Artículo de método

Selección de nanocuerpos inhibitorios dirigidos al transportador mediante electrofisiología basada en membrana sólida soportada (SSM)

DOI:

10.3791/62578

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3 de mayo de 2021

 , 
1Biozentrum, University of Basel

En este artículo

Resumen

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Los nanocuerpos son herramientas importantes en biología estructural y suponen un gran potencial para el desarrollo de terapias. Sin embargo, la selección de nanocuerpos con propiedades inhibitorias puede ser un desafío. Aquí demostramos el uso de electrofisiología basada en membranas sólidas soportadas (SSM) para la clasificación de nanocuerpos inhibitorios y no inhibitorios dirigidos a transportadores de membrana electrogénicos.

Resumen

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Los anticuerpos de dominio único (nanocuerpos) se han utilizado ampliamente en estudios mecanicistas y estructurales de proteínas y representan un enorme potencial como herramientas para desarrollar terapias clínicas, muchas de las cuales dependen de la inhibición de proteínas de membrana como los transportadores. Sin embargo, la mayoría de los métodos utilizados para determinar la inhibición de la actividad de transporte son difíciles de realizar en rutinas de alto rendimiento y dependen de la disponibilidad de sustratos etiquetados, lo que complica el cribado de grandes bibliotecas de nanocuerpos. La electrofisiología de membrana sólidamente soportada (SSM) es un método de alto rendimiento, utilizado para caracterizar transportadores electrogénicos y medir su cinética e inhibición de transporte. Aquí mostramos la implementación de la electrofisiología basada en SSM para seleccionar nanocuerpos inhibitorios y no inhibitorios dirigidos a un transportador secundario electrogénico y para calcular constantes inhibitorias de nanocuerpos. Esta técnica puede ser especialmente útil para seleccionar nanocuerpos inhibitorios dirigidos a transportadores para los que no se dispone de sustratos marcados.

Introducción

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Los anticuerpos están compuestos por dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras que son responsables de la unión del antígeno. Los camélidos tienen anticuerpos de cadena pesada que exhiben una afinidad similar por su antígeno cognado en comparación con los anticuerpos convencionales1,2. El dominio variable único (VHH) de los anticuerpos de cadena pesada solo conserva el potencial completo de unión al antígeno y se ha demostrado que es muy estable1,2. Estas moléculas aisladas de VHH o "nanocuerpos" se han implementado en estudios relacionados c....

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Protocolo

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1. Reconstitución de proteínas de membrana

  1. Mezcle 3 ml de lípidos polares de E. coli con 1 ml de fosfatidilcolina en un matraz de fondo redondo debajo de una capucha ventilada.
  2. Seque la mezcla de lípidos durante 20 minutos al vacío utilizando un evaporador rotativo y un baño de agua a 37 °C para eliminar el cloroformo. Si es necesario, seque aún más bajo nitrógeno o gas argón.
  3. Utilizando tampón TS (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) que contiene 2 mM β-mercaptoetanol, resuspend lípidos a 25 mg/mL.
  4. Lípidos alícuotas en alícuotas de 500 μL, congelación instantánea en nitrógeno líquido y almacenamiento a -80 °C.

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Resultados

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La electrofisiología basada en SSM se ha utilizado ampliamente para la caracterización de transportadores electrogénicos. En el protocolo presentado aquí, mostramos cómo utilizar la electrofisiología basada en SSM para clasificar los nanocuerpos dirigidos a un transportador secundario (aquí un simportador de colina bacteriana) en función de sus propiedades inhibitorias y no inhibitorias. Una de las características más útiles de esta técnica es que permite el cribado de alto rendimiento de múltiples condiciones de búfer. .......

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Discusión

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La técnica presentada aquí clasifica los nanocuerpos con propiedades inhibitorias y no inhibitorias dirigidas a los transportadores electrogénicos. La evaluación del transporte del sustrato es posible debido a la detección del movimiento de cargas a través del transportador incrustado en la membrana de los proteoliposomas. Algunos de los pasos críticos durante la configuración de un experimento son la reconstitución de proteínas activas en liposomas, la preparación de monocapas estables en chips SSM y la recuperación de .......

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Divulgaciones

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Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Agradecemos a Cedric A. J. Hutter y Markus A. Seeger del Instituto de Microbiología Médica de la Universidad de Zurich, y a Gonzalo Cebrero de Biozentrum de la Universidad de Basilea por su colaboración en la generación de nanocuerpos sintéticos (sybodies). Agradecemos a Maria Barthmes y Andre Bazzone de NANION Technologies por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (SNSF) (PP00P3_170607 y NANION Research Grant Initiative a C.P.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de 1-octadecanetiolSigma AldrichO1858-25ML
1,2-difitanoyl-sn-glicero-3-fosfocolinaAvanti Lípidos polares850356C-25mg
Bio-Beads SM-2 Adsorbente (perlas adsorbentes de poliestireno)BioRad#152-3920
PD 10 Columnas de desalinizaciónGE HealthcareGE17-0851-01
Filtro Membrana de 200 nmWhatman NucleoporeWHA800282
2-PropanolMerck33539-1L-R
n-DecaneSigma Aldrich8034051000
n-dodecilo-ß-D-maltósido (DDM)Avanti Polar Lipids850520P-25g
Cloruro de sodioAppliChem131659.1211
(configuración SSM) SURFE2R N1Nanion-----
SURFE2R N1 Chips de sensor únicoNanion# 161001
Trizma BaseSigma AldrichT1503
E. coli Extracto de LípidosPolares Avanti Lípidos Polares100600C
Huevo PC L-&alfa;-fosfatidilcolina Avanti Lípidos Polares840051C

Referencias

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  1. Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
  2. Hamers-Casterman, C., et al.

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