Erfassung von funktionellen Magnetresonanztomographiedaten im Ruhezustand bei ratten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Gewinnung stabiler Ruhezustandsdaten der funktionellen Magnetresonanztomographie (rs-fMRT) von einer Ratte, die niedrig dosiertes Isofluran in Kombination mit niedrig dosiertem Dexmedetomidin verwendet.

Zusammenfassung

Die funktionelle Magnetresonanztomographie im Ruhezustand (rs-fMRT) ist zu einer immer beliebteren Methode geworden, um die Gehirnfunktion in einem ruhenden, aufgabenfreien Zustand zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt eine präklinische Überlebensmethode zur Gewinnung von rs-fMRT-Daten. Die Kombination von niedrig dosiertem Isofluran mit kontinuierlicher Infusion des α₂ adrenergen Rezeptoragonisten Dexmedetomidin bietet eine robuste Option für eine stabile, qualitativ hochwertige Datenerfassung bei gleichzeitiger Erhaltung der Gehirnnetzwerkfunktion. Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren eine spontane Atmung und eine nahezu normale Physiologie bei der Ratte. Zusätzliche Bildsequenzen können mit der Erfassung des Ruhezustands kombiniert werden, wodurch experimentelle Protokolle mit einer Anästhesiestabilität von bis zu 5 h mit dieser Methode erstellt werden. Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau der Ausrüstung, die Überwachung der Rattenphysiologie während vier verschiedener Phasen der Anästhesie, die Erfassung von Ruhezustandsscans, die Qualitätsbewertung der Daten, die Genesung des Tieres und eine kurze Erörterung der Datenanalyse nach der Verarbeitung. Dieses Protokoll kann für eine Vielzahl von präklinischen Nagetiermodellen verwendet werden, um die daraus resultierenden Veränderungen des Gehirnnetzwerks aufzudecken, die in Ruhe auftreten.

Einleitung

Die funktionelle Magnetresonanztomographie im Ruhezustand (rs-fMRT) ist ein Maß für das Blut-Sauerstoff-Level-abhängige (BOLD) Signal, wenn das Gehirn in Ruhe ist und keiner bestimmten Aufgabe nachliegt. Diese Signale können verwendet werden, um Korrelationen zwischen Gehirnregionen zu messen, um die funktionelle Konnektivität innerhalb neuronaler Netze zu bestimmen. rs-fMRT wird in klinischen Studien aufgrund seiner Nicht-Invasivität und des geringen Aufwands der Patienten (im Vergleich zur aufgabenbasierten fMRT) häufig eingesetzt, was es für verschiedene Patientenpopulationen optimal macht¹.

Technologische Fortschritte haben es ermöglicht, rs-fMRT für den Einsatz in Nagetiermodellen anzupassen, um Mechanismen aufzudecken, die krankheitsbedingten Zuständen zugrunde liegen (siehe Referenz² für eine Überprüfung). Präklinische Tiermodelle, einschließlich Krankheits- oder Knockout-Modelle, ermöglichen eine breite Palette von experimentellen Manipulationen, die beim Menschen nicht anwendbar sind, und Studien können auch Post-Mortem-Proben verwenden, um die Experimente weiter zu verbessern². Aufgrund der Schwierigkeit, sowohl die Bewegung einzuschränken als auch stresslindernd zu mildern, wird die MRT-Erfassung bei Nagetieren traditionell unter Narkose durchgeführt. Anästhetika beeinflussen abhängig von ihrer Pharmakokinetik, Pharmakodynamik und molekularen Zielen den Blutfluss des Gehirns, den Gehirnstoffwechsel und beeinflussen möglicherweise die neurovaskulären Kopplungswege.

Es gab zahlreiche Bemühungen, Anästhesieprotokolle zu entwickeln, die die neurovaskuläre Kopplung und die Gehirnnetzwerkfunktion^3,4,5^,6,^7,8erhalten. Wir berichteten zuvor über ein Anästhesieregime, bei dem eine niedrige Dosis Isofluran zusammen mit einer niedrigen Dosis des α₂ adrenergen Rezeptoragonisten Dexmedetomidin⁹angewendet wurde. Ratten unter dieser Anästhesiemethode zeigten robuste BOLD-Reaktionen auf die Whisker-Stimulation in Regionen, die mit etablierten Projektionswegen übereinstimmen (ventrolaterale und ventromediale thalamische Kerne, primärer und sekundärer somatosensorischer Kortex); Groß angelegte Ruhezustands-Gehirnnetzwerke, einschließlich des Standardmodusnetzwerks^10,11 und des Salienznetzwerks^12, wurden ebenfalls konsistent erkannt. Darüber hinaus ermöglicht dieses Anästhesieprotokoll eine wiederholte Bildgebung am selben Tier, was für die Überwachung des Krankheitsverlaufs und der Wirkung experimenteller Manipulationen in Längsschnitt wichtig ist.

In der vorliegenden Studie beschreiben wir den Versuchsaufbau, die Tiervorbereitung und die physiologischen Überwachungsverfahren. Insbesondere beschreiben wir die spezifischen Anästhesiephasen und die Erfassung von Scans während jeder Phase. Die Datenqualität wird nach jedem Ruhezustandsscan bewertet. Eine kurze Zusammenfassung der Post-Scan-Analyse ist ebenfalls in der Diskussion enthalten. Labore, die daran interessiert sind, das Potenzial der Verwendung von rs-fMRT bei Ratten aufzudecken, werden dieses Protokoll nützlich finden.

Protokoll

Alle Experimente wurden mit einem 9,4 T MRT-Scanner durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee am Dartmouth College genehmigt. Zusätzliche Genehmigungen wurden eingeholt, um die im Video und in den folgenden Abbildungen verwendeten Tiere aufzuzeichnen und zu zeigen.

1. Vorbereitungen vor dem Scannen

1. Subkutane Infusionsleitung
   1. Entfernen Sie eine 23 G Nadel teilweise aus der Verpackung, damit die Nadelspitze steril bleibt.
   2. Halten Sie die Nabe der Nadel sicher und verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Nadelschaft dort zu treffen, wo er auf die Nabe trifft.
   3. Klemmen Sie einen Nadelhalter um die Welle direkt unter der Ausbeute und brechen Sie die Welle vorsichtig von der Nabe ab.
   4. Führen Sie 1/3 des Nadelschaftes (stumpfes Ende) in die zuvor sterilisierte PE50-Leitung mit genügend Leitungslänge ein, um sich von der Medikamentenpumpe bis zum Tier in der Magnetbohrung zu erstrecken.
2. Verdünnung von Dexmedetomidin und Atipamezol
   1. Bereiten Sie eine Lösung von verdünntem Dexmedetomidinhydrochlorid mit 0,5 ml 0,5 mg / ml Brühe gemischt mit 9,5 ml steriler Kochsalzlösung in einer klaren, sterilen Glasflasche (verdünnte Konzentration = 0,025 mg / ml) vor.
   2. Bereiten Sie eine Lösung von verdünntem Atipamezol mit 0,1 ml 5 mg / ml Brühe gemischt mit 9,9 ml steriler Kochsalzlösung in einer klaren, sterilen Glasflasche vor (verdünnte Konzentration = 0,05 mg / ml).
3. Scanparameter
   1. Verwenden Sie die in Tabelle 1 dargestellten Parameter, um Scansequenzen vorzubereiten.

2. Phase 1 Anästhesie: Tierische Induktion und Vorbereitung

1. Einrichtung
   1. Stellen Sie sicher, dass alle Geräte eingeschaltet sind und ordnungsgemäß funktionieren, einschließlich Sauerstoff- und Luftmischer, Heizkissen und aktivem Aufraschsystem (siehe Abbildung 1).
   2. Stellen Sie den Temperatursennpunkt der Heizungsanlage auf 37,5 °C ein.
2. Tierische Induktion
   1. Legen Sie das Tier (90 Tage alte, männliche Sprague Dawley-Ratte) in die Induktionskammer und induzieren Sie die Anästhesie mit 2,5% Isofluran in 30% sauerstoffangereicherter Luft.
      HINWEIS: Eine breite Palette von Tieralter und beide Geschlechter können verwendet werden.
   2. Sobald das Tier betäubt ist, entfernen Sie es aus der Kammer, wiegen Sie das Tier und legen Sie es in den Nasenkegel (bei 2,5% Isofluran) auf das Heizkissen im Vorbereitungsraum.
3. Tierische Vorbereitung
   1. Tragen Sie ophthalmische Schmiersalbe auf jedes Auge auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
   2. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch einen Mangel an Zehenquetschreaktion.
   3. Verwenden Sie Clipper, um einen quadratischen Bereich von 2 "x 2" im unteren Lendenbereich des Rückens des Tieres (dh direkt über dem Schwanz) zu rasieren.
   4. Verabreichung von 0,015 mg/kg der Dexmedetomidinlösung mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion (z. B. würde eine 300 g-Ratte 0,18 ml erhalten) in den unteren rechten Quadranten des Abdomens mit einer 25-G-Nadel.
   5. Wechseln Sie den Isofluranfluss vom Vorbereitungsraum zur Tierwiege.
   6. Bewegen Sie das Tier in die Tierwiege. Legen Sie die Vorderzähne der Ratte sicher über und in die Bissstange. Drücken Sie den Nasenkegel über die Nase, um eine enge Passform zu gewährleisten.
      HINWEIS: Wenn der Nasenkegel den Unterkiefer nicht bedeckt, verwenden Sie einen Paraffinfilm, um den Kiefer sanft geschlossen zu halten und gleichzeitig den Nasenkegel zu versiegeln.
   7. Positionieren Sie das Atmungspad unter dem Bauch der Ratte unterhalb des Brustkorbs und positionieren Sie es neu, bis die Atmungswellenform einen tiefen Trog zeigt, der auf jedem Atemzug zentriert ist (siehe Atmungswellenform in Abbildung 2).
   8. Überwachen Sie die Atmung des Tieres mit der Physiologie-Überwachungssoftware. Wechseln Sie zur nächsten Phase der Anästhesie, wenn die Atmung weniger als 40 Atemzüge / min beträgt (bpm; ca. 5 min nach Dexmedetomidin-Injektion).

3. Phase 2 Anästhesie: Tieraufbau

1. Setzen Sie Ohrbügel in den Gehörgang ein, um den Kopf der Ratte in der Tierwiege zu stabilisieren. Ziehen Sie nach der Positionierung an der Bissstange nach vorne und bestätigen Sie, dass sich der Kopf nicht bewegt. Stellen Sie den Nasenkegel und den Paraffinfilm nach Bedarf neu ein (siehe Abbildung 3a).
2. Setzen Sie den Temperaturfühler in eine vorgeschmierte Einweg-Sondenabdeckung ein. Führen Sie den Temperaturfühler vorsichtig etwa 1/2 "in das Rektum ein und kleben Sie ihn mit medizinischem Klebeband an die Basis des Schwanzes.
3. Legen Sie den Pulsoximeterclip auf den Mittelfußbereich des Hinterfußes und stellen Sie sicher, dass sich die Lichtquelle auf der Unterseite des Fußes (Handfläche) befindet.
   HINWEIS: Die Drehung des Clips kann das Signal beeinflussen. Daher führt die Schaffung eines Halters, um die Pfote und den Clip aufrecht zu halten, zu einer größeren Stabilität. Beachten Sie auch, dass die Sauerstoffsättigung niedrig sein kann, bis die Ratte normale Körpertemperatur hat (<95%).
4. Verwenden Sie das Gewicht der Ratte, um die Infusionsrate zu berechnen, um 0,015 mg / kg / h Dexmedetomidin auszustoßen (eine 300 g-Ratte erhält 0,18 ml / h).
5. Stellen Sie die Medikamentenpumpe so ein, dass die berechnete Infusionsrate ausgeworfen wird.
6. Füllen Sie eine 3-ml-Spritze mit der sterilen, verdünnten Dexmedetomidinlösung und führen Sie die Nadelspitze in das offene Ende der sterilisierten Infusionsleitung ein (von der Arzneimittelpumpe bis zur Tierwiege mit zuvor angebrachter subkutaner Nadel). Füllen Sie die Leitung und befestigen Sie die Spritze im Spritzenhalter der Medikamentenpumpe.
7. Bewegen Sie den Drückerblock nach vorne, bis er den Kolben berührt, und das Medikament wird an der Nadel ausgestoßen, um sicherzustellen, dass die Infusionsleitung vollständig gefüllt ist.
8. Reinigen Sie den rasierten Bereich mit einem Alkoholtuch, um streunende Haare zu entfernen.
9. Kneifen Sie die Haut etwa zwei Fingerbreiten über der Schwanzbasis. Führen Sie 1/3 der Infusionsliniennadel in die Zelthaut ein.
10. Befestigen Sie die Nadel mit einem 3 "breiten Stück medizinischem Klebeband auf der Haut. Legen Sie ein zweites Stück breites medizinisches Klebeband über das erste, über die Ratte, und befestigen Sie es an beiden Seiten der Tierwiege (siehe Abbildung 4).
    HINWEIS: Es ist von entscheidender Bedeutung, dass die ferromagnetische Nadel gut gesichert ist, um Bewegungen während des Scans zu verhindern.
11. Beginnen Sie mit der Infusion von subkutanem Dexmedetomidin.
12. Legen Sie ein Stück Gaze auf den Nasenrücken der Ratte, um eine ebene Oberfläche für die Spule zu schaffen. Verwenden Sie Papierband, das das MRT-Signal nicht stört, um die Spule am Kopf der Ratte zu befestigen und über dem Gehirn zu zentrieren (siehe Abbildung 3b,c).
13. Sichern Sie alle Leitungen und Kabel innerhalb der Tierwiege mit Laborband und prüfen Sie, ob alle physiologischen Signale stabil sind (siehe Abbildung 2).
14. Legen Sie Papierhandtücher über das Tier und besichern Sie sie mit Laborband an der Tierwiege. Wenn Sie ein Luftheizungssystem verwenden, wickeln Sie eine Plastikfolie um die gesamte Wiege, um die warme Luft zu enthalten.
15. Bewegen Sie das Tier in die Bohrung und stimmen Sie den Magneten ab.

4. Phase 3 Anästhesie: Anatomische Scan-Erfassung

1. Reduzieren Sie Isofluran auf 1,5%, was zu einem stetigen Anstieg der Atmung auf etwa 45-50 bpm führt. Bleiben Sie für die Dauer des anatomischen Scannens auf diesem Niveau.
2. Verwenden Sie den FLASH-Lokalisierungsscan, um sicherzustellen, dass das Gehirn mit dem Magnetisozentrum ausgerichtet ist (Abbildung 5a). Positionieren Sie das Tier neu und wiederholen Sie es bei Bedarf.
3. Führen Sie den RARE-Lokalisierungsscan mit höherer Auflösung aus, und verwenden Sie diese Scanausgabe, um 15 sagittale Scheiben im Gehirn zentriert auszurichten (von links nach rechts, Abbildung 5b).
4. Richten Sie die mittlere sagittale Scheibe mit der mittleren axialen Scheibe an der Deklusion der vorderen Kommissur aus, die als dunkler Fleck erscheint (Abbildung 5c). Notieren Sie sich den Slice-Offset, der später in den Ruhezustandsscans verwendet werden soll.
5. Erfassen Sie 23 Slices mit dem axialen Flash- und RARE-Protokoll, um die Registrierung in einem gemeinsamen Raum während der Post-Scan-Analyse zu unterstützen.
6. Shim über das gesamte Gehirn mit der PRESS-Sequenz.

5. Phase 4: Erfassung des Ruhezustandsscans

1. Reduzieren Sie Isofluran nach Abschluss der anatomischen Scans auf 0,5% bis 0,75% und passen Sie sich so an, dass die Atmung des Tieres 60-65 Atemzüge pro Minute beträgt. Bleiben Sie mindestens 10 Minuten auf diesem Niveau, bevor Sie mit dem Scannen im Ruhezustand beginnen, um die Stabilität zu gewährleisten.
2. Wenn die Physiologie stabil ist (der Atembereich beträgt 60-75 bpm ohne Keuchen oder Unregelmäßigkeiten, die Körperkerntemperatur beträgt 37,5 ± 1,0 °C und die Sauerstoffsättigung 95% oder mehr), erhalten Sie einen 15-Scheiben-EPI-Scan mit dem gleichen Slice-Offset wie die anatomische axiale Serie.
3. Überprüfen Sie nach Abschluss jedes Ruhezustandsscans die Qualität mithilfe einer unabhängigen Komponentenanalyse (ICA), um die Daten in räumliche und zeitliche Komponenten zu zerlegen.
4. Rufen Sie mindestens drei hochwertige Ruhezustandsscans ab.

6. Wiederherstellung nach dem Scan

1. Wenn der Scanvorgang abgeschlossen ist, erhöhen Sie Isofluran auf 2% und stoppen Sie die subkutane Dexmedetomidin-Infusion.
2. Entfernen Sie die Tierwiege aus der Magnetbohrung, wickeln Sie das Tier aus und entfernen Sie Ohrbügel, Temperaturfühler, Pulsoximeterclip und die Dexmedetomidinnadel.
3. Injizieren Sie 0,015 mg/kg der verdünnten Atipamezollösung mit einer 1-ml-Spritze mit einer 25-g-Nadel in den Hinterbeinmuskel der Ratte (d. h. eine 300-g-Ratte würde 0,09 ml erhalten).
4. Legen Sie die Ratte wieder in den Hauskäfig auf ein Heizkissen und überwachen Sie, bis das Tier ambulant ist.

Ergebnisse

Nach jedem Ruhezustandsscan wird die Stabilität mithilfe einer unabhängigen Komponentenanalyse (ICA; Beispielskript in Supplementary Files enthalten)bewertet. Abbildung 6 zeigt Beispiele für Komponentenausgaben aus Ruhezustandsscans. Abbildung 6a zeigt eine Signalkomponente aus einem Scan mit hoher Stabilität. Beachten Sie, dass die Komponente räumlich eine hohe Regionalität auf hat. Innerhalb des Zeitverlaufs unterhalb der räumlichen Komponente...

Diskussion

Die Stabilität des Tieres, sowohl physisch als auch physiologisch, ist der Schlüssel, um qualitativ hochwertige Ruhezustandsdaten zu erhalten. Dieses Protokoll erreicht Stabilität, indem es vier verschiedene Phasen der Anästhesie durchgeht. Es ist unerlässlich, dass das Tier die festgelegten physiologischen Schwellenwerte erreicht hat, bevor es in die nächste Phase der Anästhesie übergeht. Da diese Methode auf physiologischen Autoregulationsmechanismen beruht, können einzelne Tiere in jeder Anästhesiephase leicht untersc...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
9.4T MRT	Varian/Bruker		Varian aufgerüstet mit Bruker-Konsole mit Paravision 6.0.1 Software
Air-Oxygen Mixer	Sechrist	Model 3500CP-G
Analysis of Functional NeuroImages (AFNI)	NIMH/NIH	Version AFNI_18.3.03	Frei verfügbar unter: https://afni.nimh.nih.gov/
Animal Cradle	RAPID Biomedical	LHRXGS-00563	Rattenhalter mit Beißstange, Nasenkonus und Ohrbügeln
Tierphysiologische Überwachung & Angusssystem	SAII	Modell 1025	MR-kompatibles System mit Sauerstoffsättigung, Temperatur, Atmung und faseroptischem Pulsoximetrie-Add-on
Antisedan (Atipamezolhydrochlorid)	Patterson Veterinary	07-867-7097	Zoetis, Herstellerartikel #10000449
Keramik MRT-sichere Schere	MRIequip.com	MT-6003
Schermaschine	Patterson Veterinary	07-882-1032	Wahl Touch-Up Trimmer Combo Kit, Hersteller Artikel #09990-1201
Dexmedesed (Dexmedetomidinhydrochlorid)	Patterson Veterinary	07-893-1801	Dechra Veterinary Products, Hersteller Artikel#17033-005-10
Digitales Rektalthermometer Abdeckungen	Medline	MDS9608
FMRIB Software Library	FMRIB	MELODIC Version 3.15	Frei erhältlich bei: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki
Heizkissen	Cara Inc.	Modell 50
Hämostat-Pinzette, gerade	Kent Scientific	INS750451-2
Isofluran	Patterson Veterinary	07-893-1389	Patterson Private Label, Herstellerartikel #14043-0704-06
Isofluran-Verdampfer	VetEquip Inc.
Lab Tape, 3/4"	VWR International	89097-990
Nadeln, 23 Gauge	BD	305145	Kunststoffnabe entfernt
Parafilm Laboratory Film	Patterson Veterinary	07-893-0260	Medline Industries Inc., Herstellerartikel #HSFHS234526A
Planar Surface Coil	Bruker	T12609	2cm
Polyethylen Schlauch	Braintree Scientific	PE50 50FT	0,023" (Innendurchmesser), 0,038" (Außendurchmesser)
Puralube Ophthalmic Salbe	Patterson Veterinary	07-888-2572	Dechra Veterinary Products, Hersteller Artikel #211-38
Sprague Dawley Rats	Charles River	400 SAS SD
steril 0,9% Kochsalzlösung	Patterson Veterinary	07-892-4348	Aspen Vet, Herstellerartikel #14208186
Sterile Alkoholvorbereitungspads	Medline	MDS090735
Chirurgisches Klebeband, 1" (3M Durapore)	Medline	MMM15381Z	3M Healthcare, "breites medizinisches Klebeband
"Chirurgisches weißes Papierband, 1/2" (3M Mikropore)	Medline	MMM15300	3M
Healthcare Spritzen, 1 mL mit 25-Gauge-Nadel	BD	309626
Spritzen, 3 mL	BD	309657
Belüftetes Induktions- und Spülsystem	VetEquip Inc.	942102	2-Liter-Induktionskammer mit aktiver Spülung
		411724	Omega-Durchflussmesser
		931600	Spülwürfel, "Vakuum"
		921616	Nasenkonus, nicht rückatmend