Summary
Aquí introducimos un procedimiento para medir oligomeros proteicos y agregación en lysato celular y células vivas utilizando espectroscopia de correlación de fluorescencia.
Abstract
La agregación de proteínas es un sello distintivo de los trastornos neurodegenerativos como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Alzheimer (AD), la enfermedad de Parkinson (PD), la enfermedad de Huntington (EH), etc. Para detectar y analizar oligomeros o agregados de proteínas solubles o difusas, se ha utilizado espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS), que puede detectar la velocidad de difusión y el brillo de una sola partícula con una sola sensibilidad a moléculas. Sin embargo, el procedimiento adecuado y el know-how para la detección de agregación de proteínas no han sido ampliamente compartidos. Aquí, mostramos un procedimiento estándar de medición del FCS para las propiedades de difusión de proteínas propensas a la agregación en lysato celular y células vivas: fragmento carboxil-terminal de 25 kDa asociado al ELA de ADN TAR/proteína de unión al ARN 43 kDa (TDP25) y desmutasa de superóxido 1 (SOD1). Los resultados representativos muestran que una parte de los agregados de proteína fluorescente verde (GFP) etiquetados TDP25 se incluyó ligeramente en la fracción soluble de neuroblastoma murino Neuro2a lisato celular. Además, el SOD1 etiquetado con GFP que lleva mutación asociada a la ELA muestra una difusión más lenta en las células vivas. En consecuencia, aquí introducimos el procedimiento para detectar la agregación de proteínas a través de su propiedad de difusión utilizando FCS.
Introduction
Se sabe que las agregaciones proteicas que involucran trastornos neurodegenerativos como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, etc.en 1, son tóxicas y perturbarían la homeostasis proteica (proteostasis) en las células y órganos, que luego podrían conducir al envejecimiento2. Se espera que el aclaramiento de la agregación de proteínas sea una estrategia terapéutica; sin embargo, todavía no se han establecido productos químicos que prevengan la formación de agregación de proteínas y degraden los agregados proteicos (por ejemplo, moléculas pequeñas o fármacos). Además, la forma en que la agregación de proteínas ejerce toxicidad sigue siendo esquiva. Por lo tanto, para promover proyectos de investigación relacionados con la agregación de proteínas, es importante introducir procedimientos de alto rendimiento para simplemente detectar la agregación de proteínas. La detección de agregación de proteínas utilizando anticuerpos que reconocen la conformación de la agregación de proteínas y el tinte fluorescente específico de la agregación se ha utilizado ampliamente3. Sin embargo, es difícil detectar la agregación, especialmente en las células vivas utilizando tales procedimientos clásicos.
La transferencia de energía por resonancia Förster (FRET) es un procedimiento para detectar la agregación de proteínas y los cambios estructurales. Sin embargo, FRET es incapaz de analizar la dinámica proteica (por ejemplo, difusión y oligomerización de proteínas en células vivas)3. Por lo tanto, presentamos aquí un protocolo simple para detectar la agregación de proteínas en solución (por ejemplo, lisato celular) y células vivas utilizando espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS), que mide la propiedad de difusión y el brillo de moléculas fluorescentes con sensibilidad de molécula única4. FCS es un método de conteo de fotones mediante el uso de un microscopio confocal de escaneo láser (LSM). Utilizando un detector de fotones altamente sensible y el cálculo de la función de autocorrelación (ACF) del tiempo de llegada del fotón, se mide el paso a través del tiempo y el brillo de las moléculas fluorescentes en el volumen de detección. La difusión se ralentiza con un aumento del peso molecular; por lo tanto, la interacción intermolecular se puede estimar utilizando FCS. Aún más potente, un aumento en el brillo de la molécula fluorescente indica la homo-oligomerización de las moléculas. Por lo tanto, fcs es una herramienta poderosa para detectar dicha agregación de proteínas.
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Protocol
1. Materiales y reactivos
- Utilice soluciones libres de pirogénicos y medios para el cultivo celular (Tabla 1).
- Preparar soluciones para el experimento bioquímico utilizando agua ultrapura y utilizar como DNase / RNase libre.
- Seleccione un FBS adecuado para la referencia cultural de celda con un proceso de comprobación de lote. Puesto que el lote FBS seleccionado cambia regularmente, el catálogo y el número de lote para FBS no se pueden representar aquí.
- ADN plásmido
- Preparar pmeGFP-N15 para la expresión monómera eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 para la expresión GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 para la expresión SOD1-G85R-GFP; y pCAGGS8 como portador.
NOTA: meGFP es una variante monómera portadora de mutación A206K de GFP mejorado (eGFP). TDP25 es un fragmento de terminal C asociado a ELA de TDP-43. SOD1-G85R es un mutante asociado a la ELA de SOD1.
- Preparar pmeGFP-N15 para la expresión monómera eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 para la expresión GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 para la expresión SOD1-G85R-GFP; y pCAGGS8 como portador.
- Tensión celular
- Utilice células de neuroblastoma murino Neuro2a.
NOTA: Las células neuro2a tienen alta eficiencia de transfección y proteínas exógenas altamente exprés. Para la expresión TDP25, se requieren cepas celulares con eficiencias de alta expresión como células Neuro2a o HEK293. En las células HeLa, TDP25 no fue capaz de expresarse eficientemente.
- Utilice células de neuroblastoma murino Neuro2a.
2. Cultivo celular y transfección
- Preparar un plato de plástico de 100 mm que cultiva células Neuro2a semiconfluentemente en el medio de crecimiento normal.
NOTA: Es necesario incubar a 37 °C durante aproximadamente 48-72 horas después de la siembra anterior hasta que se alcance la semiconfluencia. - Retire el medio.
- Añadir 0,5 ml de solución trypsin-EDTA en el plato de cultivo celular e incubarlos a 37 °C durante 1 minuto.
- Añadir 9,5 ml de medio de crecimiento normal en el plato y suspender las células separadas.
- Usando Trypan blue para manchar las células muertas, cuente el número de celdas usando un contador de celdas o manualmente. A continuación, diluya las células en medio de cultivo (1,0 × 105/ml).
- Agregue 2 ml de suspensión celular en un plato de plástico de 35 mm para lisis celular o un plato base de vidrio para la medición de células vivas.
- Incubar el plato a 37 °C durante 1 día.
- Comience los siguientes preparativos 15 minutos antes del día de la transfección.
- Prepare dos tubos de 1,5 ml y agregue 100 μL de Opti-MEM I a cada tubo.
- En el primer tubo, mezcle 1,0 μg de ADN plásmido (Solución A). En el segundo tubo, mezclar 2,5 μL de Lipofectamina 2000 (Solución B).
NOTA: Para mantener la eficiencia de transfección, mantenga la cantidad total de ADN igual. Para reducir el nivel de expresión para la medición del FCS en células vivas, la cantidad fraccionada de ADN plásmido para la expresión proteica debe disminuir (por ejemplo, 0,2 μg de pmeGFP-N1-SOD1-G85R y 0,8 μg de mezcla de pCAGGS). Además, mantener la misma relación entre el volumen de lipofectamina 2000 y la cantidad de ADN plásmido. - Mezcle suavemente la solución A y B añadiendo una en cualquiera de los tubos y, a continuación, incubarla durante 1 minuto a temperatura ambiente (Solución C).
- Agregue la solución C al medio de cultivo; e incubar las células durante 24 h a 37 °C.
3. Lisis celular e intercambio medio
- Compruebe la expresión GFP utilizando un microscopio de rutina.
- Retire el medio del plato.
- Añadir 2 ml de PBS a 25 °C para lavar el medio. Retire el PBS.
- Coloque el plato en una placa de aluminio sobre el hielo triturado.
NOTA: Utilizamos una placa de aluminio de 1 mm de espesor cortada en una tienda de herramientas dominical o comercialmente disponible como equipo de laboratorio. - Añadir 200 μL de tampón de lisis a 4 °C. Agitar el plato suavemente para que el tampón se distribuya uniformemente en la parte inferior del plato.
- Raspa el plato usando un rascador de células y recupera el lysate con restos celulares sin disuelto en un nuevo tubo de 1,5 ml.
- Centrífuga la solución a 20.400 x g durante 5 minutos a 4 °C.
- Recupera el sobrenadante en un nuevo tubo de 1,5 ml y mantenlo a 4 °C o sobre hielo.
NOTA: No congele el lysate. - Para las mediciones de células vivas, reemplace el medio antes de la medición. Compruebe el accesorio de celda utilizando un microscopio de contraste de fase. Confirme la expresión utilizando un microscopio de fluorescencia.
4. Calibración de espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS)
- Inicie el sistema y ejecute el software de operación. Encienda el argón+ láser (458/477/488/514 nm). Estabilice el sistema al menos durante 30 min.
- Configurar la trayectoria óptica: Divisor de haz principal: HFT488; Espejo dicrónico: NFT600; Filtro de barrera de fluorescencia: un filtro de paso de banda 505-540 (BP505-540); Detector: fotodiodo de avalancha (APD)).
- Ajuste el tamaño del agujero introduciendo el valor directamente (66 μm; 1 unidad ventilada).
- Añadir la solución Rhodamine 6G (Rh6G) en un pozo de la cámara de vidrio de la cubierta en el escenario.
- Añade el agua ultrapura de inmersión sobre el objetivo. No utilice el aceite de inmersión.
- Ajuste la cámara en el escenario del microscopio. Mueva el escenario a la posición adecuada.
- Concéntrese en la superficie superior del vidrio midiendo la luz dispersa de la superficie de vidrio. Después de bajar la lente objetivo hacia la parte inferior, gire la perilla de enfoque en el sentido de las agujas del reloj para ajustarse.
NOTA: Compruebe la dirección de giro de la perilla de enfoque porque es opuesta entre las fabricadas en Japón y Alemania. - Levante el punto focal 200 μm por encima de la superficie superior del vidrio para observar el interior de la solución.
- Haga clic en la velocidad de recuento y supervise la tasa de recuentos de fotones.
- Aumente gradualmente el valor de los filtros ajustables acousto-ópticos (AOTF) (por ejemplo, transmisión láser de excitación) para que el valor de la velocidad de recuento sea superior a 10 kHz.
- Haga clic en Ajuste de agujero y abra el asistente de ajuste de agujero. Encuentra la posición del agujero con el mayor número (un pico) de fotones en el eje x e y.
- Gire el anillo de corrección de la lente objetivo para que el valor de recuentos por molécula (CPM) sea el más alto.
NOTA: Dado que el espesor del vidrio de la cubierta de la cámara especificada aquí es de 0,12-0,17 mm, el anillo de corrección está alrededor de su mínimo o a pocos giros de él, donde el CPM está en su máximo. - Disminuya el valor AOTF gradualmente para que el valor CPM se convierta en 2-3 kHz.
- Adquiera la función de autocorrelación (ACF) de Rh6G para 90 s.
- Una vez completada la medición, haga clic en Ajustar para realizar el análisis de ajuste de curvas.
- Seleccione un modelo para la difusión tridimensional (3D) de un componente con un estado de trillizos.
NOTA: El Rh6G es monodisperse y difuso de un componente con un estado de trillizos. - Ajuste la hora de inicio de la conexión moviendo la línea roja. Haga clic en Ajustar todo y compruebe la desviación de ajuste. Después de realizar el ajuste de curva, asegúrese de que el tiempo de difusión (DT) y el parámetro de estructura (SP) estén aproximadamente en el rango de 20-30 μs y 4-8, respectivamente.
- Recuerde el valor del parámetro estructural. Utilice el valor sp para el análisis de ajuste de curvas de todas las CA medidas el mismo día, en las mismas condiciones ópticas, y utilizando el mismo tipo de plato base de vidrio o vidrio de cubierta con cámara en el escenario del microscopio.
5. Medición del FCS en el lisato celular
- Preparar los lysates de celda (ver arriba).
- Coloque el lysate en la cámara de vidrio de la cubierta. Coloque una tapa para evitar el secado y la tapa del escenario para un sombreado ligero.
- Establezca la condición de adquisición, la potencia láser, el tiempo de medición y las repeticiones.
- Haga clic en Contar velocidad y ajuste el valor AOTF del láser para que el valor CPM se convierta en más de 1 kHz.
- Realice una medición de prueba durante 1 min. Compruebe si el ACF calculado muestra una amplitud positiva y una decaimiento suave.
- Realice la medición principal durante 5 min.
NOTA: El tiempo total de medición se incrementa gradualmente hasta que la forma del ACF no cambia incluso si se aumenta el tiempo de medición. - Haga clic en Ajustar para realizar el análisis de ajuste de curvas.
- Seleccione un modelo para difusión 3D de dos componentes con un estado de trillizos. Recuerde introducir el valor del SP y cambiar su configuración a "Fijo" no "Libre" antes de hacer clic en Ajustar todo.
- Exporte la tabla ajustada como un archivo de texto delimitado por tabulaciones.
- Si es necesario, exporte el registro de tasa ACF y Count como un archivo de texto delimitado por tabulaciones.
6. Medición del FCS en células vivas
- Reemplace el medio por uno nuevo antes de la medición.
- Utilice una incubadora de etapa de calor. Poner el plato de cultivo celular en el escenario del microscopio.
- Confirme el enfoque y la posición utilizando el micrope confocal. Seleccione la celda de medición. Acerque y ajuste la posición de la celda. Adquiera imágenes de fluorescencia de una célula que expresa GFP utilizando el modo de velocidad de escaneo lento.
- Seleccione una posición de medición FCS utilizando Posición en la sección "FCS".
- Seleccione al menos un punto de medición FCS utilizando un punto de mira (Figura 1).
- Mida el ACF durante 1 min.
NOTA: Debido a que las proteínas fluorescentes tienden a ser fotoblechadas en células vivas debido al movimiento lento en comparación con la solución, el tiempo de medición debe ser mínimo. Generalmente es difícil obtener ACF en la célula tan suavemente como las mediciones de la solución porque la medición prolongada conducirá a la fotobleaching de proteínas fluorescentes. - Haga clic en Ajustar para realizar el análisis de ajuste de curvas utilizando un modelo para difusión 3D de dos componentes con un estado de trillizos.
NOTA: Para las mediciones de células vivas, un modelo para difusión 3D de dos componentes con un estado de trillizos sería mejor porque es empíricamente difícil disminuir el valor chi-cuadrado con un modelo de difusión 3D de un componente debido a la existencia de varios componentes móviles en la célula viva. Pero incluso utilizando un modelo para la difusión 3D de tres componentes, los componentes de difusión generalmente no están separados en comparación con el uso del modelo para dos componentes.
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Representative Results
Realizamos la medición fcs de GFP-TDP25 en lisato celular y SOD1-G85R-GFP en células vivas. En ambos casos, se pudo adquirir una amplitud positiva y AIF suaves. Hemos demostrado que una porción de GFP-TDP25 expresada en células Neuro2a fue recuperada en la fracción soluble bajo la condición indicada6. En la fracción soluble del lisato celular, se detectaron moléculas de fluorescencia extremadamente brillantes en el registro de tasa de recuento de fotones utilizando FCS(Figura 2A,parte superior, flecha). Tales "picos (también llamados ráfaga)" no se observaron en monómeros GFP y solución de tinte fluorescente químico monodisperoso, lo que sugiere que los picos indican proteínas oligoméricas9. El análisis de ajuste de curvas utilizando un modelo que suponiendo una difusión 3D de dos componentes con un estado de trillizos mostró que las moléculas de difusión rápida (DTFast = 186 μs) eran ~90% y el 10% restante era de 2,3 ms (Figura 2A,inferior; y Tabla 2).
Durante la medición SOD1-G85R-GFP en celdas vivas, el registro de tasa de recuento de fotones mostró una disminución gradual, lo que sugiere su fotobleaching en el volumen de detección(Figura 2B,arriba). Aunque la contribución del fotobleaching se mostró en un rango de más de 1 s en el ACF, se observó una amplitud positiva y una decaimiento suave del ACF(Figura 2B,abajo). El análisis de ajuste de curvas utilizando un modelo que suponiendo una difusión 3D de dos componentes con un estado de trillizos mostró que las moléculas de difusión rápida (DTFast = 397 μs) eran ~93.4% y el 6.6% restante era de 12.3 ms (Tabla 2). La mutación ligada a la ELA, G85R, en SOD1 no permitió una diferencia dramática en la propiedad de difusión en comparación con el tipo salvaje. Sin embargo, la inhibición del proteasoma disminuyó la tasa de difusión sólo en el mutante G85R de SOD1 en el citoplasma7.
Figura 1: Imagen fluorescente confocal de células Neuro2a que expresan SOD1-G85R-GFP. Imagen fluorescente confocal de células Neuro2a que expresan SOD1-G85R-GFP. El punto de mira indica la posición de medición del FCS en el citoplasma. Barra = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados típicos de FCS y curvas ajustadas para las funciones de autocorrelación. (A y B) Superior: Tasa de recuento de fotón grabado en el rango de tiempo de medición fcs (línea verde). Inferior: Funciones calculadas de autocorrelación (ADF; Líneas crudas y grises) y curvas ACF ajustadas utilizando un modelo para difusión tridimensional de dos componentes con un estado de trillizos (líneas Fit, magenta). G(τ) para el eje Y indica la amplitud de los ADF en el momento τ seg. para el eje X. Las líneas de puntos muestran los puntos de hora de inicio y finalización de la conexión. Las flechas azul oscuro muestran el pico con proteínas extremadamente brillantes que pasan a través del volumen de detección (es decir, oligomeros solubles/agregados). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre del material/equipo | Componentes | Comentarios/Descripción |
| Solución rhodamina 6G de 0,1 mM. | ||
| 1 M HEPES-KOH pH 7,5 | ||
| 2 M Cloruro de sodio (NaCl) | ||
| Tampón de lisis | 50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Tritón X-100, 1× cóctel inhibidor de la proteasa | Cóctel inhibidor de la proteasa debe mezclarse justo antes de la lisis celular. |
| Medio de crecimiento normal | DMEM complementado con 10% FBS y 100 U/mL penicilina G y 100 mg/mL Streptomicina | Se debe requerir verificación de lote para FBS. |
| Solución salina del búfer de fosfato (PBS) | NaCl de 137 mM, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 |
Tabla 1: Composiciones de soluciones
| CPM (kHz) | DTRápido (ms) | Componente rápido (%) | DTLento (ms) | Componente lento (%) | |
| GFP-TDP25 en lisato | 7.9 | 186 | 89.7 | 2.3 | 10.3 |
| SOD1-G85R-GFP en células vivas | 6.3 | 397 | 93.4 | 12.3 | 6.6 |
Tabla 2: Valores ajustados típicos para las funciones de autocorrelación
Los valores ajustados para las funciones de autocorrelación se representan en la Figura 2 utilizando un modelo para difusión tridimensional de dos componentes con un estado de trillizos. Se representan los recuentos por molécula (CPM), el tiempo de difusión rápido y lento (DTFast y DTSlow,respectivamente), y sus componentes (componente Rápido y Lento).
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Discussion
En cuanto a la calibración del sistema antes de las mediciones, se deben utilizar los mismos cristalerías que la utilizada para medir la muestra (por ejemplo, la cámara de vidrio de cubierta de 8 pozos para el lisato celular y la placa base de vidrio de 35 mm para células vivas). Debido a la adsorción de Rh6G en el vidrio, su concentración efectiva a veces puede disminuir. Si es así, se debe utilizar una solución Rh6G altamente concentrada, como 1 μM, solo para el ajuste del agujero. Se deben evitar tasas de recuento de fotón extremadamente altas para proteger el detector (por ejemplo, más de 1000 kHz). Además, la solución concentrada no es adecuada para la adquisición de la función de autocorrelación (mantener menos de 100 kHz). La calibración de la posición del agujero es importante. Si el sistema óptico se utiliza con frecuencia, es raro para la dislocación dramática del agujero; por lo tanto, el uso de "Bien" al principio a menudo no es ningún problema para encontrar la posición adecuada. Si no se encuentra ninguna posición máxima de las tasas de recuento usando "Fino", utilice el "Grueso" para mover el agujero de un extremo del rango de movimiento al otro antes de la búsqueda de posiciones usando "Fino". Si la amplitud del ACF era plana, compruebe si el enfoque y la posición son apropiados.
Después de la medición Rh6G y su ajuste, si el DT y/o SP está fuera del rango indicado, vuelva a probar el ajuste del agujero y del anillo de corrección. Cuando todavía se muestra fuera de la gama, recomendamos ponerse en contacto con el soporte del fabricante, ya que es probable debido a la sospecha de deserción del sistema óptico. Utilizando el DT y el SP medidos además del coeficiente de difusión conocido de Rh6G (414 μm2/s) en agua, la cintura efectiva del haz se puede calcular porque el DT depende de la cintura del haz10. Además, como el SP es la relación entre la cintura del haz y la altura del volumen de detección eficaz, se puede calcular el volumen de detección. El cálculo del volumen es necesario para determinar la concentración absoluta. Más descripción del principio y solución de problemas durante la calibración también está disponible en protocolos como se informó anteriormente11,12,13.
Algunos picos se observaron en la medición fcs de GFP-TDP25 en lisato celular(Figura 2A,arriba). Demostramos que tales picos se observaron en la medición fcs de huntingtina propensa a agregados incluyendo repeticiones de poliglutamina expandida etiquetadas con GFP o proteína fluorescente amarilla (YFP) (HttQ78 y HttQ143)9; sugiere oligomeros solubles/agregados de GFP-TDP25 en la fracción soluble del lisato celular. Pero tal pico de población era raro; por lo tanto, el ACF y su resultado de ajuste de curvas pueden no incluir una contribución importante de tales picos. Una posible razón para que sólo una pequeña cantidad de agregados se incluyan en la fracción soluble es probable porque TDP25 es altamente propenso a la agregación y sus agregados se fraccionan en la fracción insoluble como se muestra utilizando un fraccionamiento del lisato celular seguido de detección de hinchazón occidental6. Los fenómenos de la tendencia a recuperarse a la fracción insoluble de proteína propensa a la agregación se han observado a menudo6,9. Estos oligomeros/agregados solubles no pueden detectarse fácilmente utilizando métodos bioquímicos convencionales como SDS-PAGE seguidos de hinchazón occidental; por lo tanto, FCS tiene una ventaja. Sin embargo, analizar multi-componentes usando FCS convencional es difícil porque mide la población promedio. Más procedimientos de desarrollo combinados con el análisis no paramétrico bayesiano determinarían los multi-componentes de la muestra sin ninguna suposición para los componentes14.
El tiempo de difusión en las células vivas fue relativamente lento en comparación con el lisato celular. Dado que se sabe que la viscosidad en la célula es más alta que la de soluciones como PBS y el búfer que contiene detergente15,el tiempo de difusión en las células vivas teóricamente se hace 2,5-3 veces más largo. Debido a esta difusión lenta en células vivas que se comparan en solución, a menudo se puede causar fotobleaching de etiquetas fluorescentes. Para corregir el efecto fotobleaching en las AAC, se han propuesto algunos procedimientos como la asunción de decaimiento exponencial16 y el filtrado de ruido mediante función de wavelet17. Aunque se cree que estas correcciones son efectivas, todavía no ha sido tan simple para los usuarios generales porque requiere habilidades de programación. Además, en las mediciones de células vivas, el rango de ajuste debe determinarse con más cuidado para que el valor chi-cuadrado de la curva instalada se vuelva pequeño. Como se muestra en la Figura 2B,el rango donde G(τ) era menor que 1 se excluyó del rango de ajuste. Alternativamente, se requieren más etiquetas fluorescentes fototables para analizar moléculas que se difusan/mueven lentamente. GFP es fácil de usar como etiqueta de etiquetado, y su estabilidad está bien, pero a menudo se fotobleached durante las mediciones fcs. Para superar esta propiedad fototable, HaloTag con tetrametilrhodamina (TMR) como un tinte fluorescente químico ha estado disponible18. Sin embargo, el etiquetado incompleto por los ligandos fluorescentes (por ejemplo, ligando TMR) y las piscinas de tintes atrapados son problemas problemáticos para el etiquetado específico de proteínas de interés19; por lo tanto, la expresión exógena de proteínas de interés etiquetada con proteínas fluorescentes sería la primera opción para el etiquetado fluorescente en células vivas.
Hay muchos tipos de proteínas fluorescentes, así como tintes fluorescentes químicos; sin embargo, como se muestra en este artículo, GFP mejorado monomérico (meGFP) es una etiqueta fácil de usar para FCS, así como otra microscopía de fluorescencia porque sus propiedades bioquímicas y de fluorescencia son bien conocidas. Por lo tanto, en nuestros estudios, meGFP es la primera opción y generalmente se utiliza para etiquetar las proteínas propensas a la agregación para mediciones de FCS6,7,9.
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Disclosures
Estos autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
A.K. recibió el apoyo de una Beca de Ayuda para la Investigación Científica (C) (#18K06201) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS), mediante una subvención de la Fundación Nakatani para contramedidas contra nuevas infecciones por coronavirus, mediante una subvención de la Oficina de La Universidad de Hokkaido para el Desarrollo de Futuros Líderes de Investigación (L-Station), y una subvención en ayuda de la Fundación Hoansha. M. K. recibió el apoyo parcial de una Beca JSPS de Investigación Científica sobre Áreas Innovadoras "Química para Biosistemas de Hacinamiento Multimolecular" (#20H04686), y una Subvención JSPS de Ayuda para la Investigación Científica en Áreas Innovadoras "Física de la Información de asuntos vivos" (#20H05522).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
References
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