Auswahl von Transporter-gezielten inhibitorischen Nanobodies durch Solid-Supported-Membrane (SSM)-basierte Elektrophysiologie

Zusammenfassung

Nanobodies sind wichtige Werkzeuge in der Strukturbiologie und stellen ein großes Potenzial für die Entwicklung von Therapien dar. Die Auswahl von Nanobodies mit hemmenden Eigenschaften kann jedoch eine Herausforderung darstellen. Hier demonstrieren wir den Einsatz von Solid-Supported-Membrane (SSM)-basierter Elektrophysiologie zur Klassifizierung von inhibitorischen und nicht-inhibitorischen Nanobodies, die auf elektrogene Membrantransporter abzielen.

Zusammenfassung

Single-Domain-Antikörper (Nanobodies) wurden in großem Umfang in mechanistischen und strukturellen Studien von Proteinen eingesetzt und stellen ein enormes Potenzial als Werkzeuge für die Entwicklung klinischer Therapien dar, von denen viele von der Hemmung von Membranproteinen wie Transportern abhängen. Die meisten Methoden zur Bestimmung der Hemmung der Transportaktivität sind jedoch in Hochdurchsatzroutinen schwer durchzuführen und hängen von der Verfügbarkeit markierter Substrate ab, wodurch das Screening großer Nanobody-Bibliotheken erschwert wird. Die SSM-Elektrophysiologie (Solid-Supported Membrane) ist eine Hochdurchsatzmethode, die zur Charakterisierung elektrogener Transporter und zur Messung ihrer Transportkinetik und -hemmung verwendet wird. Hier zeigen wir die Implementierung der SSM-basierten Elektrophysiologie zur Auswahl hemmender und nicht-inhibitorischer Nanokörper, die auf einen elektrogenen Sekundärtransporter abzielen, und zur Berechnung von Nanobodies-Hemmkonstanten. Diese Technik kann besonders nützlich sein, um inhibitorische Nanobodies auszuwählen, die auf Transporter abzielen, für die keine markierten Substrate verfügbar sind.

Einleitung

Antikörper bestehen aus zwei identischen schweren Ketten und zwei leichten Ketten, die für die Antigenbindung verantwortlich sind. Kameliden haben nur schwerkettige Antikörper, die im Vergleich zu herkömmlichen Antikörpern eine ähnliche Affinität für ihr verwandtes Antigen aufweisen^1,2. Die Single Variable Domain (VHH) von nur schwerkettigen Antikörpern behält das volle Antigenbindungspotenzial bei und hat sich als sehr stabil^{erwiesen 1,2}. Diese isolierten VHH-Moleküle oder "Nanobodies" wurden in Studien im Zusammenhang mit der Biochemie von Membranpro....

Protokoll

1. Rekonstitution von Membranproteinen

1. Mischen Sie 3 ml polare E. coli-Lipide mit 1 ml Phosphatidylcholin in einem runden Bodenkolben unter einer belüfteten Haube.
2. Trocknen Sie die Lipidmischung 20 min unter Vakuum mit einem Rotationsverdampfer und einem Wasserbad bei 37 °C, um Chloroform zu entfernen. Bei Bedarf weiter unter Stickstoff oder Argongas trocknen.
3. Unter Verwendung von TS-Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl), der 2 mM β-Mercaptoethanol enthält, resuspendieren Lipide auf 25 mg/ml.
4. Aliquote Lipide in 500 μL Aliquots, schockgefrieren in flüssigem Stickstoff und lagern bei -80 °C.
5. Ein 500 μL Ali....

Ergebnisse

Die SSM-basierte Elektrophysiologie wurde in großem Umfang zur Charakterisierung von elektrogenen Transportern eingesetzt. In dem hier vorgestellten Protokoll zeigen wir, wie nanobodies, die auf einen sekundären Transporter (hier ein bakterieller Cholin-Symporter) abzielen, anhand ihrer inhibitorischen und nicht-inhibitorischen Eigenschaften mit SSM-basierter Elektrophysiologie klassifiziert werden können. Eine der nützlichsten Eigenschaften dieser Technik ist, dass sie das Hochdurchsatz-Screening mehrerer Pufferbedingun.......

Diskussion

Die hier vorgestellte Technik klassifiziert Nanobodies mit inhibitorischen und nicht-inhibitorischen Eigenschaften, die auf elektrogene Transporter abzielen. Die Beurteilung des Substrattransports ist aufgrund der Detektion der Ladungsbewegung durch den in die Membran von Proteoliposomen eingebetteten Transporter möglich. Einige der kritischen Schritte während des Aufbaus eines Experiments sind die Rekonstitution von aktivem Protein in Liposomen, die Herstellung stabiler Monoschichten auf SSM-Chips und die Wiederherstell.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1-Octadecanthiol-Lösung	Sigma Aldrich	O1858-25ML
1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin	Avanti Polare Lipide	850356C-25mg
Bio-Beads SM-2 Adsorptionsmittel (Polystyrol-Adsorptionskügelchen)	BioRad	#152-3920
PD 10 Entsalzungssäulen	GE Healthcare	GE17-0851-01
Filter 200 nm Membran	Whatman Nucleopore	WHA800282
2-Propanol	Merck	33539-1L-R
n-Decan	Sigma Aldrich	8034051000
n-Dodecyl-ß-D-Maltosid (DDM)	Avanti Polare Lipide	850520P-25g
Natriumchlorid	AppliChem	131659.1211
(SSM-Aufbau) SURFE2R N1	Nanion	-----
SURFE2R N1 Single Sensor Chips	Nanion	# 161001
Trizma Base	Sigma Aldrich	T1503
E. coli Polar Lipid Extrakt	Avanti Polar Lipids	100600C
Ei PC L-α-phosphatidylcholin	Avanti Polar Lipids	840051C