستضد المناسب. لاستخدام NTHi المباشر ، فإن MOI 100: 1 هو الأمثل ؛ قد لا يؤدي انخفاض MOI إلى استجابة مناعية واضحة ، في حين أن MOI الأعلى قد يكون ساما للخلايا. ومع ذلك ، قد يعطي منحنى الاستجابة للجرعة معلومات مفيدة وقد يكون ذا قيمة كبيرة ، لا سيما مع التحسين الأولي للتقنية24. كعنصر تحكم إيجابي ، يمكن استخدام شكل تم الحصول عليه تجاريا من مستضد المكورات العنقودية الذهبية المعطل ، والذي يتم تمييزه أيضا ب PI على النحو الوارد أعلاه لمقايسة ROS / البلعمة. بالنسبة لمقايسات الخلايا التائية ، يمكن استخدام التحفيز باستخدام المستضد الفائق للمكورات العنقودية E (SEB) كعنصر تحكم إيجابي19,25.

يجب وضع بروتوكولات الحصول على عينات BAL و / أو أنسجة الرئة بوضوح. يمكن أن تكون عينات BAL متغيرة تماما بين المشغلين المختلفين. حقنة محمولة باليد لغسل الفص الأوسط الأيمن تعطي نتائج جيدة26. يتطلب الحصول على عينة أنسجة الرئة من عينات استئصال الفص إقامة تعاون مع أخصائي علم الأمراض. يجب أن تحتوي عينة أنسجة الرئة على بعض الهامش من الورم (من الناحية المثالية 3-4 سم على الأقل). العينات الأكبر (على سبيل المثال ، 25-50 جم على الأقل) ستنتج المزيد من الخلايا ، بالإضافة إلى العينات الأكثر قربا دون انتفاخ الرئة الواضح. يستغرق التقسيم الميكانيكي لأنسجة الرئة وقتا طويلا وسيستغرق عموما ما لا يقل عن 2-3 ساعات لكل عينة19,27.

يجب إجراء تجارب أولية لتحسين تلطيخ الفلوروفورات المختلفة لكل من قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر. تشمل المجالات التي يجب التركيز عليها تحديد أفضل لوحة تلطيخ ، وتلطيخ / تركيز ، ومعالجة الخلايا / الأنسجة لتحقيق أقصى قدر من الصلاحية28. قد يترافق استخدام أنسجة الرئة مع حطام الأنسجة أكثر من عينات السوائل الأخرى مثل الدم أو BAL ، وقد يكون لهذا بعض التأثير على تمايز المجموعات الخلوية المختلفة عن طريق قياس التدفق الخلوي. يجب تحديد الاختيار المناسب للأجسام المضادة وتحسينه في التجارب الأولية. لوضع العلامات السطحية للخلايا الليمفاوية ، يمكن استخدام مضادات CD3 و CD4 للخلايا التائية المساعدة ، ومضادات CD3 و CD8 للخلايا التائية السامة ، ومضادة CD3 و CD56 للخلايا القاتلة الطبيعية. يعتمد اختيار السيتوكينات داخل الخلايا المراد دراستها على الوسطاء المعنيين وعدد المعلمات / الألوان التي يمكن تحليلها على مقياس التدفق الخلوي29. التحدي المحدد للعمل مع البلاعم في أنسجة الرئة هو ارتفاع مستوى التألق الذاتي30. يمكن التعامل مع هذه المشكلة من خلال مقارنة الخلايا المحفزة بالتحكم في الخلفية وإضافة علامات محددة للالتهابات مثل البروتياز والهستونات.

ومن القيود المفروضة على هذه التقنيات الحاجة إلى موظفين مدربين ومهرة بشكل مناسب لإجراء التجارب. هناك حاجة أيضا إلى مرافق قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري الراسخة. يرتبط استخدام عينات الأنسجة البشرية بتباين كبير خاصة عند استخدام أنسجة الرئة. قد يتطلب ذلك سلسلة من التجارب الأولية لتحسين المقايسات (خاصة مع مشكلات تلطيخ الخلفية).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يشكروا موظفي علم المناعة السريرية في Monash Health على مساعدتهم في هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium chloride Sigma Aldrich 213330
Brefeldin Sigma Aldrich B6542
CD28 Thermofisher 16-0289-81
CD49d Thermofisher 534048
DAPI prolong gold Thermofisher P36931
DHR123 Sigma Aldrich 109244-58-8
Filcon sterile nylon mesh Becton Dickinson 340606
Gelatin substrate, Enzchek Molecular probes E12055
MACS mix tube rotater Miltenyi Biotec 130-090-753
Medimachine Becton Dickinson Catalogue number not available
Medicons 50 µm Becton Dickinson 340592
Pansorbin Sigma Aldrich 507858
Propidium iodide Sigma Aldrich P4170
Saponin Sigma Aldrich 8047152
Superfrost slides Thermofisher 11562203

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
  2. Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
  3. King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).
  4. Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).
  5. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  6. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
  7. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
  8. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
  9. Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).
  10. Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
  11. Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
  12. Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, Suppl 1 181-184 (1992).
  13. Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 6, Unit 6D (2010).
  14. King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
  15. Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
  16. King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
  17. King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371 (2015).
  18. Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
  19. King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
  20. Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
  21. Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).
  22. Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
  23. Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
  24. Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
  25. Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69 (2011).
  26. Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
  27. Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
  28. Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
  29. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606 (2016).
  30. Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).

Tags

علم المناعة والعدوى ، العدد 172 ، البكتيريا ، الرئة ، الالتهاب ، قياس التدفق الخلوي ، الفحص المجهري متحد البؤر
تقييم الاستجابات المناعية التنفسية <em>للمستدمية النزلية</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dousha, L., Sharma, R., Lim, S.,… More

Dousha, L., Sharma, R., Lim, S., Ngui, J., Buckle, A. M., King, P. T. Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae. J. Vis. Exp. (172), e62572, doi:10.3791/62572 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter