Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Visualisering och kvantifiering av TGFβ/BMP/SMAD-signalering under olika vätskeskjuvningsstressförhållanden med hjälp av Proximity-Ligation-Assay

Published: September 14, 2021 doi: 10.3791/62608
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Institute for Chemistry and Biochemistry, Freie Universität Berlin, 2International Max-Planck Research School for Biology and Computation

Summary

Här upprättar vi ett protokoll för att samtidigt visualisera och analysera flera SMAD-komplex med hjälp av närhet ligatur analys (PLA) i endotel celler utsätts för patologiska och fysiologiska vätska skjuvning stress villkor.

Abstract

Transformering tillväxtfaktor β (TGFβ)/Benmorfogenetiskt protein (BMP) signalering är tätt reglerad och balanserad under utvecklingen och homeostas av vaskulatursystemet Därför resulterar avreglering i denna signalväg i allvarliga vaskulär patologier, såsom pulmonell arteriell hypertoni, ärftlig hemorragisk telangiectasia och ateroskleros. Endotelceller (ECs), som det innersta lagret av blodkärl, utsätts ständigt för vätskeskjuvning stress (SS). Onormala mönster av vätska SS har visat sig förbättra TGFβ/BMP signalering, som, tillsammans med andra stimuli, inducerar aterogenes. I förhållande till detta konstaterades atheroprone, låg laminär SS att förbättra TGFβ/BMP signalering medan ateroprotective, hög laminar SS, minskar denna signalering. För att effektivt analysera aktiveringen av dessa vägar utformade vi ett arbetsflöde för att undersöka bildandet av transkriptionsfaktorkomplex under låga laminära SS- och höga laminära SS-förhållanden med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt pneumatiskt pumpsystem och närhetsligaturanalys (PLA).

Aktiv TGFβ/BMP-signalering kräver bildandet av trimeriska SMAD-komplex som består av två reglerande SMADs (R-SMAD). SMAD2/3 och SMAD1/5/8 för TGFβ respektive BMP-signalering) med en gemensam medlare SMAD (co-SMAD; SMAD4). Med hjälp av PLA som är inriktade på olika underenheter till det trimeriska SMAD-komplexet, dvs.

Användningen av flödesbilder med 6 små parallella kanaler, som kan anslutas i serie, möjliggör undersökning av transkriptionsfaktorkomplexbildning och införande av nödvändiga kontroller.

Arbetsflödet som förklaras här kan enkelt anpassas för studier som riktar sig till närheten av SMADs till andra transkriptionsfaktorer eller till andra transkriptionsfaktorkomplex än SMADs, i olika flytande SS-förhållanden. Arbetsflödet som presenteras här visar ett snabbt och effektivt sätt att studera vätskan SS inducerad TGFβ/BMP signalering i ECs, både kvantitativt och rumsligt.

Introduction

Proteiner i de transformerande tillväxtfaktorerna beta (TGFβ) superfamilj är pleiotropiska cytokiner med en mängd olika medlemmar, inklusive TGFβs, benmorfogenetiska proteiner (BMPs) och Activins1,2. Ligandbindning inducerar bildandet av receptoroligomerer som leder till fosforylering och därmed aktivering av cytosolisk regulatorisk SMAD (R-SMAD). Beroende på ligandernas underfamilj aktiveras olika R-SMADs1,2. Medan TGFβs och Activins huvudsakligen inducerar fosforylering av SMAD2/3, inducerar BMPs SMAD1/5/8 fosforylering. Det finns dock ackumulerande bevis för att BSP och TGFβs/Activins också aktiverar R-SMADs av respektive annan underfamilj, i en process som kallas "lateral signalering"3,4,5,6,7,8 och att det finns blandade SMAD-komplex bestående av både SMAD1/5 och SMAD2/3, medlemmar3,9 . Två aktiverade R-SMADs bildar därefter trimeric komplex med den gemensamma medlaren SMAD4. Dessa transkriptionsfaktorkomplex kan sedan flytta in i kärnan och reglera transkriptionen av målgener. SMADs kan interagera med en mängd olika transkriptionskoaktivatorer och co-repressorer, vilket leder till diversifiering av möjligheterna att reglera målgener10. Avreglering av SMAD-signalering har allvarliga konsekvenser i en mängd olika sjukdomar. I linje med detta kan obalanserad TGFβ/BMP-signalering leda till allvarliga vaskulär patologier, såsom pulmonell artärhytoni, ärftlig hemorragisk telangiectasia eller ateroskleros3,11,12,13,14.

Endotelceller (ECs) bildar det innersta lagret av blodkärl och utsätts därför för skjuvstress (SS), en friktionskraft som utövas av blodets trögflytade flöde. Intressant nog hålls ECs som bor i de delar av vaskulaturen, som utsätts för höga nivåer av enhetliga, laminära SS, i ett homeostatiskt och quiescent tillstånd. Däremot är ECs som upplever låg, icke-enhetlig SS, t.ex. vid bifurcations eller den mindre krökningen av aortabågen, proliferativa och aktiverar inflammatoriska vägar15. I sin tur är platser av dysfunktionella ECs benägna att utveckla åderförkalkning. Intressant nog visar ECs i dessa atheroprone-områden avvikande höga nivåer av aktiverade SMAD2/3 och SMAD1/516,17,18. I detta sammanhang konstaterades förbättrad TGFβ/BMP signalering vara en tidig händelse i utvecklingen av aterosklerotiska skador19 och interferens med BMP signalering konstaterades markant minska vaskulär inflammation, ateroma bildas och tillhörande förkalkning20.

Proximity Ligation Assay (PLA) är en biokemisk teknik för att studera protein-proteininteraktioner in situ21,22. Det förlitar sig på specificiteten hos antikroppar av olika arter som kan binda målproteiner av intresse, vilket möjliggör mycket specifik detektion av endogena proteininteraktioner på encellsnivå. Här måste primära antikroppar binda till sin måletop på ett avstånd av mindre än 40 nm för att möjliggöra detektion23. Därför är PLA mycket fördelaktigt jämfört med traditionella co-immunoprecipitation metoder, där flera miljoner celler behövs för att upptäcka endogena protein interaktioner. I PLA binder artspecifika sekundära antikroppar, kovalent kopplade till DNA-fragment (kallade Plus- och Minussonder), de primära antikropparna och om proteinerna av intresse samverkar kommer Plus- och Minussonderna i närheten. DNA:t blir ligerat i följande steg och förstärkningen av det cirkulära DNA:t möjliggörs. Under förstärkning binder fluorescerande märkta kompletterande oligonukleotider till det syntetiserade DNA, vilket gör att dessa proteininteraktioner kan visualiseras genom konventionell fluorescensmikroskopi.

Protokollet som beskrivs här gör det möjligt för forskare att kvantitativt jämföra antalet aktiva SMAD-transkriptionskomplex vid ateroprotektiva och atheroprone SS-villkor in vitro med HJÄLP AV PLA. SS genereras via ett programmerbart pneumatiskt pumpsystem som kan generera laminärt enkelriktat flöde av definierade nivåer och möjliggör stegvisa ökningar av flödeshastigheter. Denna metod gör det möjligt att upptäcka interaktioner mellan SMAD1/5 eller SMAD2/3 med SMAD4, liksom blandade R-SMAD-komplex. Det kan enkelt utökas för att analysera interaktioner mellan SMADs med transkriptionella medregulatorer eller till andra transkriptionsfaktorkomplex än SMADs. Figur 1 visar de viktigaste stegen i protokollet som presenteras nedan.

Figure 1
Bild 1: Schematisk representation av det beskrivna protokollet. (A) Celler som sås i 6-kanalsrutschbanor utsätts för skjuvspänning med ett pneumatiskt pumpsystem. B) Fasta celler används för PLA-experiment eller för kontrollförhållanden. (C) Bilder av PLA-experiment förvärvas med ett fluorescensmikroskop och analyseras med hjälp av ImageJ-analysprogramvara. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellkultur och vätskeskjuvning stress exponering

OBS: Human umbilical ven ECs (HUVECs) användes som ett exempel för att studera SS inducerad interaktion av SMADs. Protokollet som beskrivs nedan kan tillämpas på alla SS-responsiva celltyper.

  1. Täck 6-kanalsrutschbanan med 0,1% svinhudgelatin i PBS i 30 min vid 37 °C.
  2. Frö HUVECs i förbelagda 6-kanalsbilder med en densitet av 2,5 x 106 celler per ml i 30 μL M199 fullt medium.
    OBS: Mer information om hur du dirigerar celler i flödesbilden finns i referens24.
  3. Låt cellerna klibba i 1 h vid 37 °C i en fuktad inkubator.
  4. Tillsätt 60 μL förvärmt M199 fullt medium till var och en av reservoarerna.
  5. Kultur i 2 dagar, med ett mjukt medium utbyte en gång om dagen, vid 37 °C i en fuktad inkubator.
    1. Aspirera reservoarerna helt, tillsätt 120 μL förvärmt M199 fullt medium i en av reservoarerna och aspirera från andra sidan.
    2. Tillsätt 60 μL förvärmt M199 fullt medium till båda reservoarerna.
  6. Montera och starta flödesuppsättningen enligt referens25.
    1. Montera slangar på fluida enheter. Här används silikonrör med en diameter av 0,8 mm respektive 1,6 mm för att applicera skjuvspänning på 1 dyn/cm2 respektive 30 dyn/cm2.
      OBS: Materialet och slanglängden bör förbli konstant, eftersom förändringar kan påverka den resulterande skjuvningsstressen. I allmänhet kan andra kombinationer av pumpsystem och slangar användas, så länge den resulterande skjuvningsstressen är känd och pumpen skapar ett stabilt laminärt flöde.
    2. Fyll reservoarerna med en lämplig mängd förvärmt M199 fullt medium (minst 10 ml).
    3. Anslut fluida enheter med slangen till pumpsystemet och utför en förkörning utan celler för att balansera mediet och för att avlägsna eventuell återstående luft25.
    4. Anslut de enskilda kanalerna på 6-kanalsbilden till varandra med hjälp av seriell anslutningsslang. Den första och sista kanalen på bilden kommer att anslutas till slangen som monteras i punkt 1.6.1 (se figur 1A för ett schema). Var försiktig så att du inte för in någon luft i systemet eftersom detta allvarligt kan skada cellerna. Mer information om den seriella anslutningen finns i reference26.
    5. För exponering av celler för höga nivåer av skjuvspänning (>20 dyn/cm2), använd en rampfas, dvs. öka skjuvningsstressen stegvis med anpassningsfaser. Steg kan ställas in i steg om 5 dyn/cm2 per 30 min.

2. Fixering

  1. Lossa glidningar från pumparna efter den flytande SS-exponeringen. Använd klämmor på slangen vid detacheing, för att undvika det medelstora spillet i inkubatorn.
  2. Överför omedelbart flödesrutschbanor på is, medan den återstående slangen lossnar sekventiellt. När du tar bort slangen från reservoarer bör behållaren på andra sidan hållas stängd med ett finger för att undvika att fånga luftbubblor i kanalen. Detta kan störa fixeringsstegen.
  3. Håll cellerna på is, aspirera mediet försiktigt från reservoarerna men inte från kanalen där cellerna bor. Tvätta därefter prover med kall steril PBS (4 °C) med tre gånger kanalvolymen (90 μL). Tillsätt PBS i en reservoar och aspirera försiktigt från den andra behållaren. Upprepa det här steget i var och en av de 6 kanalerna per bild.
    OBS: För alla tvätt- och inkubationssteg tillsätts respektive lösning i en av reservoarerna vilket leder till ett utbyte av lösningar i kanalen. För att möjliggöra fullständig ersättning av lösningar i kanalen aspireras överskottslösningen sedan från den andra behållaren. Lösningen högst upp på cellerna i kanalen tas inte bort. Cellerna får inte torka när som helst. Därför är det viktigt att tvätta försiktigt utan att någon luftbubbla införs i bilderna.
  4. Fixera cellerna genom att tillsätta 90 μL buffrad 4% PFA-lösning i samma behållare där PBS tillsattes i förväg och på samma sätt aspirera vätskan från den andra behållaren. Upprepa det här steget i varje kanal i varje bild. Efter tillsats av PFA-lösning överför du proverna från is till rumstemperatur (RT) och inkuberar i 20 minuter.
    VARNING: PFA är giftigt och bör hanteras varsamt. Använd handskar och arbeta under en rökhuv.
  5. Tvätta cellerna 3x med PBS (RT) genom att lägga den i en reservoar och aspirera försiktigt från den andra behållaren. Töm bara reservoarerna, se till att inte torka ut kanalen. Upprepa det här steget för var och en av de 6 kanalerna per bild.
  6. Släck PFA-fixeringen genom att tillsätta 90 μL omgivande 50 mM ammoniumklorid i PBS i en av reservoarerna. Aspirera överskottslösning från den andra behållaren. Upprepa för varje kanal i bilden. Inkubera proverna i 10 min på RT.
  7. Tvätta enligt beskrivningen i steg 2.5.
    OBS: Vid denna tidpunkt kan proverna förvaras vid 4 °C över natten, eller så kan protokollet omedelbart fortsätta med blockering och primär antikroppskubation (se steg 3).

3. Blockering och primär antikroppskubation

  1. För att permeabilisera cellerna, tillsätt 90 μL 0,3% Triton-X-100 i PBS i en tömd reservoar och aspirera från den andra behållaren för varje kanal. Inkubera i 10 min på RT.
  2. Tvätta enligt beskrivningen i steg 2.5.
  3. Tillsätt 90 μL steril PLA-blockeringslösning i en reservoar i en kanal och aspirera från den andra sidan. Upprepa det här steget för varje kanal. Blockera i 1 h vid 37 °C i en fuktad kammare.
    1. För att göra en fuktad kammare, använd en 10 cm skål med våt vävnad förseglad med vaxfilm och placera skålen i inkubatorn. Alternativt kan andra fuktkammareformat användas som ger en fuktig atmosfär.
      OBS: Alternativt kan självtillverkad blockeringslösning användas (t.ex. 3% (w/v) BSA i PBS, sterilt filtrerat).
  4. Förbered primära antikroppar (1:100) i PLA-antikroppsdluent. Förbered 30 μL av lösningen per kanal. Tillsätt både primära antikroppar samtidigt och virvel.
    OBS: Alternativt kan självtillverkad antikroppsdluent användas (t.ex. 1% (w/v) BSA i PBS). Antikroppar som används här är kombinationer av SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 och phospho-SMAD1/5-SMAD4. Detaljerad information finns i materialförteckningen.
  5. Före applicering av primära antikroppar, aspirera blockeringslösningen från reservoarerna och även försiktigt från kanalen. Pipetter 30 μL av den primära antikroppslösningen omedelbart in i den tomma kanalen genom att luta kanalen samtidigt som lösningen tillsätts.
    OBS: Utför avlägsnandet av blockeringslösningen och tillsätt antikroppslösningen kanal för kanal för att säkerställa att cellerna inte torkar ut däremellan.
  6. Inkubera prover med de primära antikropparna över natten i fuktade kammare vid 4 °C.
    OBS: Inkubationen kan också utföras i 1 h vid rumstemperatur, om du är intresserad av att fortsätta med följande steg samma dag.

4. PLA-sondinkubation

OBS: För alla steg i avsnitt 4.1-7.3 lagras tvättbuffertarna A och B vid 4 °C och måste värmas upp till RT före användning.

  1. Späd PLA-sonder (+)-mus och (-)-kanin till 1:5 i PLA-antikroppsdluentlösning (eller 1% BSA) lösning. Förbered 30 μL per kanal.
  2. Tvätta proverna 2x i 5 minuter med 90 μL av tvättbufferten A vid RT genom att tillsätta den i en av reservoarerna och aspirera försiktigt från den andra behållaren. Upprepa det här steget för var och en av de 6 kanalerna per bild.
  3. Aspirera tvättbufferten A försiktigt och tillsätt 30 μL PLA-sondlösning (beredd i steg 4.1), liknande tillsats av primära antikroppar i steg 3.5.
  4. Inkubera prover i 1 h vid 37 °C i en fuktad kammare.

5. Ligatur

  1. Tvätta proverna 2x i 5 minuter med 90 μL av tvättbufferten A vid RT enligt beskrivningen i 4.2.
  2. Förbered en utspädning på 1:5 av ligaturbufferten i avjoniserat vatten. Använd denna buffert för att späda ut ligasenzymet till 1:40 (på is). Använd 30 μL per kanal.
  3. Aspirera tvättbufferten A helt och tillsätt ligaturlösningen enligt beskrivningen i 3.5.
  4. Inkubera prover i 30 minuter vid 37 °C i en fuktad kammare.

6. Förstärkning

  1. Tvätta proverna 2x i 2 minuter med hjälp av 90 μL tvättbuffert A vid RT enligt beskrivningen i 4.2.
  2. Förbered förstärkningsbufferten genom att späda ut den 1:5 i avjoniserat vatten och använd den för att späda polymerasenzymet till 1:80 (på is). Skydda mot ljus. Förbered 30 μL per kanal.
  3. Aspirera tvättbufferten A helt och tillsätt omedelbart den beredda förstärkningslösningen i den tomma kanalen, enligt beskrivningen i 3.5. Inkubera prover i 100 min vid 37 °C i en fuktad kammare.

7. Montering

  1. Tvätta proverna 2x i 10 minuter med 90 μL tvättbuffert B vid RT enligt beskrivningen i 4.2. Tillsätt DAPI (1:500) från 1 mg/ml lagerlösning (i avjoniserat vatten) i den första tvätten för att fläcka kärnor. Torka inte kanalen.
  2. Späd tvättbuffert B i avjoniserat vatten (1:10) och tvätta 1x med 90 μL 0,1x buffert B-lösning enligt beskrivningen i 4.2.
  3. Aspirera tvättbufferten B helt och tillsätt omedelbart 2-3 droppar av vätskemonteringsmediet i en reservoar. Fördela den i kanalen genom att luta bilden. Förvara proverna vid 4 °C i en fuktad miljö tills de avbildningar.

8. Bildförvärv

  1. Skaffa bilder med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Se till att respektive filter som passar de fluorescerande PLA-sonderna finns tillgängliga.
    OBS: Det är fördelaktigt att använda ett konfokalt mikroskop, om möjligt, eftersom erhållna PLA-fläckar är mer definierade. Detta stöder också ytterligare bildbehandling och dataanalys.

9. Bildanalys och kvantifiering med ImageJ/FIJI

  1. Bearbeta exporterade bilder (.tiff) med ett bildbehandlingsprogram, till exempel ImageJ27.
    OBS: Alla skript som används i den här studien och som är nödvändiga för automatisk räkning av cellulära, nukleära och alla PLA-händelser (per cell) finns i en GitHub-lagringsplats: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Utför statistisk analys med valfritt lämpligt program eller verktyg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har tidigare använt PLA för att upptäcka interaktioner av olika SMAD-proteiner3 och analyserat skjuvstress inducerade förändringar i SMAD fosforylering28.

Här kombinerades båda metoderna med protokollet som beskrivs ovan. HUVECs utsattes för skjuvning stress av 1 dyn/cm2 och 30 dyn/cm2 och analyseras för interaktioner av SMAD transkription faktorer. Vi visar att jämfört med den höga skjuvningsstressen (30 dyn/cm2) leder den låga skjuvningsstressen (1 dyn/cm2) till en betydande ökning av SMAD1-SMAD2/3 interaktioner, de så kallade blandade SMAD-komplexen i båda, cytosolen och atomkärnorna i analyserade celler (figur 2A, nedre panelen). PLA-händelser är synliga som distinkta fläckar i båda proverna, och man kan skilja mellan cytosula och nukleära händelser med hänvisning till DAPI-färgning (figur 2A, övre panelen). Antikroppskontroller, där endast ett av båda primära antikropparna men fortfarande båda PLA-sonderna inkuberades, visade däremot försumbart antal PLA-signaler (figur 2B). Således kan man dra slutsatsen att experimentet var framgångsrikt.

Figure 2
Figur 2: SMAD2/3-SMAD1 PLA jämför olika antikroppskoncentrationer. (A) Konfokal fluorescensbilder och kvantifiering av SMAD2/3-SMAD1-PLA i HUVECs som exponerats för 24 timmar angivna SS-nivåer. Förhållandet mellan antikroppar: 1:100. (B) Konfokala bilder av enstaka antikroppskontroller för PLA i A. C) Konfokal fluorescensbilder och kvantifiering av SMAD2/3-SMAD1-PLA i HUVECs som exponerats för 24 timmar angivna SS-nivåer. Förhållandet mellan antikroppar: 1:50. Skalstänger för A-C: 20 μm och 10 μm i zoom in. Dyne är lika med dyn/cm2. Antikroppar som användes var kanin anti-SMAD2/3 och mus anti-SMAD1 (se tabell över material). För varje villkor användes 5 slumpmässiga områden längs mitten av flödeskanalen för bildförvärv. N=1 biologisk replikat. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

För att visa hur olika koncentrationer av antikroppar förändrar PLA-resultat utfördes samma experiment med en 1:50 istället för en 1:100 utspädning av antikroppar. Under dessa förhållanden resulterar dubbelt så mycket antikropp i mer än fyrfaldigt högre PLA-signaler per cell (jämför figur 2A och figur 2C). Skillnaden i signaler mellan 1 dyn/cm2 och 30 dyn/cm2 minskar när en högre antikroppskoncentration används och statistisk signifikans går förlorad för de totala och cytosoliska PLA-händelserna (figur 2A, nedre panelen; Bild 2C, nedre panelen). Detta kan bero på signalens kolescens och problem med att särskilja PLA-händelser. Om sådan ackumulering av signaler sker bör antikroppskoncentrationerna minskas.

Vidare visade vi att egentillverkade buffertar för blockering och antikroppsutspädning kan användas som ett alternativ för kommersiella buffertar som ingår i situ PLA-kit. PLA-händelser per cell jämfördes för SMAD1-SMAD2/3 (figur 3A jämfört med figur 3D), SMAD2/3-SMAD4 (figur 3B jämfört med figur 3E) och pSMAD1/5-SMAD4 (figur 3C jämfört med figur 3F) komplex under 1 dyn/cm2 och 30 dyn/cm2 med antingen kommersiella lösningar (figur 3A-C) eller självtillverkade BSA-baserade lösningar (figur 3A-C) eller självtillverkade BSA-baserade lösningar (figur 3A-C) eller självtillverkade BSA-baserade lösningar (figur 3A-C) eller självtillverkade BSA-baserade lösningar (figur 3A-C) eller självtillverkade BSA-baserade lösningar (figur 3A-C) eller självtillverkade BSA-baserade lösningar (figur 3A-C) eller självtillverkade BSA-baserade lösningar (figur 3A-C) eller självtillverkade BSA-baserade lösningar (figur 3A-C) eller självtillverkade BSA-baserade lösningar (figur 3A-C) eller självtillverkade BSA-baserade lösningar ). Kvantifieringar för både kommersiella och självtillverkade spädnings- och blockeringslösningar visar samma trend av PLA-signaler i cytosoliska och nukleära områden. Det totala antalet PLA-händelser per cell är dock högre när du använder kommersiella lösningar (figur 3A-C, lägre paneler jämfört med figur 3D-F, nedre paneler).

Figure 3
Figur 3: PLA-experiment som jämför kommersiella och självtillverkade antikroppsbuffertar. Konfokala bilder (övre delen av varje panel) och kvantifiering (nedre delen av varje panel) av olika SMAD-SMAD PLA i HUVECs som utsätts för 24 timmars angivna skjuvningsstressnivåer. (A-C) Kommersiella buffertar (se Materialförteckning). (D-F) Egentillverkade buffertar (3% BSA i PBS för blockering, 1 % BSA i PBS för antikroppsutspädning). Alla primära antikroppar späddes ut 1:100. Skalstång, 20 μM (10 μM för inzoomning). Statistisk signifikans beräknades med dubbelsidigt t-test. ns - icke-signifikant, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. Värden avbildas som medelvärde + SEM. Dyne är lika med dyn/cm2. Antikroppar som användes var kanin anti-SMAD2/3, mus anti-SMAD1, kanin anti-phospho SMAD1/5 och mus anti-SMAD4 (se tabell över material). För varje villkor användes 5 slumpmässiga områden längs mitten av flödeskanalen för bildförvärv. N=1 biologisk replikat. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Vi inkluderade också ett exempel för ett misslyckat PLA-experiment. Här användes en kombination av SMAD2/3-SMAD4 antikroppar där SMAD4 antikroppen inte var lämplig för att utföra immunofluorescens experiment. Jämfört med enstaka antikroppskontroller observerades ingen ökning av fläckar i vare sig proverna 1 dyn/cm2 eller 30 dyn/cm2 (figur 4A jämfört med figur 4B). Eftersom bildandet av SMAD2/3-SMAD4-komplex framkallas av skjuvstress (se figur 3B,E), kan slutsatsen dras att detta PLA-experiment misslyckades. Detta belyser vikten av att välja rätt antikroppskombinationer för att upptäcka PLA-händelser, eftersom orientering och avstånd för bundna antikroppar kan vara avgörande för framgångsrik glödgning av oligonukleotidsonderna.

Figure 4
Bild 4: Exempel på misslyckat PLA-experiment. Konfokala bilder, skalstång: 20 μm och 10 μm i zoom in. (A) SMAD2/3-SMAD4 PLA. B) Enstaka antikroppskontroller. Antikroppar som användes var mus anti-SMAD2/3 och kanin anti-SMAD4 (se tabell över material). Dyne är lika med dyn/cm2. För varje villkor användes 5 slumpmässiga områden längs mitten av flödeskanalen för bildförvärv. N=1 biologisk replikat. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det PLA-baserade protokollet som beskrivs här erbjuder ett effektivt sätt att bestämma närheten till två proteiner (t.ex. deras direkta interaktion) i ECs som utsätts för skjuvstress med kvantitativ och rumslig upplösning. Genom att använda flödesbilder med flera parallella kanaler kan flera olika proteininteraktioner undersökas samtidigt i celler under identiska mekaniska förhållanden. Däremot använder specialbyggda flödeskammare ofta en enda kanal som är byggd kring ett glasöverdrag, vilket endast skulle tillåta ett enda PLA-experiment utan nödvändiga kontroller per rutschkana och pump. Även om detta protokoll fokuserar på detektion av SMAD-interaktioner, kan det anpassas för att upptäcka andra proteininteraktioner. Analys av resultaten måste dock göras noggrant eftersom två proteiner också kan finnas i närheten utan att bilda komplex. Om det önskas bestämda uttalanden om interaktioner mellan proteiner bör PLA-experiment kompletteras med ytterligare metoder såsom samtidiga immunprecipiteringar. Dessutom kan PLA inte användas för att detektera protein-proteininteraktionen i levande celler eftersom prover måste fastställas för efterföljande antikroppsbindning och DNA-förstärkningssteg.

För framgångsrik detektion av proteininteraktioner av PLA är det mest kritiska steget att välja en kombination av primära antikroppar som uppfyller flera kriterier: 1) De antikroppar som detekterar de enskilda proteinpartnerna måste genereras i olika arter (t.ex. mus eller kanin) eftersom de sekundära antikropparna är artspecifika; idealiskt, antikroppar testades redan framgångsrikt av konventionella immunofluorescens mikroskopi. 2. Avståndet mellan epitopbundna antikroppar bör vara <40 nm23. (3) Eftersom affiniteterna för antikroppsepiltopbindning kan skilja sig åt, måste den slutliga koncentrationen av använda antikroppar justeras för varje experimentell inställning, som visas här (figur 2A, nedre panelen jämfört med figur 2C, nedre panelen). Därför, om mycket få men specifika PLA-händelser upptäcks, kan det vara värt att öka mängden antikroppar som används. Detta måste dock noggrant titreras för att undvika övermättnad och ospecificerade bindande händelser. Dessutom måste antikroppskoncentrationen som används i kontrollprover matcha den koncentration som används i PLA-proverna.

När det gäller alla andra biokemiska analyser är lämpliga kontroller oumbärliga i PLA. Ospecificerad bindning av de använda antikropparna kan till exempel leda till PLA-signaler som härrör från endast en primär antikropp. Därför bör viktiga antikroppskontroller för PLA-experiment omfatta tillsats av endast ett av de två primära antikropparna men båda PLA-sonder (Plus och Minus). Dessutom kan kontroller utan tillsats av antikroppar användas för att bestämma ospecificerad bindning av PLA-sonderna till provet. I allmänhet bör dessa tekniska kontroller inte ge några få PLA-signaler. Om flera signaler observeras bör koncentrationen av den primära antikroppen som används och dess specificitet omprövas. Dessutom är det användbart att inkludera en positiv biologisk bekämpning, om möjligt. I protokollet som beskrivs ovan kan detta vara stimulering med en BMP ligand som är känd för att inducera fosforylering av SMADs och därför trimeric komplexa bildandet med SMAD4.

För PLA-experiment rekommenderas normalt att använda celler som är 50-70% sammanflöde, eftersom detta förenklar penetrationen av reagenser. Men när vi utför experiment med ECs skulle vi strikt argumentera mot detta, förutom om halvkonfluens är en del av den experimentella uppsättningen. In vivo ECs bildar monolayers med snäva cell-till-cell korsningar, som är väsentliga för EC homeostas och mechano-transduction29. Därför kan experiment på icke-sammanflöde av ECs ge upphov till falska resultat. Dessutom är icke-sammanflytande celler mer benägna att lossna från flödeskanaler om höga nivåer av skjuvstress används under experimentet. Vi rekommenderar att så celler (2-2,5 x 106 celler/ ml, se protokoll steg 1.2) två till tre dagar före experimentell start eftersom EC monolayers behöver tid att bilda och utveckla mogna korsningar. Därför rekommenderar vi inte att man sår ett högre antal celler (>2,5 x 106 celler/ml) i flödeskanaler bara en dag före experimentet för att uppnå ett sammanflödesmonolayer.

Även om det finns olika flytande monteringsmedier som innehåller DAPI är det värt att inkludera ett separat DAPI-färgningssteg och montera cellerna med flytande monteringsmedium utan DAPI, åtminstone om polymerbaserade flödesbilder används. Detta förhindrar tunga bakgrundssignaler vid bildförvärv. Bilder bör förvärvas från positioner i kanalcentret snarare än kanterna eftersom skjuvningsstress är inhomogen vid kanalväggarna. Vi rekommenderar att du tar minst 5-10 bilder per biologisk replikat och tillstånd av slumpmässiga områden längs centrumregionen. 3 eller fler biologiska replikat används normalt för att få statistisk relevans. För bildanalys rekommenderar vi att du använder makrofunktionen ImageJ/FIJI. I protokollet ovan nämnde vi ett ImageJ-makro som är lämpligt att räkna cytosoliska och nukleära PLA-händelser baserade på DAPI-färgning. Användare bör vara medvetna om att parametrar som partikelstorlek måste justeras beroende på kärnstorlek eller större / mindre PLA-prickar. Makrot sparar tröskelvärdet PLA-bilder och masker som ska jämföras med råa bilder för att utvärdera specificiteten hos PLA-signaldetektering.

Sammanfattningsvis tillåter metoden som presenteras här snabb och effektiv rumslig och kvantitativ analys av transkription faktor komplex bildandet vid ateroprotective och atheroprone SS villkor. Det kommer att göra det möjligt för forskare att ytterligare dechiffrera effekterna av SMAD-komplexbildning i aterogenes och kärlsjukdom i allmänhet. Det kan dessutom anpassas för att undersöka konsekvenserna av närheten av olika proteiner i dessa vaskulär patologier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. Maria Reichenbach och Dr. Christian Hiepen för deras stöd för flödessystemet och Eleanor Fox och Yunyun Xiao för att de kritiskt läste manuskriptet. P-L.M. finansierades av den internationella Max Planck Research School IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK fick finansiering av DFG-SFB1444. Figur 1 skapades med BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Slide VI 0.4 ibidi 80606 6-channel slide
Ammonium Chloride Carl Roth K298.1 Quenching
Bovine Serum Albumin Carl Roth 8076.4 Blocking
DAPI Sigma Aldrich/ Merck D9542 Stain DNA/Nuclei
DPBS PAN Biotech P04-53500 PBS
Duolink In Situ Detection Reagents Green Sigma Aldrich/ Merck DUO92014 PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS Sigma Aldrich/ Merck DUO92004 MINUS probe
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma Aldrich/ Merck DUO92002 PLUS probe
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence Sigma Aldrich/ Merck DUO82049 PLA wash buffers A and B
Endothelial Cell Growth Supplement Corning supplement for medium (ECGS)
Fetal calf Serum supplement for medium
FIJI Image Analysis software
Formaldehyde solution 4% buffered KLINIPATH/VWR VWRK4186.BO1 PFA
Full medium M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +  25 µg/mL Hep +   50 µg/mL ECGS
Gelatin from porcine skin, Type A Sigma Aldrich G2500 Use 0.1% in PBS for coating of flow channels
GraphPad Prism v.7 GarphPad Statistical Program used for the Plots and statistical calculations
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma Aldrich H4784-250MG supplement for medium (Hep)
HUVECs
ibidi Mounting Medium ibidi 50001 Liquid mounting medium
ibidi Pump System ibidi 10902 pneumatic pump
Leica TCS SP8 Leica confocal microscope
L-Glutamin 200mM PAN Biotech P04-80100 supplement for medium (L-Glu)
Medium 199 Sigma Aldrich M2154 Base medium
mouse anti- SMAD1 Antibody Abcam ab53745 Suited for PLA
mouse anti- SMAD2/3 Antibody BD Bioscience 610843 Not suited for PLA in combination with CST 9515
mousee anti- SMAD4 Antibody Sanata Cruz Biotechnology sc-7966 Suited for PLA
Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml PAN Biotech P06-07100 supplement for medium (P/S)
Perfusion Set WHITE ibidi 10963 Tubings used for 1 dyn/cm2
Perfusion Set YELLOW and GREEN ibidi 10964 Tubings used for 30 dyn/cm2
rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody Cell Signaling Technologies 9516 Suited for PLA
rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody Cell Signaling Technologies 8685 Suited for PLA
rabbit anti- SMAD4 Antibody Cell Signaling Technologies 9515 Not suited for PLA in combination with BD 610843
Serial Connector for µ-Slides ibidi 10830 serial connection tubes
Triton X-100 Carl Roth 6683.1 Permeabilization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition. Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).
  2. Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).
  3. Hiepen, C., et al. BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGFβ responses and altered cell mechanics. PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).
  4. Hildebrandt, S., et al. ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
  5. Goumans, M. J., et al. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors. The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).
  6. Goumans, M. J., et al. Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling. Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).
  7. Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth. Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).
  8. Ramachandran, A., et al. TGF-β uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition. eLife. 7, 31756 (2018).
  9. Flanders, K. C., et al. Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).
  10. Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. Dijke, P. T., Heldin, C. -H. , Springer Netherlands. Dordrecht. 277-293 (2006).
  11. Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).
  12. Cai, J., Pardali, E., Sánchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).
  13. Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. Deregulated TGF-β/BMP signaling in vascular malformations. Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).
  14. MacCarrick, G., et al. Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management. Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).
  15. Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
  16. Min, E., et al. Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling. bioRxiv. , 691980 (2019).
  17. Zhou, J., et al. BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).
  18. Zhou, J., et al. Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).
  19. van Dijk, R. A., et al. Visualizing TGF-β and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation. Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).
  20. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).
  21. Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
  22. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  23. Alam, M. S. Proximity Ligation Assay (PLA). Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58 (2018).
  24. Application Note 03: Growing Cells in µ-Channels. ibidi. , Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf (2012).
  25. Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi. , Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf (2019).
  26. ibidi. Application Note 31: Instructions µ-Slide VI 0.4. ibidi. , (2013).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Reichenbach, M., et al. Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-β induced osteogenic target genes. Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).
  29. Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. It takes two to tango: Endothelial TGFβ/BMP signaling crosstalk with mechanobiology. Cells. 9 (9), 1965 (2020).

Tags

Biokemi nummer 175 vätskeskjuvningsstress närhetsligaggationsanalys endotelceller SMADs BMP TGFβ ateroskleros flöde
Visualisering och kvantifiering av TGFβ/BMP/SMAD-signalering under olika vätskeskjuvningsstressförhållanden med hjälp av Proximity-Ligation-Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mendez, P. L., Obendorf, L., Knaus,… More

Mendez, P. L., Obendorf, L., Knaus, P. Visualization and Quantification of TGFβ/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay. J. Vis. Exp. (175), e62608, doi:10.3791/62608 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter