Methodenartikel

Auswahl von Transporter-gezielten inhibitorischen Nanobodies durch Solid-Supported-Membrane (SSM)-basierte Elektrophysiologie

DOI:

10.3791/62578

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3. Mai 2021

 , 
1Biozentrum, University of Basel

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Nanobodies sind wichtige Werkzeuge in der Strukturbiologie und stellen ein großes Potenzial für die Entwicklung von Therapien dar. Die Auswahl von Nanobodies mit hemmenden Eigenschaften kann jedoch eine Herausforderung darstellen. Hier demonstrieren wir den Einsatz von Solid-Supported-Membrane (SSM)-basierter Elektrophysiologie zur Klassifizierung von inhibitorischen und nicht-inhibitorischen Nanobodies, die auf elektrogene Membrantransporter abzielen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Single-Domain-Antikörper (Nanobodies) wurden in großem Umfang in mechanistischen und strukturellen Studien von Proteinen eingesetzt und stellen ein enormes Potenzial als Werkzeuge für die Entwicklung klinischer Therapien dar, von denen viele von der Hemmung von Membranproteinen wie Transportern abhängen. Die meisten Methoden zur Bestimmung der Hemmung der Transportaktivität sind jedoch in Hochdurchsatzroutinen schwer durchzuführen und hängen von der Verfügbarkeit markierter Substrate ab, wodurch das Screening großer Nanobody-Bibliotheken erschwert wird. Die SSM-Elektrophysiologie (Solid-Supported Membrane) ist eine Hochdurchsatzmethode, die zur Charakterisierung elektrogener Transporter und zur Messung ihrer Transportkinetik und -hemmung verwendet wird. Hier zeigen wir die Implementierung der SSM-basierten Elektrophysiologie zur Auswahl hemmender und nicht-inhibitorischer Nanokörper, die auf einen elektrogenen Sekundärtransporter abzielen, und zur Berechnung von Nanobodies-Hemmkonstanten. Diese Technik kann besonders nützlich sein, um inhibitorische Nanobodies auszuwählen, die auf Transporter abzielen, für die keine markierten Substrate verfügbar sind.

Einleitung

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Antikörper bestehen aus zwei identischen schweren Ketten und zwei leichten Ketten, die für die Antigenbindung verantwortlich sind. Kameliden haben nur schwerkettige Antikörper, die im Vergleich zu herkömmlichen Antikörpern eine ähnliche Affinität für ihr verwandtes Antigen aufweisen1,2. Die Single Variable Domain (VHH) von nur schwerkettigen Antikörpern behält das volle Antigenbindungspotenzial bei und hat sich als sehr stabilerwiesen 1,2. Diese isolierten VHH-Moleküle oder "Nanobodies" wurden in Studien im Zusammenhang mit der Biochemie von Membranproteinen als Werkzeuge zur Stabilisierung der Konformationen3,4, als Inhibitoren5,6, als Stabilisierungsmittel7und als Gadgets zur Strukturbestimmung8,9,10 . Nanobodies können durch die Immunisierung von Kameliden zur Voranreicherung von B-Zellen, die zielspezifische Nanobodies kodieren, und anschließende Isolierung von B-Zellen erzeugt werden, gefolgt von Klonierung der Nanobody-Bibliothek und Selektion durch Phagenanzeige11,12,13. Eine alternative Möglichkeit, Nanobodies zu erzeugen, basiert auf In-vitro-Selektionsmethoden, die auf dem Aufbau von Bibliotheken und der Selektion durch Phagenanzeige, Ribosomenanzeige oder Hefeanzeigeberuhen 14,15,16,17,18,19,20. Diese In-vitro-Methoden erfordern große Bibliotheksgrößen, profitieren jedoch von der Vermeidung von Tierimmunisierungen und bevorzugen die Auswahl von Nanobodies, die auf Proteine mit relativ geringer Stabilität abzielen.

Die geringe Größe von Nanobodies, ihre hohe Stabilität und Löslichkeit, starke Antigenaffinität, geringe Immunogenität und relativ einfache Herstellung machen sie zu starken Kandidaten für die Entwicklung vonTherapeutika 21,22,23. Insbesondere Nanobodies, die die Aktivität mehrerer Membranproteine hemmen, sind potenzielle Vorteile für klinische Anwendungen5,24,25,26. Im Falle von Membrantransportern ist es notwendig, um zu beurteilen, ob ein Nanobody eine hemmende Aktivität aufweist, einen Assay zu entwickeln, der den Nachweis von transportierten Substraten und/oder Co-Substraten ermöglicht. Solche Assays beinhalten in der Regel markierte Moleküle oder das Design substratspezifischer Nachweismethoden, denen möglicherweise eine universelle Anwendung fehlt. Darüber hinaus erfordert die Identifizierung von inhibitorischen Nanobodies in der Regel das Screening einer großen Anzahl von Bindemitteln. Daher ist ein Verfahren, das in einem Hochdurchsatzmodus eingesetzt werden kann und nicht auf markierte Substrate angewiesen ist, für diese Auswahl unerlässlich.

SSM-basierte Elektrophysiologie ist eine extrem empfindliche, hochgradig zeitaufgelöste Technik, die die Detektion der Bewegung von Ladungen über Membranen (z.B. Ionenbindung/-transport) ermöglicht27,28. Diese Technik wurde angewendet, um elektrogene Transporter zu charakterisieren, die aufgrund des relativ geringen Umsatzes dieser Proteine29, 30 , 31,32,33,34,35mit anderen elektrophysiologischen Techniken schwer zu untersuchen sind. Die SSM-Elektrophysiologie erfordert keine Verwendung von markierten Substraten, sie eignet sich für das Hochdurchsatz-Screening und es können entweder Proteoliposomen oder Membranvesikel verwendet werden, die den transporter von Interesse enthalten. Hier zeigen wir, dass SSM-basierte Elektrophysiologie verwendet werden kann, um Transporter-gerichtete Nanobodies mit inhibitorischen und nicht-inhibitorischen Eigenschaften zu klassifizieren. Als Proof-of-Principle beschreiben wir die Rekonstitution eines bakteriellen Cholintransporters in Liposomen, gefolgt von detaillierten Schritten zur Immobilisierung von Proteoliposomen auf den SSM-Sensoren. Als nächstes beschreiben wir, wie SSM-basierte elektrophysiologische Messungen des Cholintransports durchzuführen sind und wie die halbmaximale effektive Konzentration (EC50)bestimmt wird. Wir zeigen dann, wie man SSM-basierte Elektrophysiologie verwendet, um mehrere Nanobodies zu screenen und Inhibitoren des Cholintransports zu identifizieren. Schließlich beschreiben wir, wie die halbmaxim maximalen Hemmkonzentrationen (IC50)ausgewählter inhibitorischer Nanokörper bestimmt werden können.

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Protokoll

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1. Rekonstitution von Membranproteinen

  1. Mischen Sie 3 ml polare E. coli-Lipide mit 1 ml Phosphatidylcholin in einem runden Bodenkolben unter einer belüfteten Haube.
  2. Trocknen Sie die Lipidmischung 20 min unter Vakuum mit einem Rotationsverdampfer und einem Wasserbad bei 37 °C, um Chloroform zu entfernen. Bei Bedarf weiter unter Stickstoff oder Argongas trocknen.
  3. Unter Verwendung von TS-Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl), der 2 mM β-Mercaptoethanol enthält, resuspendieren Lipide auf 25 mg/ml.
  4. Aliquote Lipide in 500 μL Aliquots, schockgefrieren in flüssigem Stickstoff und lagern bei -80 °C.
  5. Ein 500 μL Aliquot Lipide auftauen und 1:1 mit TS-Puffer verdünnen, der 2 mM β-Mercaptoethanol enthält.
  6. Extrudieren Sie die Lipidsuspension 15 Mal mit einer 400 nm Membran.
  7. Verdünnen Sie die Lipidsuspension auf eine endgültige Lipidkonzentration von 4,4 mg/ml.
  8. Fügen Sie n-Dodecyl-β-D-Maltosid (DDM) hinzu, um eine Endkonzentration von 0,2% zu erhalten, und lassen Sie es für 1 h bei 200 U / min bei Raumtemperatur (RT) rotieren.
  9. Fügen Sie das gereinigte Protein zu den Lipiden unter Verwendung eines Lipid-zu-Protein-Verhältnisses zwischen 1: 10 und 1: 100 (w: w) hinzu.
    HINWEIS: Das Verhältnis muss in Abhängigkeit von der Stärke des Signals angepasst werden, das in SSM-elektrophysiologischen Messungen des Substrattransports (siehe unten) detektiert wird. Um größere Signale zu erhalten, verwenden Sie kleinere Lipid-zu-Protein-Verhältnisse.
  10. Inkubieren Sie die Mischung mit 200 U / min für 1 h bei RT.
  11. Fügen Sie 30 mg / ml Polystyrol-Adsorptionsmittelperlen hinzu, die in TS-Puffer vorgewaschen sind.
    HINWEIS: Fügen Sie Polystyrolperlen schrittweise hinzu.
  12. Das Perlen-Lipid-Gemisch für 30 min bei RT unter langsamem Rühren inkubieren.
  13. Um die Perlen zu entfernen, lassen Sie die Perlen-Lipide-Mischung stehen, so dass sich die Perlen absetzen. Übertragen Sie die Lösung in ein neues Röhrchen und lassen Sie die Perlen zurück. 30 mg/ml frische Polystyrol-Adsorptionskügelchen in die abgetrennte Lipidmischung geben.
  14. Die Mischung 1 h bei 4 °C unter langsamem Rühren inkubieren.
  15. Die Perlen werden wie in Schritt 1.13 beschrieben von der Mischung getrennt und 30 mg/ml frische Polystyrol-Adsorptionsperlen zugegeben.
  16. Die Mischung 16 h bei 4 °C inkubieren.
  17. Die Perlen werden wie in Schritt 13 beschrieben von der Mischung getrennt und 30 mg/ml frische Polystyrol-Adsorptionsperlen zugegeben.
  18. Die Mischung für 2 h bei 4 °C für eine vierte und letzte Wäsche inkubieren.
  19. Zentrifuge bei 110.000 x g für 30 min bei 4 °C.
  20. Waschen Sie das Pellet mit 500 μL TS-Puffer, der 2 mM β-Mercaptoethanol enthält.
  21. Zentrifugieren Sie erneut bei 110.000 x g für 30 min bei 4 °C.
  22. Resuspendieren Sie das Pellet auf eine endgültige Lipidkonzentration von 25 mg/ml im TS-Puffer mit 2 mM β-Mercaptoethanol.
  23. Schätzen Sie die Proteinkonzentration mit einem In-Gel- oder Amido-Black-Assay36ab.
  24. Die Proteoliposomen aliquotieren, in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und bei -80 °C lagern.

2. Chip-Vorbereitung

  1. Füllen Sie einen einzelnen Sensorchip mit 50-100 μL 0,5 mM 1-Octadecanthiol-Lösung (resuspendiert in Isopropanol).
  2. Inkubieren Sie den Chip mit der Lösung für 30 min bei RT.
  3. Entfernen Sie die Thiollösung, indem Sie den Chip auf ein Taschentuch klopfen.
  4. Spülen Sie den Sensor 3 mal mit 5 ml reinem Isopropanol ab.
  5. Spülen Sie den Sensor 3 Mal mit 5 ml doppelt destilliertem Wasser ab.
  6. Trocknen Sie den Sensor, indem Sie auf ein Seidenpapier klopfen.
  7. Tragen Sie 1,5 μL 7,5 μg/μL 1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin auf (Lipide, die in einem Rotationsverdampfer getrocknet und in n-Dekan resuspendiert wurden).
  8. Füllen Sie den Sensor unmittelbar danach mit 50 μL nicht aktivierendem SSM-Puffer, der das Substrat nicht enthält. Dies führt zu einer spontanen Bildung der SSM-Schicht.
    HINWEIS: Der SSM-Puffer sollte im Voraus optimiert werden, um optimale Bedingungen mit geringen Hintergrundgeräuschen zu ermitteln. Als Ausgangspunkt kann ein allgemeiner Puffer mit 30 mM HEPES pH 7,4, 5 mMMgCl2,140 mM NaCl verwendet werden. Der SSM-Puffer ohne Substrat wird zum Waschen vor und nach der Messung verwendet (nicht aktivierender Puffer). Um eine Pufferabweichung zu vermeiden, verwenden Sie den nicht aktivierenden Puffer, um den Puffer vorzubereiten, der das Substrat enthält (aktivierender Puffer). Das Substrat kann entweder direkt als Pulver oder in einem kleinen Volumen aus einem hochkonzentrierten Material zugegeben werden, um Verdünnungen zu vermeiden.
  9. Auftauen von Proteoliposomen aus Schritt 1.24 bei RT.
  10. Verdünnen Sie Proteoliposomen zwischen 1:5 und 1:100 (Proteoliposomen:Puffer, (v:v)) im nicht aktivierenden SSM-Puffer (hier 1:20).
  11. Proteoliposomen für 20-30 s oder 3 mal für 10 s beschallen und bei Bedarf zwischen der Beschallung auf Eis legen. Hier kam ein Wasserbad-Ultraschallgerät mit 45 kHz zum Einsatz.
  12. Tragen Sie 5-10 μL der verdünnten beschallten Proteoliposomenprobe auf die Oberfläche des Sensors auf, ohne sie zu berühren.
  13. Zentrifugieren Sie die Chips mit der Lösung bei RT für 30 min mit einer Geschwindigkeit zwischen 2.000 und 3.000 x g.
    HINWEIS: Verwenden Sie 50 ml Rohre mit einem flachen Boden. Legen Sie die Sensorchips vorsichtig mit einer Pinzette aufrecht auf. 6-Well-Platten und eine Zentrifuge mit Plattenhalter können ebenfalls verwendet werden.
  14. Verwenden Sie die Sensorchips am selben Tag.

3. Messung des Transports von gelösten Stoffen: Bestimmung der Sättigungsbedingungen

HINWEIS: Als Proof-of-Principle wurden diese Experimente mit einem bakteriellen Cholintransporter durchgeführt, der in Liposomen nach dem oben beschriebenen Protokoll rekonstituiert wurde. Der schrittweise Prozess der Bestimmung der Sättigungsbedingungen des Substrats Cholin vor der Messung der Hemmung durch Nanobodies wird hier gezeigt.

  1. Bereiten Sie 1-2 L des nicht aktivierenden SSM-Puffers vor.
    HINWEIS: Bereiten Sie für alle aktivierenden und nicht aktivierenden Puffer während aller Messungen denselben SSM-Puffer vor und verwenden Sie ihn.
  2. Nehmen Sie 10 saubere Röhrchen und übertragen Sie 10 ml des nicht aktivierenden SSM-Puffers in jedes.
  3. Das Substrat aus Schritt 3.2 wird unter Verwendung einer Reihe von Konzentrationen um die erwartete halbe Maximalkonzentration (hier 15, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001 mM Cholin) in die Röhrchen gegeben, um die aktivierenden SSM-Puffer herzustellen. Verwenden Sie einen hochkonzentrierten Schaft, um Verdünnungen zu vermeiden.
  4. Schalten Sie den SSM-Computer ein.
  5. Starten Sie die SSM-Software, und lassen Sie den Computer automatisch initialisieren. Legen Sie den Speicherpfad für Daten fest und bestätigen Sie mit einem Klick auf die Schaltfläche OK. Wählen Sie in den Workflow-Optionen das Standardmäßige Initial Cleaning Protocol aus und klicken Sie auf Ausführen.
  6. Montieren Sie den proteoliposomenbeschichteten Chip auf dem Sockel, bewegen Sie den Arm, um den Chip zu verriegeln, und schließen Sie den montierten Chip mit der Kappe.
  7. Wählen Sie das Programm CapCom im Workflow aus und lassen Sie es ausführen, um die Leitfähigkeit und Kapazität zu bestimmen. Vergewissern Sie sich, dass die Leitfähigkeit unter 5 nS liegt und die Kapazität zwischen 15 und 35 nF liegt, bevor Sie sie für die Messung verwenden.
    HINWEIS: Ein Kapazitätswert von 15-35 nF und eine Leitfähigkeit unter 5 nS werden vom Hersteller bei Verwendung eines 3-mm-Chips empfohlen.
  8. Übertragen Sie die aktivierenden Lösungen in Fläschchen und positionieren Sie die Puffer im Probenehmer.
  9. Übertragen Sie den nicht aktivierenden Puffer in ein Reservoir und positionieren Sie ihn neben dem Chiphalter an der Reservoirposition auf der rechten Seite.
  10. Erstellen Sie ein Protokoll für den Workflow mit einer Sequenz von nicht aktivierenden (B), aktivierenden (A) und nicht aktivierenden (B)-Lösungen (B-A-B-Sequenz) und einer Schleife, die drei Messungen durchführt und zum nächsten aktivierenden Puffer für alle 10 in Schritt 3.3 vorbereiteten Puffer wechselt. Verwenden Sie die Standarddurchflussrate bei 200 μL/s unter Verwendung von 1 s - 1 s - 1 s Durchflusszeiten für die B-A-B-Sequenz. Klicken Sie auf Wiedergabe, um die Messung zu starten.
    HINWEIS: Ein typisches Experiment besteht aus dem sequentiellen Fluss von nicht aktivierenden (B), aktivierenden (A) und nicht aktivierenden (B) Lösungen (geschrieben als B-A-B; siehe Abbildung 1A). Die immobilisierten Proteoliposomen auf dem Sensor werden mit den Lösungen gewaschen. Daher erzeugt der B-A-Lösungsaustausch einen Substratkonzentrationsgradienten, der die elektrogene Transportreaktion antreibt.
  11. Speichern Sie das Protokoll und lassen Sie den Workflow laufen, indem Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe klicken. Führen Sie die gleiche Art von Experiment durch, jedoch mit proteinfreien Liposomen. Dies ist sehr wichtig, da es die Intensität der Hintergrundströme zeigen würde. Dies sollte bei der Analyse von Daten des elektrogenen Transports, die mit Proteoliposomen gemessen wurden, berücksichtigt werden (Abbildung 1C).
  12. Verwenden Sie eine beliebige Software für die Datenanalyse, um den gemessenen Strom im Vergleich zur Zeit darzustellen. Lesen Sie den Spitzenstrom manuell aus, oder wenn Sie die Software verwenden, verwenden Sie die Funktion zur Spitzenhöhenschätzung im Bereich der Hinzufügung des aktivierenden Puffers.
  13. Zeichnen Sie den Spitzenstrom gegen die Substratkonzentration auf, um den EC50 des Substrats über die nichtlineare Regression zu bestimmen (Abbildung 1B, C). Auslesen der niedrigsten Konzentration, bei der der Spitzenstrom einen Maximalwert erreicht, entspricht diese Konzentration den Sättigungsbedingungen.
    HINWEIS: Es ist wichtig zu bedenken, dass die Anzahl der Proteoliposomen, die immobilisiert bleiben, von Chip zu Chip variiert. Diese Variation ist offensichtlich, da die Spitzenströme bei identischen Messbedingungen unterschiedliche Amplituden aufweisen. Daher ist es notwendig, die Stromamplituden der auf jedem Chip durchgeführten Messungen separat zu normalisieren, bevor Messungen zwischen verschiedenen Chippräparationen verglichen werden.

4. Serielle Klassifikation von inhibitorischen und nicht-inhibitorischen Nanobodies

HINWEIS: Dieser Abschnitt zeigt, wie der Cholintransport in Gegenwart von Nanobodies gemessen wird, die spezifisch an den bakteriellen Cholintransporter binden. Kleinere Spitzenströme in Gegenwart von Nanobodies deuten auf eine Transporthemmung hin. Nicht-inhibitorische Nanobodies haben keinen Einfluss auf den Substrattransport, d.h. keine Abnahme des Spitzenstromsignals.

  1. Bereiten Sie 1-2 L nicht aktivierenden SSM-Puffer vor.
  2. 50 ml des nicht aktivierenden SSM-Puffers in ein sauberes Rohr geben. Geben Sie das Substrat Cholin auf eine Endkonzentration von 5 mM (Sättigungsbedingungen). Verwenden Sie dies für eine positive Kontrollmessung.
  3. Übertragen Sie 10 ml des nicht aktivierenden SSM-Puffers in ein sauberes Rohr. Geben Sie das Substrat Cholin auf eine Endkonzentration von 5 mM (Sättigungsbedingungen) und fügen Sie Nanobody zu einer Endgültigen Konzentration von 500 nM hinzu.
  4. Wiederholen Sie Schritt 4.3 für jeden Nanobody, um die aktivierenden Lösungen vorzubereiten.
    HINWEIS: Wenn die gereinigten Nanobodies in einem anderen Puffer als dem SSM-Puffer resuspendiert werden, führt ihre Zugabe zu den aktivierenden und nicht aktivierenden Puffern zu einer Pufferabweichung. Ein Pufferkonflikt sollte vermieden werden, da er zu hohem Rauschen führen kann. Der Austausch des Puffers der gereinigten Nanobodies mit dem SSM-Puffer kann helfen, dieses Problem zu vermeiden. Darüber hinaus wird die Verwendung von Nanobody-Konzentrationen empfohlen, die es ermöglichen, Sättigungsbedingungen zu erreichen. In Anbetracht der Tatsache, dass die Bindungskonstanten von Nanobodies im Allgemeinen unter 100 nM liegen, wird für dieses Experiment eine Nanobody-Konzentration von 500 nM empfohlen. Es ist jedoch wichtig, vorausschauend auf optimale Konzentrationen zu achten.
  5. Starten Sie die SSM-Maschine und messen Sie die Kapazität und Leitfähigkeit des proteoliposomenbeschichteten Chips wie in den Schritten 3.4-3.7 beschrieben.
  6. Übertragen Sie die aktivierende Lösung ohne Nanobody in eine Durchstechflasche und legen Sie den Puffer in den Probenehmer. Übertragen Sie den nicht aktivierenden Puffer ohne Nanobody in ein Reservoir und positionieren Sie ihn im Probenehmer.
  7. Die aktivierenden Lösungen, die Nanobodies enthalten, in Fläschchen überführen und die Puffer im Probenehmer positionieren. Übertragen Sie die nicht aktivierenden Puffer, die Nanobodies enthalten, in Fläschchen und positionieren Sie die Puffer im Probenehmer.
  8. Erstellen Sie ein Protokoll für den Workflow mit einer Sequenz von nicht aktivierenden (B), aktivierenden (A) und nicht aktivierenden (B)-Lösungen (B-A-B-Sequenz).
  9. Erstellen Sie eine Schleife, die Folgendes durchführt: drei Messungen der B-A-B-Sequenz mit Puffern ohne Nanobody, zwei Messungen der B-A-B-Sequenz mit Puffern, die einen Nanobody enthalten, 120 s Verzögerungszeit für die Inkubation mit dem Nanobody, dann 3 Messungen der B-A-B-Sequenz mit Puffern, die den Nanobody enthalten.
  10. Speichern Sie den Workflow und lassen Sie ihn ausführen, indem Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe klicken.
    HINWEIS: Dieser Workflow misst die Anfangsbedingungen des Transports ohne Hemmung, indem das B-A-B-Protokoll 3 Mal mit nicht aktivierenden (B) und aktivierenden Puffern (A) ohne den Nanobody(Abbildung 1B,C) ausgeführtwird,gefolgt von der Messung des Nanobody-Effekts auf den Transport, indem das B-A-B-Protokoll 5 Mal mit den nicht aktivierenden und aktivierenden Puffern, die Nanobodies enthalten (Abbildung 2A ). Die Bindungskinetik zweiter Ordnung diktiert die Interaktion von Nanobodies und ihren Zielproteinen. Daher ist es wichtig, eine Zeitverzögerung im B-A-Schritt zu verwenden, um Nanobodies genügend Zeit zu geben, sich an Transporter in Proteoliposomen auf dem Chip zu binden. Optimale Zeiten hängen von der Nanobody-Konzentration ab, d.h. bei niedrigeren Konzentrationen sind längere Zeiten erforderlich. Die ersten beiden Messungen sind erforderlich, um das System an die neuen Bedingungen anzupassen und der zweite Durchlauf sollte nach einer Verzögerungszeit von 120 s durchgeführt werden. Nur die folgenden drei Messungen sollten für die Datenanalyse verwendet werden.
  11. Erstellen Sie ein neues Protokoll für den Workflow mit einer Sequenz von nicht aktivierenden (B), aktivierenden (A) und nicht aktivierenden (B)-Lösungen (B-A-B-Sequenz) und einer Schleife von 5 Messungen, um den reversibel gebundenen Nanobody auszuwaschen.
    HINWEIS: Optional ist ein Inkubationsschritt enthalten, um die Dissoziation von Nanobodies mit langsamer Kinetik zu ermöglichen.
  12. Speichern Sie den Workflow und lassen Sie ihn ausführen, indem Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe klicken.
  13. Vergleichen Sie den letzten Spitzenstrom der Messungen mit der anfänglichen Substratmessung in Schritt 4.10. Der Nanobody wurde erfolgreich ausgewaschen und die Anfangsbedingungen wurden wiederhergestellt, wenn der Spitzenstrom den Anfangswert erreicht, andernfalls wiederholen Sie die Schritte 4.12-4.13 oder wechseln Sie zu einem neuen Chip.
  14. Wiederholen Sie die Schritte 4.6-4.13 und verwenden Sie einzelne Chips für jeden Nanobody-Bildschirm (Abbildung 2C) oder wiederholen Sie ihn mit mehreren Nanobodies unter Verwendung desselben Chips (Abbildung 2D).
  15. Verwenden Sie eine beliebige Software für die Datenanalyse, um den gemessenen Strom im Vergleich zur Zeit darzustellen. Lesen Sie den Spitzenstrom manuell aus oder, falls vorhanden, in der verwendeten Software wählen Sie automatisch die Funktion zur Spitzenhöhenschätzung im Bereich der Zugabe des Aktivierungspuffers aus.
  16. Normalisieren Sie den Spitzenstrom in Gegenwart des Nanokörpers, basierend auf der vorhergehenden Substratmessung. Zeichnen Sie die Spitzenströme in einem Histogramm auf und vergleichen Sie die Spitzenströme der reinen Substratmessungen mit den Spitzenströmen, die in Gegenwart von Nanobodies gemessen werden (Abbildung 2C,D), um inhibitorische Nanobodies zu identifizieren.
    HINWEIS: Die Normalisierung der ermittelten Spitzenströme jedes einzelnen Laufs mit einem Nanobody sollte unter Berücksichtigung des Spitzenstroms in Abwesenheit des Nanobodys aus der vorhergehenden Messung durchgeführt werden. Da die Anzahl der Proteoliposomen, die immobilisiert bleiben, von Chip zu Chip variiert, ist es wichtig, die aktuellen Amplituden der auf jedem Chip separat durchgeführten Messungen zu normalisieren, bevor Messungen zwischen verschiedenen Chippräparationen verglichen werden.

5. IC50 Messung mit inhibitorischen Nanobodies

HINWEIS: Nach der Identifizierung von inhibitorischen Nanobodies ist es möglich, ihre halbe maximale inhibitorische Konzentration (IC50)zu bestimmen. Dies geschieht durch messung des Transports von Cholin in konstanter Konzentration, während die Konzentrationen des inhibitorischen Nanokörpers variieren.

  1. Bereiten Sie 1-2 L des nicht aktivierenden SSM-Puffers vor.
  2. 50 ml des nicht aktivierenden SSM-Puffers in ein sauberes Rohr geben. Geben Sie das Substrat Cholin auf eine Endkonzentration von 5 mM (Sättigungsbedingungen). Verwenden Sie dies als aktivierende Lösung für die Positivkontrolle.
  3. Nehmen Sie 8 saubere Röhrchen und geben Sie jeweils 5 ml der nicht aktivierenden Lösung hinzu. Geben Sie das Substrat Cholin auf eine Endkonzentration von 5 mM (Sättigungsbedingungen). Den inhibitorischen Nanobody in Konzentrationen im erwarteten IC50-Bereich (hier 500 nM - 1 nM) in die Röhrchen geben.
  4. Nehmen Sie 8 saubere Röhrchen und fügen Sie jeweils 10 ml der nicht aktivierenden Lösung hinzu. Jedem Röhrchen einzeln inhibitorische Nanobody in der gleichen Konzentration wie in Schritt 5.3 zuführen. Dies entspricht dem nicht aktivierenden Puffer.
    HINWEIS: Dadurch wird eine Reihe von aktivierenden und nicht aktivierenden Pufferpaaren in unterschiedlichen Konzentrationen desselben inhibitorischen Nanokörpers erzeugt.
  5. Starten Sie den SSM-Aufbau und messen Sie die Kapazität und Leitfähigkeit des proteoliposomenbeschichteten Chips wie in den Schritten 3.4-3.7 beschrieben.
  6. Die aktivierende Lösung ohne Nanobody in eine Durchstechflasche überführen und in den Probenehmer geben. Übertragen Sie den nicht aktivierenden Puffer ohne Nanobody in ein Reservoir und positionieren Sie ihn an der Reservoirposition neben dem Chiphalter auf der rechten Seite.
  7. Die aktivierenden Lösungen, die Nanobodies enthalten, in Fläschchen überführen und die Puffer im Probenehmer positionieren. Übertragen Sie die nicht aktivierenden Puffer, die Nanobodies enthalten, in Fläschchen und positionieren Sie die Puffer im Probenehmer.
  8. Erstellen Sie ein Protokoll für den Workflow mit einer Sequenz von nicht aktivierenden (B), aktivierenden (A) und nicht aktivierenden (B)-Lösungen (B-A-B-Sequenz). Fügen Sie eine Schleife hinzu, um jede Konzentration 2 Mal zu messen, für 120 s zu inkubieren und 3 weitere Male zu messen. Der Arbeitsablauf beginnt mit der Positivkontrolle des Substrats, gefolgt von der niedrigsten Konzentration des Nanobodys. Auf jede Nanobody-Messung folgt eine anschließende Messung der Positivkontrolle mit nur Substrat, um die anfängliche Spitzenamplitude wiederherzustellen, bevor zur nächsthöheren Nanobody-Konzentration übergegangen wird.
    HINWEIS: Die Kinetik zweiter Ordnung bestimmt die Bindung von Nanobodies. Daher ist es wichtig, eine Zeitverzögerung im B-A-Schritt zu verwenden. Optimale Zeiten hängen von der Nanobody-Konzentration ab, d.h. bei niedrigeren Konzentrationen sind längere Zeiten erforderlich; hier wurde 120 s mit zufriedenstellenden Ergebnissen verwendet.
  9. Verwenden Sie eine beliebige Software für die Datenanalyse, um den gemessenen Strom im Vergleich zur Zeit darzustellen. Lesen Sie den Spitzenstrom manuell aus, oder wählen Sie bei Verwendung einer Software die Funktion für die Spitzenhöhenschätzung im Bereich der Addition des Aktivierungspuffers aus (Abbildung 3A). Zeichnen Sie die Spitzenströme gegen die Nanobody-Konzentration auf, um den IC50 mittels nichtlinearer Regression zu bestimmen (Abbildung 3B).
    HINWEIS: Normalisieren Sie die aktuellen Amplituden der für jeden einzelnen Chip durchgeführten Messungen, bevor Sie Messungen zwischen verschiedenen Chipvorbereitungen vergleichen.

6. Reinigung der Sensoren

  1. Spülen Sie die Einzelsensorchips nach Gebrauch mit 10 ml destilliertem Wasser ab.
  2. Trocknen Sie den Chip, indem Sie ihn auf ein Seidenpapier klopfen.
  3. Füllen Sie den Sensorhohlraum des Chips mit 100 μL reinem Isopropanol und inkubieren Sie für 10 min bei RT.
  4. Legen Sie ein Wattestäbchen in reines Isopropanol und inkubieren Sie es für 1-3 min.
  5. Verwenden Sie die vorgesalzenen Wattestäbchen und drehen Sie sie vorsichtig ohne Druck auf der Oberfläche des Sensors, um Rückstände zu entfernen.
  6. Spülen Sie den Sensor mit 5 ml reinem Isopropanol ab.
  7. Spülen Sie den Sensor mit 10 ml destilliertem Wasser ab.
  8. Trocknen Sie den Sensor, indem Sie mit dem Chip auf ein Taschentuch klopfen.
  9. Lassen Sie den Sensor über Nacht bei RT trocknen und lagern Sie ihn bei RT unter trockenen Bedingungen.
    HINWEIS: Sensoren können bis zu 4-5 Mal wiederverwendet werden, wenn sie ordnungsgemäß gereinigt und gelagert werden.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die SSM-basierte Elektrophysiologie wurde in großem Umfang zur Charakterisierung von elektrogenen Transportern eingesetzt. In dem hier vorgestellten Protokoll zeigen wir, wie nanobodies, die auf einen sekundären Transporter (hier ein bakterieller Cholin-Symporter) abzielen, anhand ihrer inhibitorischen und nicht-inhibitorischen Eigenschaften mit SSM-basierter Elektrophysiologie klassifiziert werden können. Eine der nützlichsten Eigenschaften dieser Technik ist, dass sie das Hochdurchsatz-Screening mehrerer Pufferbedingun...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die hier vorgestellte Technik klassifiziert Nanobodies mit inhibitorischen und nicht-inhibitorischen Eigenschaften, die auf elektrogene Transporter abzielen. Die Beurteilung des Substrattransports ist aufgrund der Detektion der Ladungsbewegung durch den in die Membran von Proteoliposomen eingebetteten Transporter möglich. Einige der kritischen Schritte während des Aufbaus eines Experiments sind die Rekonstitution von aktivem Protein in Liposomen, die Herstellung stabiler Monoschichten auf SSM-Chips und die Wiederherstell...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Cedric A. J. Hutter und Markus A. Seeger vom Institut für Medizinische Mikrobiologie der Universität Zürich sowie Gonzalo Cebrero vom Biozentrum der Universität Basel für die Zusammenarbeit bei der Erzeugung synthetischer Nanobodies (Sybodies). Wir danken Maria Barthmes und Andre Bazzone von NANION Technologies für die technische Unterstützung. Unterstützt wurde diese Arbeit vom Schweizerischen Nationalfonds (SNF) (PP00P3_170607 und NANION Research Grant Initiative to C.P.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
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1-Octadecanthiol-LösungSigma AldrichO1858-25ML
1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholinAvanti Polare Lipide850356C-25mg
Bio-Beads SM-2 Adsorptionsmittel (Polystyrol-Adsorptionskügelchen)BioRad#152-3920
PD 10 EntsalzungssäulenGE HealthcareGE17-0851-01
Filter 200 nm MembranWhatman NucleoporeWHA800282
2-PropanolMerck33539-1L-R
n-DecanSigma Aldrich8034051000
n-Dodecyl-ß-D-Maltosid (DDM)Avanti Polare Lipide850520P-25g
NatriumchloridAppliChem131659.1211
(SSM-Aufbau) SURFE2R N1Nanion-----
SURFE2R N1 Single Sensor ChipsNanion# 161001
Trizma BaseSigma AldrichT1503
E. coli Polar Lipid ExtraktAvanti Polar Lipids100600C
Ei PC L-α-phosphatidylcholin Avanti Polar Lipids840051C

Referenzen

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Transporter InhibitionSSM Elektrophysiologieelektrogene TransporterNanobody ScreeningProteoliposomen AssayMembranprotein InhibitionTransportkinetikIC50 Bestimmung

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