Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Оценка респираторных иммунных реакций на Haemophilus Influenzae

Published: June 29, 2021 doi: 10.3791/62572
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 2,4, 5, 1,2
1Monash Lung and Sleep, Monash Medical Centre, 2Monash University Department of Medicine, Monash Medical Centre, 3Flow Cytometry Science Technology Platform, Francis Crick Institute, 4Clinical Immunology, Monash Medical Centre, 5Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University

Summary

Haemophilus influenzae вызывает воспаление в дыхательных путях. Эта статья будет посвящена использованию проточной цитометрии и конфокальной микроскопии для определения иммунных реакций фагоцитов и лимфоцитов в ответ на эту бактерию.

Abstract

Haemophilus influenzae (Hi) является распространенной бактерией, обнаруженной в ряде респираторных заболеваний. Различные анализы / методы могут быть использованы для оценки респираторного иммунного / воспалительного ответа на эту бактерию. Проточная цитометрия и конфокальная микроскопия являются флуоресцентными технологиями, которые позволяют детально характеризовать биологические реакции. Могут быть использованы различные формы антигена Hi, включая компоненты клеточной стенки, убитые / инактивированные препараты и живые бактерии. Hi - это привередливая бактерия, которая требует обогащенных сред, но, как правило, легко выращивается в стандартных лабораторных условиях. Образцы тканей для стимуляции Hi могут быть получены из периферической крови, бронхоскопии или резецированного легкого (например, у пациентов, перенесших операцию по лечению рака легких). Функция макрофагов и нейтрофилов может быть всесторонне оценена с использованием проточной цитометрии с различными измеренными параметрами, включая фагоцитоз, активные формы кислорода и внутриклеточную продукцию цитокинов. Функция лимфоцитов (например, функция Т-клеток и NK-клеток) может быть специально оценена с помощью проточной цитометрии, главным образом для внутриклеточной продукции цитокинов. Hi-инфекция является мощным индуктором внеклеточной ловушки, как нейтрофилами (NETs), так и макрофагами (METs). Конфокальная микроскопия, возможно, является наиболее оптимальным способом оценки экспрессии NET и MET, который также может быть использован для оценки активности протеазы. Иммунитет легких к Haemophilus influenzae можно оценить с помощью проточной цитометрии и конфокальной микроскопии.

Introduction

Haemophilus influenzae (Hi) является нормальной комменсальной бактерией, присутствующей в глотке большинства здоровых взрослых. Hi может иметь полисахаридную капсулу (типы A-F, например, тип B или HiB) или не иметь капсулы и быть нетипируемым (NTHi)1. Колонизация слизистой этой бактерией начинается в раннем детстве, и происходит оборот различных колонизирующих штаммов2. Эта бактерия также способна к инвазии как в верхние, так и в нижние дыхательные пути; в этом контексте он может вызвать активацию иммунного ответа и воспаление 3,4. Эта воспалительная реакция может вызвать клиническое заболевание и способствовать различным важным респираторным заболеваниям, включая синусит, средний отит, бронхит, муковисцидоз, пневмонию и хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ). Большинство из этих состояний обусловлены штаммами NTHi2. В этой статье будут описаны методы оценки респираторных иммунных реакций на Hi с использованием проточной цитометрии и конфокальной микроскопии.

Методы, описанные ниже, были адаптированы из хорошо зарекомендовавших себя методов, которые были модифицированы для оценки воспалительной реакции на Hi. Выбор подходящей антигенной формы Hi является ключевой частью этой оценки. Антигенные препараты варьируются от компонентов клеточной стенки до живых бактерий. Для установления и стандартизации анализов использование образцов периферической крови может быть очень полезным на начальном этапе.

Проточная цитометрия позволяет измерять различные параметры и функциональные анализы из одного образца на клеточном уровне. Этот метод имеет то преимущество, что специфические клеточные реакции (например, производство активных форм кислорода (АФК) или внутриклеточная продукция цитокинов) могут быть оценены по сравнению с другими более общими методами, такими как иммуноферментный анализ (ИФА) или ELISspot.

Внеклеточные ловушки экспрессируются нейтрофилами (NETs)5,6,7 и другими клетками, такими как макрофаги (METs)8. Они все чаще признаются в качестве ключевой воспалительной реакции, особенно при инфекции в легких9. Они могут быть оценены с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. Этот метод позволяет окончательно идентифицировать НЭТ/МЕТ и отличает их экспрессию от других форм гибели клеток6.

Как проточная цитометрия, так и конфокальная микроскопия являются флуоресцентными анализами. Их успех зависит от оптимальных протоколов процеживания биологических образцов. Эти методы занимают некоторое время для изучения и требуют соответствующего надзорного опыта. Задействованные инструменты также дороги как для покупки, так и для запуска. Оптимальная среда для их использования включает в себя крупные университеты и третичные специализированные больницы.

Методы, используемые в этом протоколе, переносятся для изучения других подобных организмов, участвующих в респираторных заболеваниях (например, Moxarella catarrhalis и Streptococcus pneumoniae). NTHi также взаимодействует с другими распространенными респираторными бактериями10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эта работа была одобрена комитетом по этике исследований человека Monash Health. Протокол следует руководящим принципам комитета по этике исследований человека.

1. Антигенный препарат

ПРИМЕЧАНИЕ: Три различных антигенных препарата могут быть использованы для оценки иммунного ответа на Hi. Это 1) субклеточный компонент (обычно из бактериальной клеточной стенки); 2) убитые и инактивированные бактерии; и 3) живые бактерии. Определить применение каждого антигенного препарата до начала каких-либо экспериментов.

  1. Субклеточные компоненты
    1. Получение субклеточных компонентов из источников, включая коммерческие препараты, компоненты собственной разработки и/или от других исследователей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Субклеточные компоненты, обычно из бактериальной клеточной стенки, могут быть использованы и включают белки внешней мембраны, такие как P6 и липулигосахарид (LOS)11,12. Эти субклеточные компоненты обычно выводятся в специализированных центрах. Описание того, как они сделаны, выходит за рамки этой статьи. Для получения этих компонентов рекомендуется прямой контакт со специалистами в этой области.
  2. Убитые/инактивированные бактерии
    1. Получите бактерии из соответствующего образца (например, мокроты или бронхоскопии). Подтвердите штамм как H. influenzae с помощью соответствующей микробиологической лаборатории. Выполните типирование образцов H. influenzae , чтобы подтвердить, что они нетипируемы (специализированной микробиологической лабораторией).
    2. Чтобы получить репрезентативный антиген, используйте несколько штаммов NTHi (по крайней мере, 5, каждый примерно одинакового количества), чтобы сделать объединенный антиген. Хранить штаммы при -70 °C в глицериновом бульоне в микроцентрифужных пробирках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте было использовано десять различных штаммов.
    3. Разморозьте штаммы (по одной микроцентрифужной трубке за раз) на тарелках шоколадного агара и выращивайте в течение ночи в инкубаторе с температурой 37 °C с 5% CO2. Добавьте бактерии в 500 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и промыть их дважды (открутите при 300 х г в течение 5 мин). Используйте стандарт MacFarland10 или спектрофотометр13 для аликвотирования NTHi до концентрации 108 мл (с использованием контейнера 5 мл или эквивалента).
    4. Тепло инактивирует бактерии, помещая их на водяную баню при температуре 56 °C в течение 10 мин.
    5. Обрабатывайте бактерии ультразвуком, используя непрерывную настройку ультразвуком на низкой и средней скорости в течение 30 с.
    6. Аликвотирование соответствующего объема образцов в микроцентрифужные трубки. Для образца объемом 108 мл используйте аликвоты 50 мкл (т.е. 20 проб на мл), заморозьте их при -70 °C до требуемого14.
  3. Живые бактерии
    1. Во-первых, охарактеризуйте живые бактерии, как указано на этапе 1.2.1. Используйте один хорошо охарактеризованный штамм. Убедитесь, что штамм также хранится в глицериновом бульоне при -70 °C в качестве резерва.
    2. Выращивайте бактерии на обогащенных средах, таких как тарелки шоколадного агара или в бульоне.
      1. Чтобы использовать тарелки шоколадного агара, распространяйте бактерии минимум каждые 3-4 дня стерильными разбрасывателями.
      2. В качестве альтернативы, используйте отвар Brain Heart Infusion (BHI), обогащенный факторами X (гемин) и V (β-никотинамидадениндинуклеотид) для выращивания бактерий. Инокулируют NTHi из ночных пластин в 5-10 мл бульона BHI, дополненного как гемином, так и β-никотинамидадениндинуклеотидом (оба 10 мкг / мл) и культивируют на ночь при 37 ° C в инкубаторе 5% CO2 .
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это имеет преимущество воспроизводимости, более высоких колониеобразующих единиц (КОЕ) и всех бактерий, находящихся в аналогичной фазе роста бревен (на пластинах жизнеспособность бактерий может быть выше в зависимости от положения в культуре)13,15.
    3. Используйте множественность инфекции (MOI) из 100 бактерий на одну клетку, чтобы вызвать сильный иммунный ответ при сохранении жизнеспособности клеток. Используйте MacFarland Standard10 или спектрофотометр13 для оценки количества бактерий.
    4. Убедитесь, что среда, используемая для живых анализов NTHi, свободна от любой сыворотки человека, так как это убьет бактерии16. Образцы сыворотки животных (например, сыворотка для телят плода), как правило, не вызывают никаких проблем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте методы, описанные ниже, для анализа стандартных образцов тканей, таких как периферическая кровь, образцы бронхоскопии (в частности, бронхоальвеолярный лаваж (BAL)) и резецированная легочная ткань. Инкубируют образцы с антигеном Hi от 10 мин до 24 ч и более.

2. Оценка фагоцитарной функции методом проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ требует клеток в растворе и обычно проводится в цельной крови или с использованием жидкости BAL. Этот анализ модифицирован по сравнению с ранее опубликованным протоколом, основанным на использовании инактивированного препарата золотистого стафилококка и Пансорбина17. Инактивированная цельная кровь и фиксированная H. influenzae заменяется Пансорбином17.

  1. Смешайте убитый, инактивированный NTHi (1,2) с йодидом пропидия (PI) при 100 мкг/мл в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) в соотношении 1:1 в течение 30 мин при комнатной температуре. Центрифугу при 450 х г в течение 5 мин, а затем промыть в 500 мкл PBS. Открутите при 450 х г в течение 5 мин и повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл PBS.
  2. Инкубировать 450 мкл периферической крови (из венепунктуры человека) с 50 мкл инактивированного ПИ, меченного H. influenzae , в течение 20 мин на водяной бане при 37 °C в пробирке 5 мл.
  3. Извлеките образцы с водяной бани и добавьте 5 мкл дигидрородамина-1,2,3 (DHR). Вихрь в течение 10 с, а затем поместите его обратно на водяную баню еще на 10 минут.
  4. Извлеките образцы с водяной бани и лизируйте эритроциты (500 мкл объема, как указано выше на этапе 2.2) раствором 10:1 (т.е. 5 мл) 0,8% хлорида аммония (150 мМ NH4Cl, 1 мМ NaHCO3 и 0,1 мМ ЭДТА).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы может использоваться автоматизированная система, такая как Q-prep.
  5. Проанализируйте образцы на проточном цитометре в течение часа. Проанализируйте минимум 3000-5000 клеток (из каждого подмножества интересующих) из каждого образца для получения репрезентативных результатов (рисунок 1).
    1. Чтобы проанализировать образцы на фагоцитоз, определите долю клеток, проглотивших меченые бактерии (измерьте долю клеток, имеющих флуоресцентное пятно).
    2. Количественно оценить АФК путем окисления DHR, что приводит к флуоресцентному сигналу (сдвиг медианной флуоресценции сравнивается между исходными и стимулированными образцами).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нейтрофилы более зернистые и имеют больше бокового рассеяния, в то время как макрофаги больше и имеют больше прямого рассеяния.
    3. Различают нейтрофилы и макрофаги морфологически друг от друга по их размеру (макрофаги крупнее) и зернистости (нейтрофилы более зернистые).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Специфические маркеры для нейтрофилов и макрофагов обычно не используются, хотя CD14 может использоваться для маркировки моноцитов крови. Проточная цитометрия потенциально может быть использована для различения различных функциональных форм моноцитов и макрофагов (например, подмножеств М1 и М2)18.
  6. Модифицируйте анализ по мере необходимости (например, используйте живые немаркированные NTHi для стимуляции фагоцитов и измерения экспрессии АФК путем расщепления DHR).
    1. Выделяют мононуклеарные клетки периферической крови методом центрифугирования градиента плотности. Нанесите кровь на назначенный полимер для центрифугирования градиента плотности и вращения при 2300 х г в течение 30 мин. Удалите моноядерный слой с помощью пипетки, дважды промыть его PBS и повторно суспендировать ячейки в PBS по 106 клеток в мл.
    2. В качестве альтернативы используйте макрофаги BAL.
    3. Суспендировать моноциты/макрофаги в концентрации 106 клеток/мл в культуральной среде (RPMI). Заразите их живым NTHi при MOI 100:1 в течение 1 ч, как описано в шаге 1.3.
    4. Добавьте DHR к суспензии, как описано на этапе 2.3, в течение 10 мин. Выполните анализ на АФК с помощью проточной цитометрии.

3. Оценка функции лимфоцитов в периферической крови

  1. Используют препараты цельной крови или мононуклеарных клеток для проточной цитометрии14.
  2. Получите образцы у каждого субъекта путем венепунктуры. Соберите 4 мл крови из периферической вены в литий-гепариновую трубку и разделите образцы на аликвоты для контроля и стимуляции антигена.
  3. Добавьте костимуляторные антитела (анти-CD28 и CD49d, 1 мкл/мл) к обоим образцам. Добавьте NTHi к образцу антигена и инкубируйте при 37 °C и 5% CO2 в течение 1 ч. Для убитого препарата NTHi добавляют 200 мкл антигена к 2 мл крови. Для живых NTHi добавьте живые клетки NTHi при MOI 100: 1 к белым клеткам (измеренным гемоцитометром).
  4. Добавьте к образцам блокирующий агент Гольджи Брефельдин А (10 мкл/мл) и инкубируйте их еще 5 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирование аппарата Гольджи предотвращает экспорт цитокинов за пределы клетки.
  5. Если используется цельная кровь, лизируйте эритроциты 0,8% хлоридом аммония (стадия 2,4), чтобы оставить в растворе только лейкоциты. Фиксируют лейкоциты с помощью 500 мкл 1%-2% параформальдегида в течение 1 ч.
  6. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, пронизывайте 106 клеток 100 мкл 0,1% сапонина в течение 15 мин и инкубируйте клетки флуоресцентно мечеными антителами. Промыть клетки и проанализировать их с помощью проточного цитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество флуоресцентно-меченых антител будет специфичным для каждого цитокина. Следуйте инструкциям производителя. Как правило, 106 клеток в 100 мкл раствора окрашиваются в течение 1 ч. Большинства коммерчески полученных антител будет достаточно для выполнения 25-100 тестов.
  7. Определите долю клеток, отвечающих на антиген, путем поглощения соответствующей популяции лимфоцитов (клетки ограничены CD45, затем CD3, а затем экспрессией CD4 или CD8), как показано на рисунке 2. Выполните фоновое окрашивание на нестимулированных клетках для всех анализируемых цитокинов. Скрининг 100 000 клеток для анализа каждого цитокина как для стимулированных клеток, так и для контроля.

4. Оценка функции лимфоцитов/медиаторов воспаления в легочной ткани

  1. Обычно невозможно получить достаточное количество лимфоцитов с помощью бронхоскопии; поэтому используйте легочную ткань из образцов лобэктомии. Оптимизация образцов легочной ткани требует тесной связи со службой анатомической патологии. Убедитесь, что ткань имеет запас не менее 3 см от опухоли и является клеточной тканью без значительной эмфиземы (как определено патологоанатомом).
  2. Разбейте легочную ткань на клеточную суспензию, прежде чем ее можно будет использовать для анализа проточной цитометрии. Переваривайте легочную ткань химически (например, коллагеназой) или дезагрегируйте ее механически.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Механическая дезагрегация тканей может быть предпочтительной, поскольку это связано с лучшим поверхностным окрашиванием клеток (например, маркировка CD3/4)19.
    1. Получить образцы лобэктомии у патологоанатома (обычно полученные от пациентов, проходящих лечение рака легких). Нарежьте около 20-40 г образца на 3-5 мм3 секции. Поместите их в стерильную камеру объемом 50 мкл перед механической фрагментацией с использованием соответствующего дезагрегатора.
    2. После дезагрегации тканей лизируют эритроциты с 0,8% NH4Cl, как указано на этапе 2.4.
    3. Повторно суспендировать клетки в стерильном RPMI (объем будет зависеть от количества клеток и, как правило, составляет 10-20 мл), а затем фильтровать их через 100 мкм стерильную нейлоновую сетку. Подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью метода исключения синего цвета трипана.
  3. Анализ инфекции NTHi
    1. Повторное суспендирование клеток легких до конечной концентрации клеток 4 х 106 клеток/мл на пробирку (контрольные и стимулированные образцы).
    2. Используйте суспензию 4 x 106-6 x 106 ячеек в 1 мл RPMI для (отрицательной) контрольной трубки. Используйте такое же количество для трубки NTHi (любой дополнительный образец может быть использован в качестве положительного контроля с SEB). Инфицировать клетки в трубке NTHi при MOI 100 бактерий на клетку. Ослабьте колпачок на половину оборота, чтобы обеспечить передачу газа в трубках.
    3. Поместите клетки в трубчатый ротатор и инкубируйте их при 37 °C при вращении со скоростью 12 оборотов в минуту.
    4. Чтобы предотвратить внеклеточный экспорт цитокинов, добавляют блокатор Гольджи (Брефельдин А) к клеточным суспензиям через 1 ч после стимуляции до конечной концентрации 10 мкг/мл. Возврат клеточных суспензий для дальнейшей инкубации 16-22 ч при вращении (этап 4.3.3).
    5. Промыть клеточную суспензию 500 мкл PBS, содержащую 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,01% NaN3. Зафиксируйте и пронизывайте клетки, как описано в шагах 3.5 и 3.6 соответственно.
    6. Добавьте антитела для внутриклеточного окрашивания цитокинов (выбор антител должен быть определен исследователем, как указано в ПРИМЕЧАНИИ на этапе 3.6). Окрашивание клеточной суспензии для специфических маркеров клеточной поверхности лимфоцитов человека (например, CD45, CD3 и т.д.) в течение 1 ч. Промыть клетки с помощью PBS, зафиксировать и пропитать их, как описано в шагах 3.5-3.6.
    7. Инкубируют клетки с внутриклеточными антителами окрашивания цитокинов (например, IFN-γ и TNF-α или IL-13 и IL-17A) в течение 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется окрашивать сначала поверхностные маркеры, затем внутриклеточные, так как фиксация может вызвать конформационные изменения в поверхностных белках, к которым связываются антитела.
    8. Промыть клетки с 500 мкл PBS и повторно суспендировать в 100 мкл PBS перед получением данных на проточном цитометре.
  4. Анализ шарикового массива может быть использован в сочетании с анализом супернатанта, описанного на шаге 3.2 (Выполните это без Брефельдина А). Это позволяет анализировать широкий спектр различных медиаторов воспаления (потенциально до 40-50 медиаторов). Соберите супернатант в 100 мкл аликвот и храните при -70 °C до готовности к анализу. В качестве альтернативы можно использовать мультиплексные хемилюминесцентные анализы20.
    1. Используйте мультиплексные шариковые массивы для анализа размороженных образцов. Используйте хранящийся супернатант для анализа производства цитокинов в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Выполните приобретение мультиплексного шарикового массива на проточном цитометре. Используйте соответствующее программное обеспечение для выполнения последующего анализа данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ шарикового массива может быть также выполнен на супернатанте из образцов периферической крови и/или BAL.

5. Оценка протеолиза легких методом конфокальной микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентная конфокальная микроскопия дополняет проточную цитометрию и может использоваться для оценки протеазных и воспалительных реакций АФК. Внеклеточные ловушки, такие как NETs и METs, состоят из внеклеточного хроматина (ДНК) с другими медиаторами воспаления, особенно протеазами, такими как нейтрофильная эластаза (NE) и матриксные металлопротеиназы (MMP). Они могут быть оценены в BAL и легочной ткани с использованием конфокальной микроскопии, и это было описано ранее Sharma, R. et al.21.

  1. Оценить прямую экспрессию протеазы в легочной ткани (как описано на этапе 4.2.1) с помощью конфокальной микроскопии и зимографии in situ 15,17.
    1. Используйте свежую или замороженную нефиксированную легочную ткань. Монтируйте секции, вырезанные до толщины 4 мкм, на направляющие сверхмерзлоты/адгезии. Предварительно разогрейте секции в 1x реакционном буфере в течение 5 мин.
    2. Добавьте желатиновую подложку с флуоресцеиновой маркировкой (30 мкг/мл на секцию) непосредственно на отдельные слайды для измерения протеолиза под действием металлопротеиназов.
    3. Поместите горки в горизонтальное положение и инкубируйте в защищенной светом, увлажненной камере при 37 °C в течение 1 часа.
    4. Промывайте секции в 1x реакционном буфере перед установкой.
    5. В качестве отрицательного контроля добавляйте в срезы только реакционный буфер без флуоресцентного желатина.
    6. Используйте конфокальный микроскоп для анализа лизиса субстрата путем исследования. Используйте ImageJ для определения площади легкого с признаками протеолиза. Для этого измерьте область легких, которая имеет окрашивание над фоном закаленного образца. В качестве другого контроля используйте легочную ткань без добавления флуоресцентного желатина15.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните это как минимум на 10 полях зрения высокой мощности (FOV) для каждого образца.
  2. Измеряют внеклеточную экспрессию АФК в легочной ткани по иммунореактивности для 3-нитротирозина (токсического продукта окислительного стресса)13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Репрезентативные результаты показывают, как воспалительные иммунные реакции на NTHi могут быть оценены / количественно оценены с помощью проточной цитометрии и конфокальной микроскопии. Ключевой частью интерпретации результатов является сравнение флуоресценции между контрольными и стимулированными образцами. Для оптимизации окрашивания образцов обычно требуется ряд предварительных экспериментов. Сколько различных цветов может быть исследовано одновременно, будет зависеть от количества каналов, доступных на проточном цитометре / конфокальном микроскопе. Результаты показаны для оценки 1) продукции АФК, 2) внутриклеточного окрашивания цитокинов легочной ткани человека и 3) зимографии in situ для измерения протеолиза легких.

На рисунке 1 показано представление продукции АФК моноцитами. Измерение АФК осуществляется путем окисления DHR123 с образованием флуоресценции. Клетки закрыты, и их срединная флуоресценция оценивается с помощью проточной цитометрии. Медиана флуоресценции стимулируемого образца сравнивается с контрольной.

На рисунке 2 показано внутриклеточное производство цитокинов лимфоцитами, полученными из легочной ткани человека. Легочная ткань должна быть разбита на одноклеточную суспензию, прежде чем могут быть выполнены анализы проточной цитометрии для оценки производства медиаторов воспаления, например, производства цитокинов лимфоцитами. Легочная ткань может быть разрушена механически или переварена химически, например, коллагеназой. Методы механического разрушения могут давать превосходные результаты, особенно с точки зрения сохранения окрашивания поверхности клеток (например, CD3 и CD4). Фильтрация образцов важна для исключения мусора, который может помешать анализу.

На рисунке 3 показана экспрессия активности протеазы, измеренная с помощью зимографии in situ . Нефиксированная ткань используется для оценки активности протеазы. Эти образцы обычно замораживают при -70 °C до анализа. Измеряется площадь ткани, которая имеет флуоресценцию протеазы, и результаты сравниваются между контрольными и стимулированными образцами.

Figure 1
Рисунок 1: Производство АФК моноцитами. (A) На панели показана стратегия гатинга для мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), при этом прямое рассеяние и боковое рассеяние используются для определения популяции фагоцитов. На панели (B) популяция фагоцитов дополнительно определяется экспрессией CD14 для маркировки моноцитов. Эта популяция моноцитов анализируется на флуоресценцию DHR в контрольных (C) и стимулированных образцах (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Производство цитокинов в легочной ткани. Клетки сначала анализируют на предмет экспрессии маркера лейкоцитов CD45 (A) с помощью проточной цитометрии. Затем эта популяция дополнительно анализируется на предмет экспрессии CD3 (B) и экспрессии CD4/CD8 (C). Клетки CD3/CD4+ оцениваются на внутриклеточную продукцию цитокинов в контрольных (D) и NTHi-стимулированных образцах (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Зимография легких in situ . Панель (А) показывает экспрессию хроматина/DAPI в участках легочной ткани. Панель (B) показывает флуоресцентное окрашивание, указывающее на наличие активности MMP. Панель (C) показывает объединенное изображение, указывающее, что активность MMP также солидаризируется с экспрессией хроматина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы, перечисленные здесь, используют флуоресцентную проточную цитометрию и методы конфокальной микроскопии, которые могут быть использованы в сочетании для получения подробной информации о воспалительной реакции легких на Hi.

Установление соответствующей антигенной формулировки Hi для использования имеет решающее значение, и в этом отношении желательно иметь конкретный вклад от микробиолога. Live Hi вызывает более сильную реакцию, в то время как убитые препараты Hi и компоненты Hi более стандартизированы и их легче хранить. PI будет маркировать только мертвые бактерии22; другие красители, такие как карбоксифлуоресцеин сукцинимидилестер (CFSE), могут быть использованы для маркировки живых бактерий для анализов фагоцитоза23. Следует провести серию предварительных экспериментов для оптимизации соответствующего антигена. Для использования живого NTHi оптимальным является MOI 100:1; более низкий MOI может не вызывать четкого иммунного ответа, в то время как более высокий MOI может быть токсичным для клеток. Однако кривая доза-реакция может давать полезную информацию и может быть очень ценной, особенно при первоначальной оптимизации метода24. В качестве положительного контроля может быть использована коммерчески полученная форма инактивированного золотистого антигена Staphylococcus, которая также помечена PI, как указано выше для анализа АФК/фагоцитоза. Для анализа Т-клеток стимуляция стафилококковым суперантигеном Е (SEB) может быть использована в качестве положительного контроля19,25.

Протоколы получения образцов BAL и/или легочной ткани должны быть четко установлены. Образцы BAL могут быть довольно изменчивыми между различными операторами. Ручной шприц для промывания правой средней доли дает хорошие результаты26. Получение образца легочной ткани из образцов лобэктомии требует установления сотрудничества с патологоанатомом. Образец легочной ткани должен иметь некоторый запас от опухоли (в идеале не менее 3-4 см). Более крупные образцы (например, не менее 25-50 г) дадут больше клеток, а также образцы, которые являются более проксимальными без явной эмфиземы. Механическая дезагрегация легочной ткани занимает много времени и, как правило, занимает не менее 2-3 ч на каждый образец19,27.

Предварительные эксперименты должны быть проведены для оптимизации окрашивания различных флуорофоров как для проточной цитометрии, так и для конфокальной микроскопии. Области, на которых следует сосредоточиться, включают определение наилучшей окрашивающей панели, окрашивание/концентрацию и обработку клеток/тканей для максимизации жизнеспособности28. Использование легочной ткани может быть связано с большим количеством тканевого мусора, чем другие образцы жидкости, такие как кровь или BAL, и это может оказать некоторое влияние на дифференцировку различных клеточных популяций с помощью проточной цитометрии. Соответствующий выбор антител должен быть определен и оптимизирован в предварительных экспериментах. Для поверхностной маркировки лимфоцитов анти-CD3 и CD4 могут быть использованы для Т-хелперных клеток, анти-CD3 и CD8 для цитотоксических Т-клеток и анти-CD3 и CD56 для NK-клеток. Выбор внутриклеточных цитокинов для изучения зависит от медиаторов, представляющих интерес, и количества параметров/цветов, которые могут быть проанализированы на проточном цитометре29. Специфической проблемой работы с макрофагами в легочной ткани является их высокий уровень аутофлуоресценции30; эта проблема может быть решена путем сравнения стимулированных клеток с фоновым контролем и добавлением специфических маркеров воспаления, таких как протеазы и гистоны.

Ограничением этих методов является потребность в надлежащим образом подготовленном и квалифицированном персонале для проведения экспериментов. Также требуются хорошо отлаженные средства проточной цитометрии и микроскопии. Использование образцов тканей человека связано со значительной вариабельностью, особенно при использовании легочной ткани; это может потребовать серии предварительных экспериментов для оптимизации анализов (особенно с проблемами фонового окрашивания).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников клинической иммунологии Monash Health за помощь в этой работе.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium chloride Sigma Aldrich 213330
Brefeldin Sigma Aldrich B6542
CD28 Thermofisher 16-0289-81
CD49d Thermofisher 534048
DAPI prolong gold Thermofisher P36931
DHR123 Sigma Aldrich 109244-58-8
Filcon sterile nylon mesh Becton Dickinson 340606
Gelatin substrate, Enzchek Molecular probes E12055
MACS mix tube rotater Miltenyi Biotec 130-090-753
Medimachine Becton Dickinson Catalogue number not available
Medicons 50 µm Becton Dickinson 340592
Pansorbin Sigma Aldrich 507858
Propidium iodide Sigma Aldrich P4170
Saponin Sigma Aldrich 8047152
Superfrost slides Thermofisher 11562203

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
  2. Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
  3. King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).
  4. Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).
  5. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  6. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
  7. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
  8. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
  9. Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).
  10. Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
  11. Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
  12. Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, Suppl 1 181-184 (1992).
  13. Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 6, Unit 6D (2010).
  14. King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
  15. Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
  16. King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
  17. King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371 (2015).
  18. Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
  19. King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
  20. Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
  21. Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).
  22. Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
  23. Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
  24. Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
  25. Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69 (2011).
  26. Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
  27. Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
  28. Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
  29. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606 (2016).
  30. Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 172 бактерии легкие воспаление проточная цитометрия конфокальная микроскопия
Оценка респираторных иммунных реакций на <em>Haemophilus Influenzae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dousha, L., Sharma, R., Lim, S.,… More

Dousha, L., Sharma, R., Lim, S., Ngui, J., Buckle, A. M., King, P. T. Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae. J. Vis. Exp. (172), e62572, doi:10.3791/62572 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter