Quantifizierung der linksventrikulären Funktion des Mausherzens, des Myokardstamms und der hämodynamischen Kräfte durch kardiovaskuläre Magnetresonanztomographie

Summary

Diese Studie beschreibt ein umfassendes kardiovaskuläres Magnetresonanztomographie-Protokoll (CMR) zur Quantifizierung der linksventrikulären Funktionsparameter des Mausherzens. Das Protokoll beschreibt die Erfassung, Nachbearbeitung und Analyse der CMR-Bilder sowie die Beurteilung verschiedener kardialer Funktionsparameter.

Abstract

Mausmodelle haben wesentlich zum Verständnis genetischer und physiologischer Faktoren beigetragen, die an einer gesunden Herzfunktion beteiligt sind, wie Störungen zu Pathologie führen und wie Myokarderkrankungen behandelt werden können. Die kardiovaskuläre Magnetresonanztomographie (CMR) ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug für eine umfassende In-vivo-Beurteilung der Herzanatomie und -funktion geworden. Dieses Protokoll zeigt detaillierte Messungen der linksventrikulären Funktion des Mausherzens, der Myokarddehnung und der hämodynamischen Kräfte unter Verwendung der 7-Tesla-CMR. Zunächst wird die Tiervorbereitung und -positionierung im Scanner demonstriert. Survey-Scans werden für die Planung von Imaging-Slices in verschiedenen Kurz- und Langachsenansichten durchgeführt. Eine Reihe von prospektiven EKG-ausgelösten Kurzachsenfilmen (SA) (oder CINE-Bildern) wird aufgenommen, die das Herz von der Spitze bis zur Basis abdecken und endsystolische und enddiastolische Phasen erfassen. Anschließend werden einzeln geschnittene, retrospektiv gated CINE-Bilder in einer midventrikulären SA-Ansicht und in 2-, 3- und 4-Kammer-Ansichten aufgenommen, um mit einer speziell angefertigten Open-Source-Software in CINE-Bilder mit hoher zeitlicher Auflösung rekonstruiert zu werden. CINE-Bilder werden anschließend mit einer speziellen CMR-Bildanalysesoftware analysiert.

Die Abgrenzung endomyokardialer und epikardiatter Grenzen in SA-endsystolischen und enddiastolischen CINE-Bildern ermöglicht die Berechnung des endsystolischen und enddiastolischen Volumens, der Ejektionsfraktion und des Herzzeitvolumens. Die mittelventrikulären SA CINE-Bilder werden für alle kardialen Zeitrahmen abgegrenzt, um eine detaillierte Volumen-Zeit-Kurve zu extrahieren. Seine Zeitableitung ermöglicht die Berechnung der diastolischen Funktion als Verhältnis der frühen Füll- und Vorhofkontraktionswellen. Schließlich werden linksventrikuläre Endokardwände in den 2-, 3- und 4-Kammer-Ansichten mittels Feature-Tracking abgegrenzt, aus dem längsschnittliche myokardiale Dehnungsparameter und linksventrikuläre hämodynamische Kräfte berechnet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine detaillierte In-vivo-Quantifizierung der Herzparameter der Maus bietet, mit der zeitliche Veränderungen der Herzfunktion in verschiedenen Mausmodellen für Herzerkrankungen untersucht werden können.

Introduction

Die kardiovaskuläre Magnetresonanz (CMR) bei Kleintieren bietet eine genaue In-vivo-Messung der Myokardfunktion, was die CMR zu einem optimalen Werkzeug für die präklinische Forschung bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen macht. Aufgrund der hohen räumlichen Auflösung und des hohen Kontrasts zwischen Blut und Myokard in CMR-Bildern ist es möglich, die endo- und epikardialen Konturen abzugrenzen und die Myokardmasse und das ventrikuläre^{Volumen 1,2}zu berechnen. Trotz der hohen Herzfrequenzen von bis zu 600 Schlägen/min ermöglicht der Einsatz von Elektrokardiogramm (EKG) und respiratorischer Triggerung qualitativ hochwertige Messungen verschiedener Herzphasen (auch CINE-Bilder genannt) ohne Respiratory Motion Artifacts. Auf diese Weise können mehrere Schichten verwendet werden, um das Herz von der Spitze bis zur Basis abzudecken, um systolische Funktionsparameter wie Ejektionsfraktion (EF), endsystolisches Volumen (ESV), enddiastolisches Volumen (EDV) und Herzzeitvolumen (CO) zu extrahieren³. Neben der grundlegenden systolischen Funktionsbewertung wurden kürzlich zusätzliche CMR-Techniken entwickelt, um die diastolische Dysfunktion^4,den Myokardstamm⁵und die hämodynamischen Kräfte (HDF)⁶zu beurteilen.

Das EKG-Gating ermöglicht die Synchronisation mit dem Herzzyklus, indem die MR-Signalerfassung nach Erkennung des R-Peaks gestartet und eine definierte Anzahl von Herzphasen während des R-R-Intervalls aufgezeichnet wird. Die Anzahl der Herzphasen (Bildrate), die auf diese Weise erfasst werden können, hängt jedoch von der niedrigstmöglichen Wiederholungszeit (TR) ab, die das System unter Beibehaltung eines akzeptablen Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) und einer räumlichen Auflösung erreichen kann⁴. Da die Verwendung hoher Magnetfeldgradienten das EKG-Signal vorübergehend verzerren kann, wird die Erfassung in der Regel vor der enddiastolischen Phase gestoppt. Beide Faktoren beschränken die Verwendung solcher Scans auf systolische Funktionsbewertungen, da die Berechnung anderer kardialer Funktionsparameter eine bessere Definition der linksventrikulären (LV) Volumen-Zeit-Kurve erfordert.

CINE-Bilder mit hoher Bildrate können durch retrospektives Gating aufgenommen werden, wobei das MR-Signal während des Scannens kontinuierlich erfasst wird und ein integriertes Navigator-Echo nach hochfrequenter (RF) Anregung Herz- und Atmungsbewegungen erkennt. Da die CMR-Erfassung asynchron mit der Herzbewegung erfolgt, können die erfassten MR-Signale dann einer retrospektiv gewählten Anzahl von Herzbildern zugeordnet werden. Auf diese Weise können bei ausreichender Datenerfassung CINE-Bilder mit hoher Bildrate rekonstruiert werden^4,7. Dies ermöglicht dann eine diastolische Funktionsbewertung, dargestellt durch das Verhältnis zwischen der spitzen frühen Füllrate (E') und der maximalen späten Füllrate aus der Vorhofkontraktion (A').

In der klinischen Forschung können CINE-Bilder mit CMR-Feature-Tracking analysiert werden, um den Myokardstamm und HDF^6,8zu beurteilen. Myokarddehnung ist ein kardialer Deformationsparameter, der den Prozentunterschied zwischen der Anfangslänge (normalerweise in enddiastolischer Länge) und der maximalen Länge (normalerweise in Endsystolie) eines Myokardsegments^{misst 9}. Myokarddehnungsmessungen können für die Beurteilung der LV-Funktion von inkrementellem Wert sein, da Dehnungswerte die Verkürzung und Verdickung der Myokardwand quantifizieren. Eine Verringerung der Verkürzungsfunktion könnte ein Hinweis auf eine subendokardiale Faserschädigung sein¹⁰. Veränderungen im Myokardstamm können unabhängig von EF auftreten und könnten eine Vorstufe für zugrunde liegende Komplikationen sein.

Insbesondere der globale Längsschnittstamm (GLS) und der globale Umfangsstamm (GCS) haben sich als von Mehrwert bei der Charakterisierung von Herzerkrankungen^{erwiesen 10,11,12}. In ähnlicher Weise wurde HDF als ein potenzieller neuer Parameter vorgeschlagen, um auf eine veränderte Herzfunktion hinzuweisen^6,13. Diese HDF- oder interventrikulären Druckgradienten (IVPG) treiben die Blutbewegung während des Auswurfs und der Füllung des Herzens an und werden durch den Impulsaustausch zwischen Blut und Myokard, einschließlich der Aorten- und Mitralklappe,^{beeinflusst 14,15}.

In dieser Studie wird ein umfassendes Protokoll zur Durchführung robuster CMR-Messungen von Kleintieren beschrieben, um die LV-Funktion, den Myokardstamm und die HDF von Mausherzen zu quantifizieren. Es enthält die notwendigen Schritte für die Tierpräparation, die Datenerfassung unter Verwendung prospektiver und retrospektiver CINE-Bilder des Herzens sowie die Analyse mit einer speziellen Software, die in der Lage ist, die volumetrischen Messungen, das E/A-Verhältnis, die Myokardbelastung und die HDF des Herzens zu berechnen. Dieses Protokoll kann für die umfassende Beurteilung der LV-Funktion in verschiedenen Mausmodellen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen verwendet werden.

Protocol

Die beschriebenen Tierversuche werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Europäischen Union zum Schutz von Versuchstieren (Richtlinie 2010/63/EU) durchgeführt und wurden von der Tierethikkommission des Akademischen Medizinischen Zentrums genehmigt.

1. Aufbau und Tiervorbereitung

1. Stellen Sie vor Beginn des Experiments sicher, dass mindestens 2 h lang genügend Isoflurananästhesie vorhanden ist und dass die für EKG und Atemüberwachung verfügbare Batterie ausreichend geladen ist. Stellen Sie sicher, dass der Scannerbereich mit einem funktionierenden Rauchabsaugrohr ausgestattet ist, um überschüssiges Isofluran zu entfernen.
2. Bereiten Sie die Maushalterung vor (Abbildung 1A), und schalten Sie die Tierheizung mit einer auf 40 °C eingestellten Temperatur ein. Bereiten Sie das EKG/Respiratory Interface-Modul und den Batterieaufbau vor (Abbildung 1B), und starten Sie die Software zur Echtzeitüberwachung von EKG- und Atemwegssignalen (Abbildung 1C).
3. Entfernen Sie die Maus aus ihrem Gehäusekäfig und messen Sie das Körpergewicht.
4. Legen Sie die Maus in eine Anästhesie-Induktionskammer unter einem Abzugsarm und geben Sie 3-4% Isofluran in einer Mischung von 0,2 l / min O₂ und 0,2 l / min medizinischer Luft. Nachdem das Tier vollständig betäubt ist, tragen Sie einen kleinen Tropfen Augensalbe auf jedes Auge auf und schließen Sie die Augenlider der Maus.
5. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf die Mauswiege. Haken Sie die Schneidezähne der Maus in die Bissstange der Maushalterung ein, und passen Sie den Nasenkegel an, damit er richtig passt (Abbildung 1A). Überprüfen Sie visuell, ob die Atmung unter 100 Atemzügen / min stabil ist, und reduzieren Sie das Isofluran während der Tiervorbereitung auf ~ 2%.
6. Bewegen Sie die Maushalterung so, dass sich das Herz in dem Teil des Cradle-Halters befindet, der in der Mitte der HF-Spule und im Iso-Zentrum des Magneten endet.
7. Verwenden Sie Vaseline, um den rektalen Temperaturfühler einzusetzen, und kleben Sie das Glasfaserkabel des Temperaturfühlers an die Maushalterung.
8. Legen Sie den Atemballon auf den Unterbauch der Maus und sichern Sie ihn mit Klebeband. Führen Sie zwei EKG-Elektrodennadeln subkutan in den Brustkorb auf Höhe der Vorderpfoten ein und kleben Sie sie vorsichtig ab, um Bewegungen zu verhindern (Abbildung 1A).
9. Prüfen Sie, ob Atmungs- und EKG-Signale von ausreichender Qualität sind und ob die Software korrekte Triggerpunkte erkennt (Abbildung 1C).
   1. Stellen Sie sicher, dass die Atemfrequenz 50-80 Atemzüge / min, die Herzfrequenz ~ 400-600 Schläge / min und die Körpertemperatur um 37 ° C beträgt. Stellen Sie die Isoflurangabe ein, wenn die Atemfrequenz außerhalb dieses Bereichs liegt, und senken Sie die Temperatur des tierischen Heizsystems, wenn die Körpertemperatur tendenziell 37 °C überschreitet.
10. Legen Sie die HF-Spule über die Maus.
    HINWEIS: Je nach System kann dies ein vorübergehendes Trennen der EKG-Elektroden und der Atemballonstecker vom EKG-/Beatmungsschnittstellenmodul erfordern.
11. Schließen Sie die Spulenkabel an und legen Sie die Halterung in die Magnetbohrung. Prüfen Sie, ob das EKG-Signal noch stabil ist.
    1. Wenn das EKG-Signal suboptimal ist, positionieren Sie die EKG-Elektroden für ein besseres Signal neu, da dies zu einem späteren Zeitpunkt nicht möglich ist, ohne die Orientierung des Tieres signifikant zu verändern.

Abbildung 1: Tierpräparation und Ausrüstungseinrichtung für die CMR-Bildgebung des Mausherzens. (A) Vollständig betäubte Maus in Rückenlage, platziert in der beheizten Mauswiege mit einem pneumatischen Atemkissen auf dem Bauch, einem rektalen faseroptischen Temperatursensor und subkutanen EKG-Leitungen in der Brust in der Nähe der Vorderpfoten. (B) Mauskörperspule über der Maushalterung platziert, wobei EKG-Leitungen und Atemkissen wieder mit dem EKG und der Atemschnittstelle verbunden sind, bevor der Halter in den MRT-Magneten gelegt wird. (C) Darstellung des EKGs und der Atemsignale in einer speziellen Kleintierüberwachungssoftware. Der R-Peak des EKG-Signals wird erkannt und als Ausgangspunkt für die MRT-Signalerfassung verwendet. Eine Ausblendungsperiode zwischen R-Peaks kann basierend auf der Periode eines Herzschlags manuell angepasst werden. Die Auslösung kann nur während des Atemplateaus (grüne Linie im mittleren Feld) erfolgen, für das die Anfangsverzögerung und die maximale Breite manuell eingestellt werden können. Abkürzungen: CMR = kardiovaskuläre Magnetresonanztomographie; EKG = Elektrokardiogramm; MRT = Magnetresonanztomographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. MRT-Scan-Kalibrierung und Triggerung

1. Passen Sie die EKG- und Atmungsgitterparameter innerhalb der Signalüberwachungssoftware so an, dass Triggerpunkte an den R-Peaks und nur während des flachen Teils des Atmungssignals erzeugt werden. Um EKG-Gating-Fehler zu minimieren, legen Sie einen Leerungszeitraum fest, der 10-15 ms kürzer ist als das R-R-Intervall.
   HINWEIS: Diese Ausblendungsperiode sollte während des gesamten Experiments angepasst werden, wenn Änderungen der Herzfrequenz auftreten.
2. Führen Sie eine Mittelfrequenzkalibrierung und einen Standardmäßig-SCOUT-Scan ohne Offset durch, um die Position der Maus im Scanner in koronaler, axialer und sagittaler Richtung zu bestimmen. Wenn sich das Herz nicht innerhalb von 0,5-1 cm vom Sichtfeldzentrum (FOV) befindet, passen Sie die Position der Dockingstation entsprechend an und wiederholen Sie den SCOUT-Scan.
3. Führen Sie eine manuelle Shim- und HF-Kalibrierung mit den verfügbaren Methoden des Herstellers durch.

3. Scanplanung und -erfassung

HINWEIS: Detaillierte Scanparameter der folgenden Scans finden Sie in Tabelle 1.

1. Führen Sie basierend auf dem anfänglichen SCOUT einen Gated Single-Frame Gradient Echo (GRE) Scout-Scan(Tabelle 1,Scan 1) mit 5 Slices in 3 orthogonalen Richtungen durch und positionieren Sie jeden Stapel von Slices auf der ungefähren Position des Herzens, um die genaue Position des Herzens zu lokalisieren (Abbildung 2A).
2. Führen Sie einen Gated-Single-Frame-Multi-Slice-SA-Scout-Scan durch (Tabelle 1, Scan 2). Verwenden Sie zu diesem Zweck den vorherigen GRE-Scout, um 4-5 Scheiben in einer mittellinken ventrikulären Position senkrecht zur Längsachse des Herzens zu positionieren, um eine erste Schätzung der mittelventrikulären SA-Ansicht zu finden, die benötigt wird, um den langachsenförmigen 2-Kammer-Scout zu planen (Abbildung 2B).
3. Passen Sie für die folgenden prospektiven Scans (Schritte 3.4-3.6) die Anzahl der Herzrahmen (Nframes) so an, dass Nframes × TR ~ 60-70% des R-R-Intervalls beträgt.
   HINWEIS: Die Erfassung für 60-70% des R-R-Intervalls reicht aus, um die enddiastolische Phase des Herzzyklus zu erfassen und gleichzeitig eine zusätzliche T1-Entspannung während der Enddiastole für eine verbesserte SNR zu ermöglichen und eine Störung des folgenden R-Peaks durch Gradientenschaltung zu verhindern.
4. Führen Sie einen gated Single-Slice-GRE-Scan durch, um den langachsigen 2-Kammer-Scout (2CH) zu erzeugen, der in Kombination mit dem SA-Scan benötigt wird, um den 4-Kammer-Scan (4CH) zu planen(Tabelle 1, Scan 3). Positionieren Sie zu diesem Zweck ein Segment senkrecht zu den vorherigen SA-Ansichten, das parallel zu den Verbindungspunkten zwischen dem linken und rechten Ventrikel verläuft. Bewegen Sie diese Scheibe in die Mitte des linken Ventrikels, und überprüfen Sie im koronalen Bild des GRE-Scouts, ob die Scheibe mit der LV-Längsachse so ausgerichtet ist, dass sie durch die Spitze platziert wird (Abbildung 2C).
5. Führen Sie einen weiteren Gated-Single-Slice-GRE-Scan durch, um den 4-Kammer-Scout-Scan (4CH) zu generieren, der zum Planen des Multi-Slice-SA und des 3-Kammer-Scans erforderlich ist (Tabelle 1, Scan 4). Positionieren Sie zu diesem Zweck eine Scheibe senkrecht zum 2CH-Scout-Scan und richten Sie sie auf die Mitte der Längsachse aus, so dass die Scheibe durch die Mitralklappe und die Spitze geht. Stellen Sie in den SA-Ansichten die Schicht so ein, dass sie parallel zur hinteren und vorderen Ventrikelwand und zwischen den beiden Papillarmuskeln platziert wird (Abbildung 2D). Überprüfen Sie, ob die Scheibe während des gesamten Herzzyklus in der Mitte des Ventrikels verbleibt.
6. Führen Sie einen gated sequential multi-slice SA GRE Scan (Tabelle 1, Scan 5) für systolische Funktionsmessungen durch. Positionieren Sie zu diesem Zweck einen mittelventrikulären Schnitt senkrecht zur LV-Langachse in den 2CH- und 4CH-Ansichten in der Mitte des Herzens und erhöhen Sie die Anzahl der Scheiben (typischerweise eine ungerade Anzahl, z. B. 7 oder 9 Scheiben, kein Spalt zwischen den Scheiben), um das Herz von der Basis bis zum Scheitelpunkt abzudecken (Abbildung 2E).
7. Deaktivieren Sie für die folgenden retrospektiv gated Scans (Schritte 3.8-3.9) alle prospektiven Herz- und Atmungs-Gating-Funktionen. Notieren Sie sich die Herz- und Atemfrequenz vor und nach jedem retrospektiv gated Scan und verwenden Sie diese Werte später für Rekonstruktionszwecke (Schritt 5.2.2).
8. Führen Sie drei sequenzielle Single-Slice-retrospektiv gated GRE-Scans in der midventrikulären SA-Ansicht (zur Quantifizierung des E'/A'-Verhältnisses), der 2CH- und der 4CH-Ansicht durch, wobei die beiden letzteren für die Quantifizierung des Myokardstamms und der HDF-Werte erforderlich sind (Tabelle 1, Scan 6-8). Optimieren Sie bei Bedarf die endgültigen 2CH- und 4CH-Slice-Ausrichtungen basierend auf den Multi-Slice-SA-Ansichten sowie den verfügbaren 2CH- und 4CH-Scout-Scans.
9. Führen Sie einen zusätzlichen retrospektiv gated Single-Slice-GRE-Scan in einer 3-Kammer-Ansicht (3CH) durch, der in Kombination mit der 2CH- und 4CH-Ansicht aus Schritt 3.8 für die Quantifizierung des Myokardstamms und der HDF-Werte erforderlich ist (Tabelle 1, Scan 9). Positionieren Sie zu diesem Zweck eine Scheibe senkrecht zur mittelventrikulären SA-Ansicht, ähnlich der Position der endgültigen langachsigen 4CH-Ansicht, und drehen Sie die Scheibe um 45 °, um von der Vorderwand zu dem Papillarmuskel zu gelangen, der der hinteren Wand am nächsten ist. Untersuchen Sie die basale SA-Scheibe, um zu sehen, ob die Schicht die Mitral- und Aortenklappe passiert. Prüfen Sie in der abschließenden 4CH-Ansicht der Längsachse, ob das Slice den Scheitelpunkt durchläuft (Abbildung 2F).

Abbildung 2:Slice-Planung für die CMR-Bildgebung in einer Maus. (A) GRE SCOUT-Planung durch das Herz in 3 orthogonalen Ansichten mit anfänglichem Scout-Scan. (B) Kurzachsen-Scout-Planung auf den GRE SCOUT-Koronal- und Sagittalscheiben. (C) Planung der 2CH-Scout-Ansicht mit dem Kurzachsen-Scout und dem GRE SCOUT-Koronalschnitt. (D) Planung der 4CH-Scout-Ansicht mit dem Kurzachsen-Scout und dem 2CH-Scout. (E) Planung der Multi-Slice-Kurzachsenansicht mit 2CH- und 4CH-Scouts. (F) (links) Planung der endgültigen 2CH-, 3CH- und 4CH-Ansichten unter Verwendung der midventrikulären Kurzachsen- und 2CH/4CH-Scout-Ansichten. Abkürzungen: CMR = kardiovaskuläre Magnetresonanztomographie; GRE = Gradient Echo; CH = Kammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Scannummer(n)	1	2	3	4	5	6-9
Scanname(n)	GRE-Scout	Multi-Slice-SA-Scout	2CH Scout	4CH Scout	Multi-Slice-SA	SA, 2 KANÄLE, 4 KANÄLE, 3 KANÄLE
Slices gesamt	15 (3 x 5)*	4-5	1	1	7-9	1
Dicke (mm)	1	1	1	1	1	1
Sichtfeld (mm)	60	35	30	30	35	30
FOV-Verhältnis	1	1	1	1	1	1
Flip Winkel	40	20	20	20	20	15
TE (ms)**	3.8	3.4	2.5	2.5	2.5	3.6
TR (ms)	200	1 R-R	7	7	7	8
Nframes	1	1	12-14	12-14	12-14	32 ***
Matrix-Größe	192 x 192	192 x 192	192 x 192	192 x 192	192 x 192	192 x 192
EKG-Triggerung	Nein	ja	ja	ja	ja	rückblickend
Respiratorische Auslösung	ja	ja	ja	ja	ja	rückblickend
Durchschnitte	1	3	5	5	5	Retrospektive ****
Gesamtbildzeit (geschätzt *****)	2 Minuten	2 Minuten	3-4 Min.	3-4 Min.	20-25 Min.	13 Min. / Scan

Tabelle 1: Erfassungsparameter für jede Sequenz, die während des CMR-Protokolls verwendet wird. * Scans werden in drei verschiedenen orthogonalen Ausrichtungen (axial, koronal, sagittal) durchgeführt. **Die kürzest mögliche TE, wenn alle anderen Parameter verwendet werden, was von der spezifischen Scannerkonfiguration abhängt. Dies ist die Anzahl der Herzrahmen nach retrospektivem Binning. Die effektive Mittelung hängt von der zufälligen k-Raumfüllung während der gesamten Erfassungszeit ab. Insgesamt wurden 400 Wiederholungen aller k-Linien durchgeführt. Einschließlich EKG-/Atemauslöseverzögerungen. Abkürzungen: CMR = kardiovaskuläre Magnetresonanztomographie; EKG = Elektrokardiogramm; GRE = Gradientenecho; FOV = Sichtfeld; TE = Echozeit; TR = Wiederholungszeit; Nframes = Anzahl der Herzrahmen; SA = kurze Achse; CH = Kammer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

4. Abschluss des Experiments und Datenspeicherung

1. Entfernen Sie die Maus aus der Halterung, nachdem Sie alle anderen Messgeräte abgenommen haben, und schalten Sie die Narkose aus. Bei Längsschnittversuchen wird die Maus zur Erholung in einen vorgewärmten Stallkäfig bei 37 °C gebracht, bis das Tier wach und aktiv ist.
2. Reinigen Sie alle Geräte, die mit Reinigungstüchern oder 70% Alkohol verwendet wurden.
3. Generieren Sie DICOM-Dateien (Digital Imaging and Communication in Medicine) für die prospektiv gated MRT-Daten und kopieren Sie diese zusammen mit den MRT-Rohdatendateien der retrospektiv gated Scans zur anschließenden Datenanalyse auf einen sicheren Server.

5. Offline-Rekonstruktion der retrospektiv erfassten Scans

HINWEIS: Für die Rekonstruktion der nachträglich gated Scans wurde eine eigens entwickelte Open-Source-Software verwendet (Abbildung 3). Führen Sie die folgenden Schritte für jedes der retrospektiv ausgelösten Daten separat aus.

1. Öffnen Sie die Rekonstruktionssoftware Retrospektiveund laden Sie die Rohdatendatei, die einem nachträglich eingegrenzten MRT-Scan entspricht.
2. Überprüfen Sie das Raw-Navigatorsignal, und beachten Sie, dass die höheren Signalspitzen die Atemfrequenz und die unteren Signalspitzen die Herzfrequenz darstellen.
   1. Wenn die Spitzen auf dem Kopf stehend registriert sind, drehen Sie das Signal mit dem Aufwärts- / Abwärtsschalter um.
   2. Überprüfen Sie außerdem, ob die automatisch erkannte Herzfrequenz bei jedem Scan 10% der beobachteten Werte entspricht. Ist dies nicht der Fall, passen Sie diese Werte manuell an, da die automatische Erkennung fehlgeschlagen ist.
   3. Wählen Sie einen geeigneten Fensterprozentsatz für den Ausschluss von Daten während der Atembewegung, in der Regel 30%.
3. Drücken Sie Filter, um die Navigatoranalyse durchzuführen, und trennen Sie den Herznavigator vom Atmungsnavigator.
4. Legen Sie die Anzahl der CINE-Frames auf 32 (in dieser Studie verwendeter Wert) fest und drücken Sie sort k-space.
5. Wählen Sie die entsprechenden Einstellungen für die CS-Regularisierung (Compressed Sensing) aus, und drücken Sie auf Rekonstruieren. Verwenden Sie die folgenden typischen Regularisierungsparameter: Wavelet-Regularisierungsparameter in den räumlichen Dimensionen (x, y und z) (WVxyz) 0,001 oder 0; Gesamtvariationsbeschränkung in der CINE-Dimension (TVcine) 0,1; Gesamtvariationsbeschränkung in der räumlichen Dimension (TVxyz) 0; und Gesamtvariationsbeschränkung in der Dynamikdimension (TVdyn) 0,05.
6. Sobald die Rekonstruktion abgeschlossen ist, zeigen Sie eine Vorschau des CINE-Films an, um die Rekonstruktion zu bewerten. Exportieren Sie DICOM-Bilder zur weiteren Analyse mit Export DCM.

Abbildung 3: "Retrospektive" auslösende grafische Benutzeroberfläche. "Retrospektiv" ist eine speziell angefertigte Rekonstruktionsanwendung für retrospektiv ausgelöste kardiale Magnetresonanztomographien. In der Benutzeroberfläche ist es möglich, das Navigatorsignal auszuwerten, die Anzahl der zu rekonstruierenden CINE-Frames anzupassen, die komprimierten Sensorparameter anzupassen, um die Rekonstruktion zu verbessern, eine Vorschau der CINE-Bilder als dynamischen Film anzuzeigen und die rekonstruierten Daten zu exportieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Bildanalyse-Software

HINWEIS: Die Bildanalysesoftware (Abbildung 4) erfordert die Verwendung von DICOM-Bildern und verfügt über mehrere Plugins für verschiedene kardiovaskuläre Analyseanwendungen, wie das Plugin für volumetrische Messungen und das Plugin für Dehnungs- und HDF-Analysen.

1. Für die volumetrische Beurteilung des LV wählen Sie den Multi-Slice-SA-Scan aus und laden Ihn für volumetrische Messungen in das Plugin.
   1. Weisen Sie dem entsprechenden Herzrahmen endsystolische (ES) und enddiastolische (ED) Markierungen zu.
   2. Verwenden Sie die Konturwerkzeuge, um die endomyokardialen Ränder in den ES- und ED-Rahmen zu segmentieren.
      HINWEIS: Die für dieses Protokoll verwendete Analysesoftware zeigt automatisch die Parameter LV EF, EDV, ESV an, wenn alle erforderlichen Anmerkungen gemacht wurden.
2. Wählen Sie für diastolische Messungen die mittelventrikulären SA CINE-Bilder aus und laden Sie diese für volumetrische Messungen in das Plugin.
   1. Weisen Sie die ED- und ES-Etiketten den entsprechenden Herzrahmen zu.
   2. Verwenden Sie die Konturwerkzeuge, um den Endokardrand für alle Rahmen zu segmentieren. Vergleichen Sie die Segmentierung benachbarter Rahmen, um reibungslose Übergänge der Segmentierung während des gesamten Herzzyklus zu gewährleisten.
   3. Exportieren Sie die Zeitentwicklung aus allen Herzrahmen und den entsprechenden LV-Endomyokardvolumina (LV ENDO). Wenden Sie ein benutzerdefiniertes Skript an (siehe Ergänzendes Material),um das E'/A'-Verhältnis zu berechnen.
      HINWEIS: Das Skript wendet einen Savitzky-Golay-Filter zur robusten Berechnung der dV/dt-Kurven an und verwendet eine halbautomatische Peak-Erkennung, um die E' und A'-Peaks zu finden.
3. Wählen Sie für Dehnungs- und HDF-Berechnungen die 2CH-, 3CH- und 4CH-Langachsen-CINE-Bilder aus und laden Sie sie für volumetrische Messungen in das Plugin.
   1. Weisen Sie die ED- und ES-Beschriftungen dem entsprechenden Herzrahmen in jeder Slice-Ausrichtung zu.
   2. Verwenden Sie die Konturwerkzeuge, um den Endokardrand für alle Rahmen in allen 3 Ausrichtungen zu segmentieren. Vergleichen Sie die Segmentierung benachbarter Rahmen, um reibungslose Übergänge der Segmentierung während des gesamten Herzzyklus zu gewährleisten.
   3. Sobald die Konturen im Plugin für volumetrische Messungen gezeichnet sind, führen Sie das Plugin für die Dehnungs- und HDF-Analyse aus.
   4. Weisen Sie jeden der erfassten Datensätze den entsprechenden Beschriftungen für 2CH-, 3CH- und 4CH-Ansichten zu und führen Sie die Dehnungsanalyse aus.
   5. Zeichnen Sie für die HDF-Analyse den Durchmesser der Mitralklappe am enddiastolischen Rahmen in allen 3 Ausrichtungen und zeichnen Sie den Durchmesser der Aorta im 3-Kammer-Langachsenbild.

Abbildung 4: Grafische Benutzeroberfläche der Bildanalysesoftware. Das Plugin zur volumetrischen Messung in der Bildanalysesoftware, das zur Konturierung der endomyokardialen Grenze verwendet wird. Für jeden Datensatz werden die enddiastolischen und endsystolischen Herzphasen ausgewählt und die endomyokardiale Grenze für alle Frames segmentiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Results

Unter Verwendung des zuvor beschriebenen Protokolls wurde eine Gruppe gesunder C57BL/6-Wildtyp-Mäuse (n = 6, Alter 14 Wochen) mit einem 7-Tesla-MRT-Scanner unter Verwendung einer Vogelkäfigspule mit einem Durchmesser von 38 mm gescannt. Während jeder Scansitzung wurden die Multi-Slice-CINE SA-Bilder mit prospektiv gated GRE-Sequenzen aufgenommen, während die CINE-Bilder mit CINE-Ansichten mit CINE-Ansichten von Single-Slice-Midventrikulären SA, 2CH, 3CH und 4CH mit retrospektivem Gating aufgenommen wurden. Repräsentative High-Framerate-Rekonstruktionen von retrospektiv gated Scans mit einer speziell angefertigten Nachbearbeitungssoftware sind in Supplemental Video 1 zu sehen. Aus den resultierenden Bildern wurden Volumen-Zeit-Kurven während des Herzzyklus (Abbildung 5A) sowie die entsprechenden First-Derivative-Kurven (dV/dt) zur Berechnung der systolischen (EF = 72,4 ± 2,8%) bzw. diastolischen Funktionsparameter (E'/A'-Verhältnis = 1,5 ± 0,3) bestimmt.

Die CINE-Bilder der 2CH-, 3CH- und 4CH-Ansicht wurden mit einer Bildanalysesoftware analysiert, um endokardiale GLS-Veränderungen (EndoGLS) über den Herzzyklus(Abbildung 5B)und die entsprechenden GLS-Spitzenwerte (-22,8 ± 2,4%) als Maß für die Myokardbelastung zu bestimmen. Zusätzlich berechnet die Software den mittleren quadratischen (RMS) HDF in Längsrichtung (Apex-Base) (135,2 ± 31,7%) und transversal (inferolateral-anteroseptal) (12,9 ± 5,0%). Für jedes Tier ist es auch möglich, ein HDF-Zeitprofil zu erstellen, das einem konsistenten Muster positiver und negativer Peaks folgt, die die Größe und Richtung des HDF während des Herzzyklus darstellen (Abbildung 5C). Die deskriptiven Ergebnisse aller Ergebnisparameter sind in Abbildung 5Dzusammengefasst.

Abbildung 5: Quantifizierung der LV-Funktionsparameter basierend auf dem Mausherz. (A) Repräsentative Volumen-Zeit-Kurve und entsprechende dV/dt-Kurve. Letzteres stellt die Strömungsgeschwindigkeit mit deutlichem frühen Füllpeak (E') und Vorhofkontraktionsspitze (A') dar. (B) Repräsentative GLS-Kurve, die die Dehnungsverformung in Längsrichtung während des gesamten Herzzyklus anzeigt. (C) Repräsentative HDF-Kurve mit deutlichen Kraftspitzen in Der Scheitel-Basis-Richtung, beginnend mit der systolischen Auswurfkraft und gefolgt von einer Abwärtskraft am Übergang zwischen Systole und Diastole, E-Wellen-Verzögerungskraft, A-Wellenbeschleunigung und Verzögerungskraft. (D) Deskriptive Ergebnisse aller Tiere für Werte von EF, E'/A'-Verhältnis, Peak GLS und mittlerem Quadrat der HDF in Apex-Base- und inferolateral-anteroseptaler Richtung. Die Werte werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Abkürzungen: LV = linker Ventrikel; V = Volumen; t = Zeit; GLS = globale Längsdehnung; HDF = hämodynamische Kräfte; EF = Auswurffraktion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzendes Video 1: Repräsentative Rekonstruktion retrospektiv gated CINE-Bilder in SA-, 2CH-, 3CH- und 4CH-Ansichten. Abkürzungen: SA = kurze Achse; CH = Kammer. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzendes Material: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Verwendung der CMR-Bildgebung für longitudinale, nicht-invasive In-vivo-Experimente zur Analyse der Herzfunktion bei Mäusen. Diese Ergebnisse sind Beispiele für gesunde Tiere, um die Machbarkeit der Verwendung von CINE-Bildern zur Quantifizierung der Herzparameter zu demonstrieren. Die beschriebenen Methoden können jedoch für verschiedene Tiermodelle verwendet werden. Obwohl spezifische Krankheitsmodelle kleine Änderungen am Protokoll erfordern können, wird seine Grundstruktur zur Beurteilung der verschiedenen kardialen Funktionsparameter sehr ähnlich sein. Ein besonderer Fall, der erwähnenswert ist, ist ein Myokardinfarktmodell, bei dem ein Teil des Herzens einen signifikanten Verlust an Kontraktilität aufweist. Dies kann zu einer geringen Qualität des Herznavigatorsignals in diesem Abschnitt führen. In diesem Fall wäre eine alternative Option der Erwerb des Navigators aus einem separaten Slice, wie in einer früheren Studie von Coolen et al.¹⁶beschrieben. CINE-Bilder in verschiedenen Ansichten werden aus retrospektiv gated Daten mit CS-Algorithmen rekonstruiert und mit Einer Bildanalysesoftware analysiert, um die Dehnungs- und HDF-Werte zu berechnen.

Die Qualität der aufgenommenen Bilder hängt natürlich von allen Vorbereitungsschritten ab, die vor Beginn des kardialen MRT-Protokolls sorgfältig durchgeführt werden müssen. Wenn beispielsweise beim Einsetzen des Tieres in den MRT-Scanner keine klaren EKG- und Atemsignale zu sehen sind, führt dies wahrscheinlich zu suboptimalen Akquisitionen und sogar zu erhöhten Scanzeiten aufgrund des zusätzlichen Effekts magnetohydrodynamischer Verzerrungen¹⁷. Es ist wichtig zu erkennen, dass aufgrund der sequentiellen Planung der Schnittorientierungen die Tiere nicht einfach zwischen den Scans neu positioniert werden können. Es ist daher nicht möglich, die EKG-Leitungen zwischen den Scans neu einzustellen, da dies die Position der Maus im Scanner verändert. Während des Scannens ist die Temperaturregelung entscheidend für die Aufrechterhaltung eines konstanten Herz- und Atemintervalls, was insbesondere der Qualität der retrospektiv gated Scans zugute kommt, die über einen längeren Zeitraum erfasst werden. Während dieses High-Duty-Cycle-Scans kann die Temperatur des Tieres stetig ansteigen, wodurch die Herzfrequenz und die Atemfrequenz ansteigen. Die Einstellung der Temperatur des Heizsystems und der Anästhesie könnte wesentlich zur Stabilisierung der Atemfrequenz vor oder während des Scannens beitragen.

Ein kritischer Schritt während der Analyse ist die Konsistenz der Konturzeichnung. Während die automatische Segmentierung für klinische Daten gut funktioniert, funktioniert sie bei Mausherzdaten (nicht auf Ratten getestet) nicht robust. Die hohe Herzfrequenz und der hohe Blutfluss während bestimmter Herzphasen, insbesondere zu Beginn der LV-Füllung, können intravoxel-Dephasierungen und Signallücken verursachen, die die Abgrenzung der Myokardwand beeinträchtigen. Es ist daher nicht ratsam, jeden Rahmen einzeln zu analysieren, sondern die Bewegung der Myokardwand zwischen den Rahmen visuell zu untersuchen und dies beim Zeichnen der Konturen über alle Rahmen hinweg zu berücksichtigen. Es wird empfohlen, die endokardiale Kontur zwischen zwei aufeinanderfolgenden Frames zu kopieren und anzupassen, um eine natürlichere kontraktile Bewegung in der Analyse aufrechtzuerhalten. In diesem Protokoll werden Papillarmuskeln in den SA-Bildern zur systolischen und diastolischen Funktionsbewertung vom ventrikulären Lumenvolumen ausgeschlossen, während sie in den 2CH-, 3CH- und 4CH-Ansichten für die Dehnungs- und HDF-Analyse enthalten sind, da letztere auf der Kenntnis der genauen Bewegung der Myokardwand und nicht auf dem genauen Volumen des ventrikulären Lumens beruht.

Während systolische und diastolische Funktionsparameter auf der Messung des LV-Volumens während des gesamten Herzzyklus basieren, hängen Dehnungs- und HDF-Parameter auch von Bewegungsmustern innerhalb der Myokardwand ab. Dazu werden Feature-Tracking-Techniken eingesetzt, bei denen die Verschiebung des Myokardsegments durch erkennende unterschiedliche anatomische Merkmale und Signalintensitäten zwischen nachfolgenden CINE-Phasen beurteilt werden kann. Der starke Kontrast zwischen Blutpool und Myokard in CMR-Bildern erleichtert die Verwendung von Feature-Tracking für nachfolgende Dehnungs- und HDF-Analysen⁸. Vor dem CMR-Feature-Tracking wurde der Myokardstamm mit Speckle-Tracking-Echographie und CMR-Gewebemarkierung bestimmt. CmR-Feature-Tracking erfordert im Vergleich zum CMR-Tissue-Tagging keine zusätzliche Scanzeit. Trotz der Verwendung der retrospektiven Triggerung hat CMR jedoch immer noch eine begrenzte zeitliche Auflösung, was es schwierig machen könnte, schnelle Verformungen innerhalb des Herzzyklus richtig zu bewerten.

Die Beurteilung der HDF während des gesamten Herzzyklus erfordert Messungen der Durchmesser der Mitral- und Aortenklappen, um die HDF in Apex-Base- und inferolateral-anteroseptalen Richtungen unter Verwendung der zuvor beschriebenen Gleichungen¹⁸zu berechnen. Diese Methode hat konsistente Schätzungen der HDF im Vergleich zum Referenzstandard 4D-Flow-MRT gezeigt, der aufgrund seiner Komplexität eine begrenzte Verfügbarkeit im klinischen Einsatz aufweist⁶. Es ist wichtig zu wissen, dass eine robuste Schätzung der Ventildurchmesser schwierig ist und daher die Ventildurchmesser für eine Gruppe von Tieren und über wiederholte Messungen in einer Längsschnittstudie hinweg konstant gehalten werden sollten, da Variationen dieses Parameters durch falsche Schätzungen subtile Änderungen der HDF-Parameter leicht überschatten könnten. Die spezifische Software, die zum Berechnen von GLS- und HDF-Parametern verwendet wird, steht möglicherweise nicht allen Benutzern zur Verfügung. Daher kann man sowohl auf Voigt et al.¹⁹ (GLS) als auch auf Pedrizzetti et al.^6,20 (HDF) verweisen, die alle mathematischen Beschreibungen enthalten, die die Grundlage der jeweiligen Berechnungen bilden, wie sie von der Analysesoftware durchgeführt werden.

Für die Zwecke dieser Studie wurde das Protokoll an gesunden Tieren evaluiert (N = 6). Ein repräsentativer Satz von Zeitkurven für LV-Volumen, dV/dt, endoGLS und HDF ist in Abbildung 5A-Cdargestellt. Mittelwerte mehrerer kardialer Funktionsparameter (EF, E'/A'-Verhältnis, Peak GLS und HDF) sind in Abbildung 5D dargestellt. Diese stimmen gut mit vergleichbaren Protokollen überein, die in der Literatur verwendet werden²¹. Literatur zu GLS- und HDF-Daten bei Mäusen ist rar. Es wurde ein mittlerer GLS-Wert von -22,8% gemessen, der im gleichen Bereich wie die klinischen Daten^{8 liegt,}was darauf hindeutet, dass GLS-Messungen, die mit der beschriebenen Methode erhalten wurden, bei Mäusen durchführbar sind. HDF-Kurven, die an Mäusen erhalten wurden, zeigen auch die gleichen unterschiedlichen Phasen wie in menschlichen Daten, was die erfolgreiche Übertragung dieser Technik auf die präklinische Forschung zeigt. Während angenommen wird, dass HDF-Parameter als frühe Biomarker für Herzfunktionsstörungen dienen, sind weitere Studien gerechtfertigt, um den diagnostischen und prädiktiven Wert dieses neuen Parameters zu untersuchen. Die Ergebnisse in diesem Protokoll zeigen, dass die HDF- und GLS-Ergebnisse zwischen den Tieren variabler sein dürften, was berücksichtigt werden muss, wenn subtile Unterschiede in Tiermodellen oder Behandlungseffekten erwartet werden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
AccuSens Ein- und Mehrkanal-Signalaufbereiter	Opsens solutions inc., Kanada	ACS-P4-N-62SC	Wird mit einem faseroptischen Temperatursensor zur Überwachung der Körpertemperatur
verwendet Duratears Augensalbe	Alcon Nederland B.V., Niederlande
Mauszelle	& Eacute; Ausstattung Vé té Minerve, Frankreich		wird als Maus-Cradle
bezeichnet MR-kompatible Überwachung & Gating-System für Kleintiere	SA Intuments, Inc., Vereinigte Staaten	Modell 1030	ERT-Modul (EKG-/Atemwegsschnittstellenmodul), ERT-Steuerungs-/Gating-Modul, Batteriepack und subdermales EKG-Elektroden-Set
MRT-Scanner	MR Solutions Ltd., Vereinigtes Königreich	Modell: MRS-7024	Präklinisches MRT-System 7,0T/24 cm
Multistation-Temperiergerät und High Flow PCA	& Eacute; Ausstattung Vé té rinaire Minerve, Frankreich	Modell: URT Multipostes	Tierheizungssystem
Atemsensor	Graseby Medical Limited, Vereinigtes Königreich	Ref 2005100
HF-Spule	MR Solutions Ltd., Vereinigtes Königreich	MRS-MVC	38mm Mausvolumen HF-Spule für Mauskörperstudien
SF Durchflussmesser	Durchflussmesser, Italien	SF 3
Vaporizer sigma delta Intermed	Penlon Ltd., Vereinigtes Königreich
Materials
Isofluran	AST farma, Niederlande
Vaseline Vaseline	Unilever, Vereinigtes Königreich
Software
BART Werkzeugkasten			https://mrirecon.github.io/bart/
Mathematica 12.0	Wolfram Research, Inc., Vereinigte Staaten
MATLAB 2019a	The MathWorks, Inc., Vereinigte Staaten
MEDIS Suite MR	Medis Medical Imaging Systems B.V. ,Niederlande		Bildanalysesoftware
PC-SAM	SA Intuments, Inc., USA
Präklinischer Scan	MR Solutions Ltd., Vereinigtes Königreich		Scan-Software
Retrospektive Version 7.0	Amsterdam UMC, Niederlande		Rekonstruktionssoftware: https://github.com/Moby1971?tab=repositories