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Methodenartikel

Ein Ex-vivo-Gehirnschnittmodell zur Untersuchung und Bekämpfung des metastasierenden Tumorwachstums von Brustkrebs im Gehirn

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DOI:

10.3791/62617

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22. September 2021

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Drexel University College of Medicine, 2Department of Pharmacology and Physiology, Drexel University College of Medicine, 3Department of Radiation Oncology, Thomas Jefferson University, 4Sidney Kimmel Cancer Center, Thomas Jefferson University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir führen ein Protokoll zur Messung der Echtzeit-Arzneimittel- und Strahlungsreaktion von metastasierenden Zellen des Brustkrebsgehirns in einem organotypischen Gehirnschnittmodell ein. Die Methoden bieten einen quantitativen Assay, um die therapeutischen Wirkungen verschiedener Behandlungen auf Hirnmetastasen von Brustkrebs in einer Ex-vivo-Weise innerhalb der Mikroumgebungsschnittstelle des Gehirns zu untersuchen.

Zusammenfassung

Hirnmetastasen sind eine schwerwiegende Folge von Brustkrebs bei Frauen, da diese Tumoren schwer zu behandeln sind und mit schlechten klinischen Ergebnissen verbunden sind. Präklinische Mausmodelle des mikrostatischen Wachstums des Brustkrebsgehirns (BCBM) sind nützlich, aber teuer, und es ist schwierig, lebende Zellen und die Invasion von Tumorzellen innerhalb des Gehirnparenchyms zu verfolgen. Hier wird ein Protokoll für Ex-vivo-Hirnschnittkulturen von xenotransplantierten Mäusen vorgestellt, das intrakraniell injizierte Hirntumor-Gehirn-suchende klonale Unterlinien enthält. MDA-MB-231BR Luciferase-markierte Zellen wurden intrakraniell in das Gehirn von Nu / Nu-weiblichen Mäusen injiziert, und nach der Tumorbildung wurden die Gehirne isoliert, geschnitten und ex vivo kultiviert. Die Tumorschnitte wurden aufgenommen, um Tumorzellen zu identifizieren, die Luciferase exprimieren und ihre Proliferation und Invasion im Gehirnparenchym für bis zu 10 Tage zu überwachen. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll die Verwendung der Zeitraffermikroskopie, um das Wachstum und das invasive Verhalten der Tumorzellen nach der Behandlung mit ionisierender Strahlung oder Chemotherapie abzubilden. Die Reaktion von Tumorzellen auf Behandlungen kann durch Live-Imaging-Mikroskopie, Messung der Biolumineszenzintensität und Durchführung von Histologie an der Gehirnscheibe, die BCBM-Zellen enthält, visualisiert werden. Daher kann dieses Ex-vivo-Slice-Modell eine nützliche Plattform für die schnelle Prüfung neuartiger therapeutischer Wirkstoffe allein oder in Kombination mit Bestrahlung sein, um Medikamente zu identifizieren, die auf das metastatische Wachstum des Gehirns eines einzelnen Patienten in der Mikroumgebung des Gehirns abzielen.

Einleitung

Brustkrebs-Hirnmetastasen (BCBM) entstehen, wenn sich Zellen vom primären Brusttumor auf das Gehirn ausbreiten. Brustkrebs ist nach Lungenkrebs die zweithäufigste Ursache für Hirnmetastasen, wobei bei 10-16% der Patienten Metastasen auftreten1. Leider bleiben Hirnmetastasen unheilbar, da >80% der Patienten innerhalb eines Jahres nach ihrer Gehirnmetastasendiagnose sterben und ihre Lebensqualität aufgrund neurologischer Funktionsstörungen beeinträchtigtist 2. Es ist dringend notwendig, wirksamere Behandlungsmöglichkeiten zu finden. Einschichtige zweidimensionale oder dreidimensionale Kulturmodelle sind die am häufigsten verwendeten Methoden zur Prüfung von Therapeutika im Labor. Sie ahmen jedoch nicht die komplexe BCBM-Mikroumgebung nach, die ein Haupttreiber für den Tumorphänotyp und das Tumorwachstum ist. Obwohl diese Modelle nützlich sind, erfassen sie nicht die komplexen Tumor-Stroma-Interaktionen, die einzigartigen metabolischen Anforderungen und die Heterogenität der Tumore3. Um Tumor-Stroma-Interaktionen und Mikroumgebungsheterogenität genauer zu rekapitulieren, haben unsere Gruppe und andere begonnen, organotypische Hirnmetastasen-"Slice"-Kulturen mit patientenabgeleiteten Tumorzellen (primär oder metastasierend) oder Krebszelllinien 4,5,6 zu erzeugen. Im Vergleich zu klassischen In-vitro-Systemen kann dieses kurzfristige Ex-vivo-Modell relevantere Bedingungen für das Screening neuer Therapeutika vor der präklinischen Bewertung in großen Tierkohorten bieten.

Ex-vivo-Modelle wurden konstruiert und erfolgreich eingesetzt, vor allem zur Identifizierung erfolgreicher Behandlungen verschiedener Krebsarten. Sie benötigen wenige Tage der Beurteilung und können zusätzlich auf ein patientenspezifisches Arzneimittelscreening zugeschnitten werden. Zum Beispiel haben menschliche Blasen- und Prostatakrebs-Ex-vivo-Gewebe eine dosisabhängige Anti-Tumor-Reaktion von Docetaxel und Gemcitabin7 gezeigt. Ähnliche kolorektale Karzinome ex vivo Gewebe wurden entwickelt, um Chemotherapeutika Oxaliplatin, Cetuximab und Pembrolizumab8 zu screenen. Diese Anwendung wurde bei Bauchspeicheldrüsenkrebs unter Berücksichtigung der wesentlichen Wechselwirkung zwischen der stromalen Umgebung und den genotypischen und phänotypischen Merkmalen des duktalen Pankreas-Adenokarzinoms 9,10 weit verbreitet. Darüber hinaus wurden solche organotypischen Modelle für ähnliche Screenings bei Kopf-, Hals-, Magen- und Brusttumorenentwickelt 11,12.

Hier wird ein Ex-vivo-Gehirnschnittmodell von xenotransplantierten metastasierenden Tumorzellen des Brustkrebses in ihrer Mikroumgebung erzeugt. Mäuse wurden intrakraniell mit Brustkrebs Gehirn metastasieren Gehirn trophische MDA-MB-231BR Zellen13 in der Großhirnrinde Parietallappen - eine häufige Stelle der TNBC-Metastasierung14,15 und erlaubt, Tumore zu entwickeln. Aus diesen xenotransplantierten Tieren wurden Hirnschnitte erzeugt und ex vivo als organotypische Kulturen beibehalten,wie beschrieben 16,17. Dieses neuartige Ex-vivo-Modell ermöglicht die Analyse des Wachstums der BCBM-Zelle innerhalb des Gehirnparenchyms und kann verwendet werden, um therapeutische Wirkstoffe und Strahlungseffekte auf Tumorzellen in der Mikroumgebung des Gehirns zu testen.

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Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom Drexel University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und folgt den Tierpflegerichtlinien. Nu/Nu athymische weibliche Mäuse (6-8 Wochen alt) wurden in dieser Studie verwendet.

1. Intrakranielle Injektion von Tumorzellen

  1. Sterilisieren Sie alle Geräte (Pinzette, Schere, Nähschere, Handbohrmaschine) während eines trockenen Zyklus eines Autoklaven für bis zu 45 Minuten in Sterilisationsbeuteln, einschließlich einer Sterilisationsanzeige. Wenn Sie Operationen an mehreren Tieren durchführen, sterilisieren Sie Werkzeuge zwischen Tieren mit einem beheizten Perlensterilisator (bis zu 3x).
  2. Anästhesien Sie die Mäuse gemäß dem Tierpflegeprotokoll der Benutzer (z. B. Isofluran (4% für Induktion, 1-2% Erhaltung) und verabreichen Sie Analgesie (subkutan, 0,1 ml 0,1 mg / kg Buprenorphin SR-LAB) vor Beginn der Operation. Sorgen Sie für eine optimale Anästhesietiefe mit einer Zehennot.
  3. Setzen Sie die Mäuse in einen stereotaktischen Rahmen ein und immobilisieren Sie den Kopf mit Standard-Ohrstangen (Abbildung 1A). Tragen Sie Augensalbe auf die Augen auf.
  4. Sterilisieren Sie die Oberfläche des Kopfes durch wiederholtes, abwechselndes Auftragen (3x) von Jodabstrichen und 70% Ethanol vor dem Einschnitt.
  5. Verwenden Sie ein chirurgisches Skalpell, um einen 1 cm langen Mittellinienschnitt durch die Haut in einem leicht diagonalen Winkel zur imaginären Linie zu machen, die das Gehirn der Mäuse in zwei symmetrische Hälften teilt, um den Schädel freizulegen. Wischen Sie das Blut mit einem Wattestäbchen ab.
  6. Leiten Sie die Haut seitlich ab, um die Injektionsstelle freizulegen: 2 mm rechts, 1 mm nach vorne in Bezug auf das Bregma (+2 mediolateral (+2ML), +1 rostral/kaudal (+1RC).
  7. Verwenden Sie einen Bohrer (0,73 mm), um den Schädel +2ML, +1RC bis zum Bregma zu durchdringen und bohren Sie ein Loch mit leichtem Druck und Drehbewegung.
  8. Verwenden Sie eine Gehirninjektionsspritze, um 5 μL einer 100.000 MDA-MB-231BR (stabil exprimierende GFP-Luciferase) Zelle / μL-Lösung in sterilem 1x PBS zu injizieren, indem Sie die Spritze zunächst 3,5 mm tief in das Gehirn einführen.
  9. Lassen Sie die Spritze 2 Minuten einwirken. Ziehen Sie es etwa 1 mm hoch und injizieren Sie nach 2 Minuten langsam die erste Hälfte des Volumens.
  10. Warten Sie weitere 2 Minuten, bevor Sie den Rest injizieren, und ziehen Sie dann langsam die Spritze 3 Minuten nach der letzten Injektion.
    HINWEIS: Die langsame Injektion ist empirisch, da das Volumen vom Hirngewebe gut absorbiert werden kann und nach dem Ziehen der Spritze keine Leckage entsteht, was dazu führen kann, dass Krebszellen außerhalb der vorgesehenen Stelle wachsen.
  11. Tragen Sie Knochenwachs auf die Injektionsstelle am Schädel auf und verwenden Sie dann Polypropylennähte, um das Gewebe zu vernähen. Mäuse erholen sich innerhalb von 5 Minuten nach Entfernung der Anästhesie.
  12. Überwachen Sie ihr Verhalten direkt nach der Operation für etwa 10 Minuten, 3 Stunden später und am folgenden Tag, um festzustellen, ob eine spezielle Behandlung, einschließlich Kochsalzinjektion, weiche Nahrung usw., erforderlich ist, um eine schnelle Genesung zu unterstützen.
  13. Überwachen Sie das Tumorwachstum über Biolumineszenz-Bildgebung auf dem Bildgebungssystem.
    1. Schalten Sie dazu zunächst den Sauerstoff und das Isofluran auf dem Bildgebungssystem ein. Lassen Sie beide auf die separate Kammer außerhalb der Bildgebungsbox verteilen.
    2. Schalten Sie dann die Software ein, initialisieren Sie das Instrument und wählen Sie die entsprechende Option zum Visualisieren und Erfassen des gesamten Mauskörpers.
  14. Legen Sie die Mäuse in die separate Kammer mit Isofluran und sorgen Sie mit einer Zehenprise für eine optimale Anästhesietiefe. Injizieren Sie den Mäusen intraperitoneal 200 μL 30 mg/ml Luciferin.
  15. Übertragen Sie den Magen der Mäuse in das Nasenloch der Bildgebungskammer, das mit Sauerstoff und Isofluran versorgt wird. Verriegeln Sie die Kammer und wählen Sie eine 2-minütige Belichtung, um mit der Bildgebung zu beginnen.
  16. Verwenden Sie das ROI-Tool (Region of Interest) der Software, um das biolumineszierende Signal des Tumors zu quantifizieren.
  17. Um die Tumorgröße zu analysieren, wählen Sie das Kreisformwerkzeug aus und passen Sie es an die Tumorform und -größe an. Messen Sie den ROI und melden Sie die Gesamtwerte.
  18. Lassen Sie das Wachstum eines soliden Tumors für 12-14 Tage (oder bis die Luziferase etwa 7,0 x 106 Einheiten erreicht) (Abbildung 1B), bevor Sie Gehirnschnitte erzeugen.
    HINWEIS: Die Erhöhung der Anzahl der zu injizierenden Zellen führt zu einem schnelleren Tumorwachstum. Daher kann die Bildung von Gehirnschnitten früher als 12 Tage erfolgen. Auf der anderen Seite führt ein größerer Tumor zu mehr GFP + -Scheiben, wenn er 14 Tage lang wachsen darf. Nach 14 Tagen beginnt sich die Gesundheit der Mäuse schnell zu verschlechtern; Daher sollte die Überwachung der Tiergesundheit nach dem 10-Tage-Zeitpunkt auf einmal täglich erhöht werden, und alle Mäuse, die Anzeichen von Schmerzen und / oder Beschwerden zeigen, sollten zur Erzeugung der Scheiben verwendet werden.

2. Generieren Sie Gehirnscheiben

HINWEIS: Führen Sie die Schritte nach der Isolierung des Gehirns in einer sterilen Laminar-Flow-Haube durch. Es ist typischerweise möglich, 35-40 einzelne Scheiben mit Tumorzellen (Luciferase-Signal) aus einer Maus zu erzeugen, die mit MDA-MB-231BR-Zellen injiziert wurde (Abbildung 1C).

  1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge in einem Autoklaven. Legen Sie den Tissue-Slicer in die sterile Laminar-Flow-Haube und reinigen Sie alle Werkzeuge und Instrumente mit 70% Ethanol.
  2. Nach 12-14 Tagen nach intrakranieller MDA-MB-231BR-Zellinjektion werden die Mäuse gemäß dem Tierpflegeprotokoll der Benutzer wie in 1.2 beschrieben betäubt. Sorgen Sie für eine optimale Anästhesietiefe mit einer Zehennot.
  3. Entfernen und platzieren Sie ihr Gehirn schnell (innerhalb von 45 s) in eiskalte (4 ° C) Saccharose-ACSF, bestehend aus den folgenden: 280 mM Saccharose, 5 mM KCl, 2 mMMgCl 2, 1 mM CaCl 2, 20 mM Glukose, 10 mM HEPES, 5 mM Na+-Ascorbat, 3 mM Thioharnstoff,2 mM Na+, 29 mM Pyruvat; pH = 7,3.
  4. Schneiden Sie mit einem scharfen, sterilen Skalpell oder einer Rasierklinge überschüssige Teile des Gehirns ab, die von allen Seiten, einschließlich des unteren Teils des Gehirns, keinen Tumor enthalten.
  5. Bringen Sie die Form des Gehirns auf einen nicht perfekten Würfel, um flach auf dem ACSF-benetzten Filterpapier auf einem 60-mm-Geschirrdeckel zu sitzen, um das Schneiden zu erleichtern.
    HINWEIS: Zusätzliches Gewebe des Gehirns, in dem der Tumor wahrscheinlich nicht gewachsen ist, wird vor dem Schneiden entfernt, um die Erzeugung von meist GFP + -Scheiben zu ermöglichen und eine Form des Gehirns zu schaffen, die auf der Oberfläche des Instruments stabil ist und nicht durch die durch das Schneiden verursachten Vibrationen gestört wird.
  6. Legen Sie mehrere Blätter vornasser (mit ACSF) Filterpapierkreise auf die Schneidplattform und legen Sie das blockierte Gewebe darauf.
  7. Stellen Sie die Schnittgröße am Gerät auf 2 oder 2,5 Einheiten auf dem mitgelieferten Lineal ein, um das Gewebe in 200-250 μm Abschnitte zu schneiden.
    HINWEIS: Schnitte bis zu 350 μm oder so dünn wie 100 μm sind lebensfähig. Für Scheiben <200 μm verwenden Sie ein Vibratom oder Kompresstom.
  8. Verwenden Sie einen Pinsel (Zobel), um Gehirnscheiben in eine Schale mit Saccharose ACSF zu übertragen und die Scheiben unter einem Lichtmikroskop mit 27 G-Nadeln zu trennen.
  9. Identifizieren Sie GFP-positive Scheiben unter dem Fluoreszenzmikroskop und übertragen Sie sie auf eine neue 60-mm-Schale, die 2-3 ml adulte Schichtmedien (Neurobasalmedium A, 2% B12-Ergänzung, 1% N2-Ergänzung, 1% Glutamin, 0,5% Glukose, 10 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin) enthält, indem Sie eine sterile 1 ml abgebrochene Pipette (breite Öffnung) verwenden.
    HINWEIS: Die Gehirnschnitte, die Tumorzellen enthalten, die über die Gehirnoberfläche wachsen (möglicherweise aufgrund von Injektionszellleckagen usw.), sind ausgeschlossen.
  10. Übertragen Sie 3-5 Scheiben auf jeden 30 mm, 0,4 μm porengroßen Gewebekultureinsatz in 6-Well-Platten in einem Abstand, der kein Ineinanderwachsen zulässt.
  11. Entfernen Sie das überschüssige Medium mit einer P1000-Pipette von der Oberfläche des Einsatzes, fügen Sie 1 ml erwachsenes Mausschnittmedium unter jeder Einlage hinzu und gleichen Sie das Medium vor dem Schneiden im Inkubator aus.
  12. Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 ° C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden vor der Bildgebung.

3. IVIS-Bildgebung von Scheiben

HINWEIS: Führen Sie Luziferase- und Inhibitoradditionsschritte in einer sterilen Laminar-Flow-Haube durch.

  1. Pipettieren Sie 5 μL 30 mg/ml Luciferinlösung in das Medium unter den Einsätzen, indem Sie den Einsatz mit einer Pinzette anheben und nach Zugabe von Luciferin zu den Medien im Brunnen wieder in die Vertiefung geben.
  2. Platzieren Sie die 6-Well-Platte mit dem Deckel in der Abbildungskammer des Instruments unter der stationären Kamera und verriegeln Sie die Kammertür.
  3. Öffnen Sie die Software und initialisieren Sie das Instrument.
  4. Wählen Sie Kameraeinstellungen, die die Visualisierung und Aufnahme von nur einem Well pro Bild ermöglichen. Bewegen Sie die Bühne nach oben (Sichtfeld von 5 cm) und platzieren Sie den Bildbrunnen, der abgebildet werden muss, direkt unter der Kamera.
  5. Stellen Sie die Bildgebungszeit auf die am besten geeignete ein, abhängig von der Intensität der Luciferase, die der Tumor emittieren wird, die von 10 s bis 5 min variieren kann. Beginnen Sie mit der Einstellung auf 10 s und erhöhen Sie dann, wenn das Signal niedrig ist, aber halten Sie es für alle Zeitpunkte und Bedingungen bis zum Ende des Experiments konstant (Abbildung 1D).
  6. Verwenden Sie das ROI-Tool (Circle Shape Tool), passen Sie es an die Tumorform und -größe an, messen Sie den ROI und melden Sie die Gesamtmesswerte, um das biolumineszierende Signal jedes Tumors auf der Scheibe zu quantifizieren.
  7. Bringen Sie die Platte zurück auf die sterile laminare Flow-Haube, verwenden Sie eine Pinzette, um den Einsatz leicht aus dem Brunnen zu heben.
  8. Saugen Sie das Medium ab, ersetzen Sie es durch 1 ml frisches Medium und legen Sie den Einsatz wieder in die Vertiefung.
  9. Für Experimente, bei denen die Scheiben mit verschiedenen Verbindungen wie Inhibitoren, Metaboliten usw. behandelt werden, bereiten Sie die entsprechende Konzentration des Reagenzes in 1,2 ml Gehirnschnittmedien in einem 1,5 ml Röhrchen vor und geben Sie dann 1 ml in die Vertiefung, die die Scheibe enthält.
  10. Wiederholen Sie diesen Vorgang alle 48 Stunden für die Dauer der Studie.

4. Live-Bildgebung des Tumorwachstums in Ex-vivo-Hirnschnitten

HINWEIS: Versorgungseinsätze mit genügend Medium (1,5 ml), um die Dauer des Experiments zu überstehen, da es nicht möglich ist, während der Live-Bildgebung zusätzliches Medium hinzuzufügen.

  1. Legen Sie die 6-Well-Platte auf den automatischen Mikroskopplattenhalter im Inkubator (37 °C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit).
  2. Öffnen Sie die Software, aktivieren Sie das Hellfeld auf dem ersten Quadranten, um die Belichtung anzupassen, die zum Anzeigen der Slices erforderlich ist. Um die Position (Koordinaten "xy") der Scheibe zu finden, navigieren Sie mit "xy" auf dem zweiten Quadranten, um die Koordinaten "xyz" des Mikroskops zu steuern.
  3. Wählen Sie die 6-Well-Platte als Laborutensilien, die für dieses Experiment verwendet werden. Wählen Sie den ROI-Karteneditor aus und registrieren Sie diese Position, indem Sie einen neuen ROI auswählen, fügen Sie diesen ROI hinzu und speichern Sie ihn.
  4. Wiederholen Sie die gleichen Schritte für alle anderen Regionen, die für andere Brunnen von Interesse sind. Nachdem Sie alle ROIs hinzugefügt haben, speichern Sie alle ROIs.
  5. Wählen Sie unter Protokoll die Option Vorhandene löschen und unter Erfassung die Option Zeitraffer aus, gefolgt von der Auswahl der interessierenden Kanäle (in diesem Fall GFP).
  6. Schalten Sie den Autofokus im Fokus-Setup aus und passen Sie ihn manuell an den entsprechenden Fokus für alle Slices an. Stellen Sie schließlich die Hellfeldintensität und die Fluoreszenzkanalanregung und die Belichtungszeit auf das entsprechende Niveau ein.
  7. Stellen Sie das Protokoll so ein, dass Bilder alle 15 Minuten für 48 Stunden erfasst werden.
  8. Speichern Sie das Protokoll, und führen Sie es aus. Am Ende des Experiments enthält die gespeicherte Datei sowohl die Hellfeld- als auch die GFP-Bilder, die für jeden ROI erfasst wurden.
  9. Um die Bilder in einem Video zu kombinieren, benennen Sie alle interessanten Bilder mit demselben Namen gefolgt von einer Binärzahl um, um sie in der Reihenfolge zu organisieren, in der sie aufgenommen wurden (z. B. ROI1 (1), RO1 (2) ...)
  10. Öffnen Sie ImageJ und importieren Sie die Bilder, indem Sie auf Datei > > Bildsequenz importieren klicken. Wählen Sie die Dateinamen aus, die in einer Liste angezeigt werden, und schreiben Sie den Inhalt des Dateinamens in das Feld Dateiname enthält , das angezeigt wird, um die für das Video ausgewählten Dateien zu identifizieren.
  11. Speichern Sie die kombinierten Bilder unter Datei > Speichern unter > AVI.

5. MTS-Assay und Immunhistochemie von Ex-vivo-Hirngewebe

  1. MTS-ASSAY
    1. Schneiden Sie die Scheiben aus, indem Sie die Gewebekulturmembran unter jeder Scheibe entlang der Ränder des Gewebes schneiden und das Gewebe, das noch an der Membran befestigt ist, in eine 96-Well-Platte überführen.
    2. Fügen Sie das MTS-Reagenz gemischt in einem Verhältnis von 1:5 mit Kulturmedien und 0,01% Triton (1x) hinzu, um das Eindringen der Lösung in das Gewebe in einem Gesamtvolumen von 120 μL in jeder Vertiefung zu ermöglichen.
    3. Verwenden Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) als Mittel, um Gehirnschnitte unrentabel zu machen, und somit eine positive Kontrolle für dieses Experiment. Tauchen Sie die interessierende Gehirnscheibe für 1 h bei RT (Raumtemperatur) oder über Nacht bei 4 °C in 4% PFA ein, bevor Sie mit dem MTS-Assay fortfahren.
    4. Lassen Sie das MTS-Reagenz 4 h lang auf den Scheiben reagieren, entfernen Sie die Scheiben aus den Vertiefungen und messen Sie die Absorption bei 490 nm für alle Bedingungen, einschließlich einer leeren Vertiefung ohne Scheibe als Referenz.
    5. Geben Sie die Messwerte in Abhängigkeit von der Gewebeschnittfläche an, die mit einem digitalen Bremssattellineal gemessen wird.
  2. Immunhistochemische Präparation
    1. Tauchen Sie die an der Membraneinlagefläche befestigten Hirnscheiben über Nacht bei 4 °C in 10% Formalin ein.
    2. Führen Sie das Einbetten, Verarbeiten, Blockieren und erzeugen Sie ungefärbte Objektträger des Gewebes. Verwenden Sie das Standard-Immunhistochemie-Färbeprotokoll zur Färbung für H & E, Ki-67, gamma-H2AX, CC3, GFAP, GFP, DAPI

6. Bestrahlung von Tumoren in ex vivo Hirnschnitten

  1. Bestrahlen Sie den Tumor mit 6 Gy (310 kVp Röntgenstrahlen).
    HINWEIS: Die Einheiten, die eingegeben wurden, um die Gesamtdosis von 6 Gy zu erhalten, sind 3522 Einheiten nach Berücksichtigung von R-Einheiten (gemessen mit dem Victoreen-Elektrometer) und Korrekturen für den Fingerhut, die Luftdichte und cGy / R, wie zuvor beschrieben18. Die Belichtungszeit beträgt 130,9 s.
  2. Verwenden Sie 0,25 mm Cu + 1 mm Al zusätzliche Filtration, 50 cm SSD, 125 cGy pro Minute.
  3. Führen Sie eine Dosimetrie durch eine In-the-Beam-Ionisationskammer durch, die gegen einen Primärstandard kalibriert ist.
  4. Korrigieren Sie täglich Feuchtigkeit, Temperatur und Luftdruck.

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Ergebnisse

MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase-Zellen wurden intrakraniell in die rechte Hemisphäre von 4-6 Wochen alten Nu/Nu-Mäusen injiziert, wie oben erklärt (Abbildung 1A) und durften 12-14 Tage lang wachsen, während dieser Zeit wurde das Tumorwachstum durch Biolumineszenz-Bildgebung überwacht (Abbildung 1B). Wir injizierten 100.000 Krebszellen intrakraniell, wie von anderen Gruppen19 berichtet, aber es ist möglich, so wenig wie 20.000 Zellen

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Diskussion

Diese Studie etabliert eine neuartige Ex-vivo-Hirnkulturmethode für explantierte Xenotransplantat-Hirntumoren. Wir zeigen, dass BCBM-Zellen MDA-MB-231BR-Zellen, die intrakraniell in das Gehirn von Mäusen injiziert werden, überleben und in Ex-vivo-Hirnschnitten wachsen können. Die Studie testete auch intrakraniell injizierte U87MG Glioblastom (GBM) -Zellen und fand auch heraus, dass diese Krebszellen überleben und in Gehirnschnitten wachsen (Daten nicht gezeigt). Wir glauben, dass dieses Modell über BCBM...

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Offenlegungen

Autoren haben keine finanziellen Konflikte zu erklären.

Danksagungen

Wir danken Julia Farnan, Kayla Green und Tiziana DeAngelis für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch das Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) und W.W. Smith Charitable Trusts (EjH) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL Spritze, Slip TipBD309659
30 G1/2 NadelnBD305106
6-Well-PlattenGenessee25-105
Automatisiertes Mikroskop und LUMAVIEW SoftwareEtalumaLS720
B27 (GEM21)Gemini Bio-Products400-160
Becherglas 50 mLFisher10-210-685
Stumpfer Zobelpinsel, Größe #5/0Elektronenmikroskopie Wissenschaften66100-50
KnochenwachsModoMedDYNJBW25
GehirninjektionsspritzeHamilton Company80430
CaCl2Fisher ScientificBP510-250
Gespaltene Caspase 3Antikörper-Zellsignalisierung14220S
DAPIInvitrogenP36935
D-Luciferin KaliumsalzPerkin Elmer122799
Doppelschneidige RasierklingeVWR55411-060(95-0043)
Filterpapier , quantitative Kreise, 4,25 cmFisher09-805a (1001-042)
Feinmarderpinsel #2/0Elektronenmikroskopie66100-20
Forceps Fine Science Tools11251-20
Gamma-H2AX AntikörperMillipore05-636
GFAP AntikörperThermo Fisher13-0300
GFP AntikörperSanta CruzSC-9996
GlucoseSigma AldrichG8270
Glutamin (200 mM)Corning Zellwuchs25-005-Cl
H& E und KI-67Jefferson Core Facility Pathology Staining
Handbohrer-Set mit Micro Mini Twist Drill BitsAmazonYCQ2851920086082DJ
HEPES, freie SäureFisher ScientificBP299-1
Nur für Mäuse Stereotaxic FrameHarvard Apparatus (Holliston, MA, USA).72-6049, 72-6044
KClFisherScientific S271-10
Große chirurgische SchereFine Science Tools14001-18
MDA-MB-231BR ZellenMit freundlicher Verfügung von Dr. Patricia SteegRef 14
MgCl2· 6H2OFisher ScientificM33-500
MäusebildgebungsgerätPerkin ElmerIVIS 200 System
MäusebildgebungssoftwareCaliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).Living Image Software
Microplate ReaderTecan Spark
Mountingsolution InvitrogenP36935
MTS ReagenzPromega CellTiter 96 Wässrige One Lösung(Cat:G3582)
N2 supplementLife Technologies17502-048
Neurobasales MediumLife Technologies21103049
Nu/Nu athyme MäuseCharles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)
ParaformaldehydAffymetrix19943
Pen/StrepLife Technologies145140-122
Polypropylen NahtMedex VersorgungETH-8556H
Povidon Jod Tupfer StäbchenDME Versorgung USAKat: 689286X
Skalpellklinge #11 (Packung mit 100)Fine Science Tools10011-00
Skalpellgriff #3Fine Science Tools10003-12
NatriumpyruvatSigma AldrichS8636
Spatel/SondeFine Science Tools10090-13
SS Doppelschneidige unbeschichtete Rasierklingen (American Safety Razor Co (95-0043))VWR55411-060
SaccharoseAmresco57-50-1
Chirurgisches SkalpellExelint InternationalD29702
GewebehackerBrinkman(McIlwain-Typ)
GewebekultureinsätzeMilliporePICMORG50 oder PICM03050
RöntgengerätPräzision 250 kVp

Referenzen

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