Summary
该方法文章详细介绍了使用膜片钳技术测量穿过线粒体内膜的H + 泄漏的主要步骤，这是一种研究线粒体产热能力的新方法。
Abstract
线粒体产热（也称为线粒体解耦）是增加能量消耗以对抗代谢综合征的最有希望的目标之一。产热组织，如棕色和米色脂肪，发展出高度专业化的线粒体用于产热。主要产生ATP的其他组织的线粒体也将高达25%的总线粒体能量产生转化为热量，因此可以对整个身体的生理学产生相当大的影响。线粒体产热不仅对维持体温至关重要，而且可以防止饮食引起的肥胖并减少活性氧（ROS）的产生，以保护细胞免受氧化损伤。由于线粒体产热是细胞代谢的关键调节剂，因此对这一基本过程的机械理解将有助于开发治疗策略，以对抗与线粒体功能障碍相关的许多病理。重要的是，控制线粒体中产热急性激活的精确分子机制定义不清。这种信息的缺乏主要是由于缺乏直接测量解偶联蛋白的方法。最近应用于线粒体的膜片钳方法的发展首次使在线粒体产热起源的现象，通过IMM泄漏H + 以及负责它的线粒体转运蛋白的第一次生物物理表征，解偶蛋白1（UCP1），棕色和米色脂肪的特异性以及所有其他组织的ADP / ATP转运蛋白（AAC）的直接研究。这种独特的方法将为控制H + 泄漏和线粒体产热的机制以及如何靶向对抗代谢综合征提供新的见解。本文描述了应用于线粒体的膜片钳方法，通过直接测量通过IMM的H + 电流来研究其产热能力。
Introduction
线粒体以细胞的动力而闻名。事实上，它们是化学能ATP的主要来源。鲜为人知的是，线粒体也会产生热量。事实上，每个线粒体不断产生两种类型的能量（ATP和热量），并且两种能量形式之间的良好平衡定义了代谢细胞稳态（图1）。线粒体如何在ATP和热量之间分配能量当然是生物能量学领域最基本的问题，尽管它在很大程度上仍然是未知的。我们确实知道，增加线粒体产热（称为线粒体产热），从而减少ATP的产生会增加能量消耗，这是对抗代谢综合征的最佳方法之一1。
线粒体产热起源于穿过线粒体内膜（IMM）的H + 泄漏，导致底物氧化和ATP合成的解耦，从而产生热量，因此称为“线粒体解耦”1 （图1）。这种H + 泄漏取决于称为解偶联蛋白（UCP）的线粒体转运蛋白。UCP1是第一个被识别的UCP。它仅以产热组织，棕色脂肪和米色脂肪表达，其中线粒体专门用于产热2，3，4。UCP在骨骼肌，心脏和肝脏等非脂肪组织中的身份仍然存在争议。这些组织中的线粒体可使约25%的总线粒体能量转化为热量，这可以显着影响整个身体的生理机能1.除了保持核心体温外，线粒体产热还通过减少卡路里来预防饮食引起的肥胖。此外，它通过线粒体减少活性氧（ROS）的产生，以保护细胞免受氧化损伤1。因此，线粒体产热参与正常衰老，年龄相关的退行性疾病和其他涉及氧化应激的疾病，例如缺血再灌注。因此，线粒体产热是细胞代谢的强大调节剂，对这一基本过程的机制理解将促进治疗策略的发展，以对抗与线粒体功能障碍相关的许多病理。
线粒体呼吸是第一个揭示线粒体产热在细胞代谢中的关键作用的技术，并且仍然是社区中最受欢迎的技术1。该技术基于线粒体电子传递链（ETC）对氧消耗量的测量，当线粒体H +泄漏被激活时，线粒体电子传递链（ETC）会增加。这种技术虽然是工具性的，但不能直接研究IMM1上的线粒体H +泄漏，因此很难精确识别和表征负责它的蛋白质，特别是在非脂肪组织中，与ATP产生相比，热量产生是次要的。最近，应用于线粒体的膜片钳技术的发展，首次直接研究了各种组织中整个IMM的H +泄漏5，6，7。
整个IMM的线粒体膜片钳首先由Kirichok等人以可重复的方式建立。他们描述了2004年使用来自COS-7细胞系8的斜面体首次直接测量线粒体钙单递质细胞（MCU）电流。后来，Kirichok实验室显示来自小鼠9和果蝇组织9的IMM的钙电流。其他实验室现在经常使用这种技术来研究MCU10，11，12，13，14的生物物理特性。对钾和氯化物电导率进行全IMM膜片钳分析也是可能的，并且已经在几篇论文中提到过，但尚未成为出版物6，7，9的主题。2012年报道了对IMM上H +电流的首次测量，来自小鼠棕色脂肪线粒体6，以及2017年小鼠米色脂肪线粒体7。该电流是由于产热组织的特异性解偶联蛋白UCP16，7。2019年发表的最新研究将AAC描述为负责心脏和骨骼肌等非脂肪组织中线粒体H +泄漏的主要蛋白质5。
这种独特的方法现在允许对负责线粒体产热的线粒体离子通道和转运蛋白进行直接的高分辨率功能分析。为了促进该方法的扩展并补充其他研究，例如线粒体呼吸，下面描述了测量UCP1和AAC携带的H + 电流的详细方案。描述了三个重要步骤：1）从小鼠棕色脂肪中分离线粒体以分析UCP1依赖性H + 电流和从心脏中分离线粒体以分析AAC依赖性H + 电流，2）用法国压榨机制备斜面体以机械破裂外线粒体膜（OMM），3）整个IMM上UCP1和AAC依赖性H + 电流的膜片钳记录。
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Protocol
所有进行的动物实验程序都符合美国国立卫生研究院的指导方针，并已获得加州大学洛杉矶分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
注意：线粒体分离程序基于差异离心，并且因组织而异。例如，由于棕色脂肪组织含有极其丰富的脂质，因此在收获线粒体之前，需要额外的步骤才能将细胞碎片和细胞器从脂质相中分离出来。为避免混淆，下面详细介绍了两种线粒体分离程序（一种来自棕色脂肪，另一种来自心脏）。
1. 从小鼠肩胛间棕色脂肪中分离线粒体（改编自Bertholet等人，2020）15
- 根据美国兽医医学协会小组和IACUC委员会的建议，使用CO2 窒息和随后的宫颈脱位对C57BL / 6雄性小鼠实施安乐死。
- 将鼠标的腹部朝向桌子放置后，喷洒酒精以清洁和润湿头发（修改自Mann等人，2014）16。
- 用镊子抓住皮肤后，在上背部做一个2厘米的切口。
- 提取小鼠的棕色肩胛间脂肪，该脂肪对应于具有蝴蝶形状16的双叶器官。
- 将棕色脂肪转移到35mm培养皿中，其中装有5mL冷隔离缓冲液（表1），先前放置在冰上。
- 在双筒望远镜下清洁白色脂肪中的棕色脂肪。
- 将棕色脂肪转移到带有5 mL冷隔离缓冲液（表1）的10 mL烧杯中，将其切成薄片。转移到冰冷的10 mL玻璃均质机（塑料材料聚四氟乙烯（PTFE）杵）中。
- 使用顶置搅拌器以275转/分钟的受控速度在冰上均匀预切割的组织，轻轻地冲程六次。
- 在15mL冰冷的锥形管中以8，500× g 在4°C下离心10分钟。丢弃含有脂质相的上清液。
- 将沉淀重悬于5 mL冰冷分离缓冲液中（表1），并以275旋转/分钟的速度在冰上以6次缓慢冲程均质化悬浮液。
- 将匀浆物转移到15mL冰冷的锥形管中，并在4°C下以700× g 离心10分钟以沉淀所有细胞核和未破碎的细胞。
- 将上清液收集在新鲜的15mL管中并将其放在冰上。
- 将上清液在4°C下以8，500× g 离心10分钟，以获得含有线粒体的沉淀。
- 将含有线粒体的沉淀重悬于3.8mL冰冷的高渗甘露醇缓冲液中（表2），并将线粒体悬浮液在冰上孵育10-15分钟。
2.从小鼠心脏中分离线粒体（修改自Garg等人，2019）17
- 根据美国兽医医学协会小组和IACUC委员会的建议，使用CO2 窒息和随后的宫颈脱位对C57BL / 6雄性小鼠实施安乐死。
- 将鼠标放在背部后，喷洒酒精以清洁和弄湿头发。然后，用镊子抓住皮肤后，在胸部做一个2厘米的切口。
- 从动物胸部切除心脏并冲洗，用5 mL冷隔离溶液在10 mL烧杯中除去所有血液（表1）。
- 一旦心脏清除了微量血液，将其转移到另一个含有5 mL冷隔离缓冲液（表1）的10 mL烧杯中，将其切成薄片。然后，转移到冰冷的10 mL玻璃均质机（PTFE杵）中。
- 使用顶置搅拌器以275转/分钟的受控速度在冰上均匀预切割的组织，轻轻地冲程六次。
- 将匀浆转移到15mL冰冷的锥形管中，并在4°C下以700× g 离心10分钟至沉淀细胞核和未破碎的细胞。
- 将上清液收集在新鲜的15mL管中并将其放在冰上。
- 将上清液在4°C下以8，500× g 离心10分钟，以获得含有线粒体的沉淀。
- 将线粒体沉淀重悬于3.8mL冰冷的高渗甘露醇缓冲液中（表2），并将线粒体悬浮液在冰上孵育10-15分钟。
3.用法国压榨机制备斜面体，用于OMM的机械破裂。
注：法国压机程序允许从OMM中释放IMM并保持其完整性，包括矩阵和 crista（图 2）18。线粒体在高渗甘露醇缓冲液中预孵育（表2），并在法式按压过程中承受较低的压力，以避免OMM破裂时IMM的任何剧烈拉伸。
- 将线粒体 - 高渗 - 甘露醇悬浮液填充到法国压榨机的冷藏迷你压力池（活塞直径3/8“）中（图3A）。
- 选择法国压榨机的 Medium 模式，并通过迷你压力池将悬浮液压缩在法国压榨机表盘上的110（对于棕色脂肪线粒体）和140压缩为心脏线粒体（〜2，000 psi）。 确保悬浮液以约1滴/秒的速率从迷你压力池中出来。
- 将滴剂收集在15 mL冰冷锥形管中。
- 在4°C下以10，500× g 离心悬浮液10分钟。
- 将mitoplasts沉淀重悬于0.5-2mL冰冷的高渗KCl缓冲液中（表3），并将悬浮液储存在冰上。
注意：棕色脂肪和心脏斜面体已准备好进行膜片钳记录，并应保持可用约3-6小时。
4. 通过UCP1和AAC5，7，15泄漏的H +电生理学记录
注：使用以下电生理学设置（图3B）：具有微分干涉对比度（DIC）的倒置显微镜，60倍水浸物镜，隔振表和法拉第笼，支持低噪声记录的标准放大器，用于电生理学设置的标准数字化仪，pClamp 10，显微操纵器，浴参比电极（3 M KCl-琼脂盐桥插入含有银/氯化银颗粒模制的微电极支架内） 进入支架体（在Liu等人2021中描述）19，灌注室具有0.13毫米玻璃盖玻片底部，连接到重力馈送灌注系统。
- 在记录当天使用微量移液器拉动硼硅酸盐玻璃丝。在用于生成具有高度再现性的移液器的拉拔器上设置程序20.
注：此程序设计需要多次尝试才能获得针对 IMM 膜片钳优化的移液器。标准移液器具有渐进式圆锥形的精细吸头。 - 在拉拔器内插入一根玻璃丝并拉动，从一根硼硅酸盐丝中获得几乎两个相同的贴片移液器。
- 当移液器在拉动周期之间由于拉拔器的加热盒灯丝老化而变得不一致时，调整程序。
- 将移液器放在移液器抛光机内，并将吸头放在100倍放大镜下靠近灯丝附近，以进行火抛光。
- 按压脚踏板几次以加热灯丝，而不会堵塞或损坏尖端曲线。
- 抛光，直到在填充基于TMA的移液器溶液（四甲基氢氧化铵的TMA， 表4）时获得电阻在25至35 MΩ之间的移液器。
- 用0.1%明胶预孵育盖玻片（直径5mm，厚度0.1mm）以减少膜塑胶粘附，并在沉积mittoplast悬浮液之前用KCl浴溶液冲洗它们（表5）。
- 通过将〜35μL浓缩的斜面体悬浮液与500μLKCl浴溶液（表5）混合来制备原始稀释液，并将其置于先前放置在4孔板孔中的盖玻片上。
- 在冰上孵育15至20分钟，使膜塑性体沉淀在盖玻片上。
- 用~50μL的KCl浴液完全填充浴槽（表5）。
- 使用带有弯曲尖端的薄显微切割镊子在腔内转移带有斜面体的盖玻片。
- 将盖玻片排列在腔室底部。不要灌注腔室以保持膜塑性粒细胞在盖玻片上的稳定。
- 通过用60倍物镜在显微镜下扫描盖玻片，选择8形的单个非粘性斜面胶。
- 将移液器溶液（~50μL）加载移液器，并将其置于移液器支架中。
- 使用显微操作器将移液器带入浴槽溶液中，并在所选的斜面体上方接近它以接近IMM。放大器程序给出了移液器进入浴液后的电阻。将膜电位保持在0 mV，并使用放大器程序中的膜测试命令施加10 mV脉冲。
- 施加轻微的负压以使用IMM快速产生千兆级（图2B）。
- 在连接有膜塑料的情况下抬起移液器，使其远离盖玻片，以避免在实验过程中由于移液器漂移而导致的密封破损。
- 在测试全膜膜结构之前，使用放大器程序中的“膜测试”命令补偿杂散电容瞬变，以便在磨合后获得正确的电容（Cm）测量。
- 使用放大器程序施加短持续时间（5-15 ms）电压脉冲（250-600 mV），以破坏玻璃移液器下的膜贴片并实现全膜塑料配置（图2C）。成功的闯入反映在电容瞬变的重新出现上。
- 闯入后，将电容瞬变与放大器程序的膜测试选项拟合，以评估膜电容（反映斜面体的大小）及其访问电阻Ra（反映全斜面体配置的质量）。磨合后，Ra应介于 40 和 80 MΩ 之间。用于膜片钳实验的Mitoplasts（2-6μm尺寸）通常具有0.5-1.1 pF的膜电容。
- 闯入后，立即通过开始灌注将KCl浴溶液（表5）替换为HEPES浴溶液（表6）。
- 应用与放大器程序一起设计的850 ms斜坡协议，从-160 mV到+100 mV，间隔为5 s，同时将mitoplast保持在0 mV。该协议适用于UCP16，7，15 和AAC5 研究（图4 和 图5）。
注意：对于 UCP1 和 AAC 相关的 H+ 电流测量，建议在 10 kHz 下采集所有电生理数据，并使用驱动放大器和数字化仪的适当软件以 1 kHz 进行滤波。
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Representative Results
应用于线粒体的膜片钳方法的发展首次直接研究了通过IMM和线粒体转运蛋白UCP1和AAC的H + 泄漏。对UCP1和AAC依赖性H+ 泄漏的电生理学分析可以提供线粒体产热能力的第一眼。结果部分描述了通过UCP1和AAC测量H + 泄漏的标准程序。
与 UCP1 相关的 H+ 电流测量（图 4）6，7，15
电压斜坡协议的应用在棕色脂肪的IMM上感应出大振幅H +电流，而无需添加外源性脂肪酸（FA），这是UCP所需的激活剂（图4A）。这是棕色和米色脂肪IMM的一个特定特征，由于与膜相关的磷脂酶活性局部产生FA。当H+电流响应斜坡协议而产生时，等待电流幅度稳定是很重要的。通过 UCP1 量化 H+ 电流幅度需要确定与零 UCP1 电流相对应的基线。一旦达到H +电流振幅的稳定性，建议灌注UCP1抑制剂鸟苷二磷酸（GDP - 1 mM，图4A）或FA螯合剂（0.5%无FA牛血清白蛋白，未显示）或10mM甲基β环糊精（MβCD）用于内源性膜FA提取，图4B，黑痕）。残余电流是确定UCP1电流幅度的电流。为了帮助比较不同斜晶体中UCP1电流的振幅，每个斜面体的电流密度（pA / pF）是通过用斜面体电容（Cm）归一化UCP1电流来计算的。通过使用花生四烯酸（AA）或油酸（OA）（1-2μM）添加外源长链FA，可以重新激活电流。由于棕色和米色脂肪IMM都具有PLA2活性，因此内源性膜FA在从浴中洗涤MβCD / 白蛋白的几分钟内部分再生，导致H +电流通过UCP16，7重新激活。正如预期的那样，该电流在UCP1-/-小鼠的IMM中完全消失（图4A）6，7。
比较同一组织的不同斜面体或来自不同组织（棕色和米色脂肪）的丝粒体的UCP1的密度和活性的更精确的方法是控制IMM6，7表面的FA浓度。事实上，由于每个IMM的UCP1蛋白量以及由于内源性FA的产生，H + 电流振幅在无晶粒体之间可能有所不同。因此，建议从IMM中提取内源性FA，并通过以已知浓度添加外源性FA来重新激活UCP1依赖性H + 电流。为此，必须首先通过灌注含有10mM MβCD的HEPES浴溶液（表6）从IMM中提取内源性FA。然后，为了仅允许通过精确浓度的外源FA通过UCP1重新激活H + 电流，后者将在HEPES / MβCD背景上灌注以连续提取从IMM产生的FA。
嘌呤核苷酸和FA之间与UCP1结合的竞争的研究也可以通过膜片钳技术6，7，15进行。嘌呤核苷酸（例如，Mg2+-游离ATP）对UCP1的抑制可以与两种不同浓度的FA（理想情况下为10倍）进行比较。为此，首先通过施加10mM MβCD去除内源性膜FA（图4B，黑色痕迹）。在10 mM MβCD的背景上应用外源性FA（例如，此处仅显示0.5mM FA）可以精确控制激活FA的浓度，因为本地生产的FA立即从膜中提取。在这种情况下，外源性FA是H+ 电流发展的主要原因。随后将不同浓度的ATP添加到OA / MβCD溶液中，以评估每个FA浓度测试的IC50ATP ，从而确定FA是否与嘌呤核苷酸竞争与UCP1结合。
AAC 相关的 H+ 电流测量（图 5）5
与棕色脂肪不同，骨骼肌和心脏等非脂肪组织的IMM在磨合后立即不会立即产生可测量的H + （图5，黑色痕迹）。为了通过AAC诱导可测量的H + 电流，必须应用含有1-2μM外源FA的HEPES浴溶液（表6）（AA， 图5A，红色痕迹）。这可能表明非脂肪组织的IMM没有FA生产机器进入IMM，就像在棕色和米色脂肪的IMM中发现的那样。
通过加气混凝土量化H+ 电流振幅的基线（或零电流）对应于在添加FA之前灌注在IMM表面的HEPES浴溶液（表6）。为了确认测得的H + 电流由AAC承载，重要的是应用添加到FA中的AAC的特定抑制剂，1μM的羧基酸（CATR， 图5A）或4μM的bonkgrekic acid（BKA，未显示）5，它们几乎完全抑制H + 电流。该电流在 AAC1-/- 小鼠的IMM中完全消失（图5A），AAC1是心脏5中的主要亚型。
使用AAC5也可以对FA依赖性H +泄漏与核苷酸之间的相互作用进行膜箝分析。然而，AAC和UCP1之间存在重要区别：AAC不仅携带H +，而且其主要功能是运输腺嘌呤核苷酸ADP和ATP21。为了研究腺嘌呤核苷酸交换如何影响FA依赖性H +泄漏，将1mM Mg2 +游离ADP添加到移液器溶液中。然后，灌注FA以通过AAC激活H +电流。移液器溶液中只有ADP不会干扰H+电流5。一旦达到稳定的H+电流幅度，ADP将与FA同时灌注。只有当ADP存在于膜的两侧以通过AAC产生活性核苷酸交换时，才能实现恒定但从未完全抑制H +泄漏（图5B）。这可能表明AAC的两种传输模式（FA-H +电流和ADP / ATP交换）竞争并且可能通过相同的易位途径发生。选择ADP/ADP同源交换以避免与生理ADP/ATP异质交换5相关的额外电流。
图1：热量和ATP产生之间的线粒体能量分布。 线粒体ATP和产热的机制。线粒体有两个膜[OMM（紫色）和IMM（橙色）]，它们包含ATP和产热的机器。ETC在整个IMM上产生H + 的电化学梯度，ATP合酶（AS）使用它来产生ATP，并被UCP用来产生热量。 请点击此处查看此图的大图。
图2：线粒体膜片钳技术（由Bertholet等人2020修改）15. （A）线粒体通过离心从组织裂解物中分离出来（紫色为OMM，橙色为IMM）。（B）低压法国压榨机使OMM破裂以释放IMM，从而产生薄膜破壁。左侧面板表示一个 mitoplast，它采用 8 形形式，OMM 的残余物连接到 IMM。将玻璃移液器接近IMM以形成千兆欧密封（膜塑料附着配置）。右侧面板显示了 mitoplast 连接配置的照片。（C）全IMM（左图）的配置是通过几个电压脉冲（200-500 mV）破坏移液器下的膜片后获得的。整个IMM配置的照片显示在右侧面板中。向内电流（I，红色）为负。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：法国压机和电生理学设置。 （A）法国新闻的图片，这有助于打破OMM以释放IMM。（B）法拉第笼，具有微分干涉对比度（DIC）的倒置显微镜，60x水浸物镜，隔振台和显微操纵器的图片。标准放大器，标准数字化仪和PC计算机未显示在图中。 请点击此处查看此图的大图。
图4：H+电流通过棕色脂肪中的UCP1。（A）从从WT（上图）和UCP1−/−小鼠（下图）分离的棕色脂肪丝状体中记录的代表性UCP1依赖性H+电流。黑色显示的控制H+电流迹线对应于IMM断开后的稳定电流幅度。然后将1 mM GDP添加到浴液中（橙色）。电压斜坡协议显示在WT走线上方。浴槽和移液器溶液的pH值显示在移液器-薄膜塑料图中。（二）通过棕色脂肪中的嘌呤核苷酸抑制UCP1。具有代表性的UCP1依赖性H +电流在热中性小鼠棕色脂肪的IMM的胞质面上以各种浓度的ATP迹线。UCP1依赖性H +电流由0.5 mM油酸（OA）与10 mM MβCD混合激活。在下部面板中，表示相同的迹线，但未与mittoplast膜电容归一化。该图中的棕色脂肪斜长层胶具有0.624 pF的膜电容。请点击此处查看此图的大图。
图 5：心脏斜面体中通过 AAC 的 FA 依赖性 H+ 电流。 （A）当在WT心脏斜面体中的浴溶液（上面板，橙色）中施加2μM AA并被1μM CATR（紫色）抑制时，具有代表性的AAC依赖性H + 电流。在 AAC1 −/−心脏斜面体中记录的代表性迹线位于下面板。控制电流为黑色。电压斜坡协议显示在WT走线上方。浴槽和移液器溶液的pH值显示在移液器-薄膜塑料图中。（B）虽然移液器溶液含有1 mM ADP，但AAC依赖性H + 电流由2 μM AA（橙色）感应，并通过在浴中加入1 mM ADP（紫色）来抑制。电压斜坡协议显示在迹线上方。浴槽和移液器溶液的pH值显示在移液器-薄膜塑料图中。 请点击此处查看此图的大图。
| 试剂 | 最终浓度 |
| 蔗糖 | 250 毫米 |
| 赫皮斯 | 10 毫米 |
| 断续器 | 1 毫米 |
| 使用TrisBase将pH值调节至7.2 |
表1：线粒体分离缓冲液（张力~每公斤300毫摩尔）
| 试剂 | 最终浓度 |
| 蔗糖 | 140 毫米 |
| D-甘露醇 | 440毫米 |
| 赫皮斯 | 10 毫米 |
| 断续器 | 1 毫米 |
| 使用TrisBase将pH值调节至7.2 |
表2：高渗-甘露醇缓冲液
| 试剂 | 最终浓度 |
| 氯化钾 | 750 毫米 |
| 赫皮斯 | 20 毫米 |
| 断续器 | 1 毫米 |
| 使用TrisBase将pH值调节至7.2 |
表3：高渗KCl缓冲液
| 试剂 | 最终浓度 |
| 断续器 | 130 毫米 |
| 赫皮斯 | 100 毫米 |
| 断续器 | 1 毫米 |
| 用于 UCP1 记录的 MgCl2 | 2 毫米 |
| 或 | |
| TrisCl 用于 AAC 录音 | |
| 用D-葡萄糖酸调节pH值至7.0或7.5 |
表4：基于TMA的移液器溶液（张力约为每公斤360毫摩尔）
| 试剂 | 最终浓度 |
| 氯化钾 | 150 毫米 |
| 赫皮斯 | 10 毫米 |
| 断续器 | 1 毫米 |
| 使用TrisBase将pH值调节至7.0 |
表5：KCl浴液（张力~每公斤300毫摩尔）
| 试剂 | 最终浓度 |
| 蔗糖 | 100 mM 用于 UCP1 录音 |
| 或 | |
| 150 mM 用于加气混凝土录音 | |
| 赫皮斯 | 150 mM 用于 UCP1 录音 |
| 或 | |
| 100 mM 用于加气混凝土录音 | |
| 1 毫微米 | |
| 使用TrisBase将pH值调节至7.0 |
表6：HEPES浴液（张力~每公斤300毫摩尔）
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Discussion
该方法文章旨在介绍最近应用于线粒体的膜片钳技术，这是一种通过负责线粒体产热的IMM直接研究H + 泄漏的新方法5，6，7，15。该技术不仅限于组织，还可用于分析不同标准人体和细胞模型（如HAP1，COS7，C2C12和MEF细胞）中IMM的H + 泄漏和其他电导。然而，每个线粒体分离都需要针对每种细胞或组织类型进行一些特定的重新调整。
这里总结了通过棕色脂肪5，6和心脏5的IMM直接测量H +电流的主要步骤，以说明在专门的产热和非脂肪组织中负责线粒体产热的机制。事实上，该技术的开发首次允许对两种主要UCP（UCP1和AAC）在其天然膜环境中进行高分辨率功能分析，并精确控制关键的实验条件，例如：1）移液器和浴液溶液的pH值，2）控制整个IMM的膜电位，以及3）溶液的精确组成，以排除除H +以外的任何可渗透到IMM的离子和代谢物。基于TMA的移液器（表4）和HEPES浴溶液（表6）的配方用于记录H +电流，并且仅包含解离成大阴离子和通常不渗透于IMM的阳离子的盐。虽然可以使用灌注系统改变浴溶液，允许对膜的胞质侧施加不同的处理，但不可能改变移液管内溶液的组成。这限制了对矩阵侧发生的监管机制的理解。实际上，在填充移液器时，移液管内溶液中必须存在化合物。因此，H+泄漏可以在隔离其他电流的情况下进行研究。药理学研究和KO小鼠的使用对于表征和鉴定负责通过各种组织IMM的H +电流的蛋白质至关重要5，6，7。这些结果确定UCP1是棕色和米色脂肪的主要UCP，以及非脂肪组织中的AAC。我们不能完全排除不存在由UCP1和AAC介导的其他H+电流的可能性。然而，如果存在其他H +电流，它们的振幅超出了我们电生理设置的分辨率。我们不在本文描述的条件下测量ETC的H +泵送。一旦我们达到全IMM配置，线粒体基质就会通过移液管内溶液的灌注被洗掉。自法国媒体打破OMM以来，膜间空间已不复存在。没有添加对通过ETC泵送H +至关重要的呼吸复合物的底物。因此，在电生理条件下不太可能产生主动H +泵送。
本文不介绍切除补丁的单声道录制。尽管由于蛋白质密度高，IMM上的UCP1和AAC依赖性H + 电流是鲁棒的，但由于UCP1和AAC酉电流的振幅可能太小，因此无法解决单通道开口。
与生化研究相反，本文中描述的线粒体分离不需要导致高水平的线粒体纯度。实际上，由大量个体化的丝粒体和细胞碎片组成的线粒体制剂在显微镜下进行扫描，以找到一个8形的丝粒体来修补。8形形式的斜面胶是由于法国压机程序引起的OMM中的孔释放IMM（图2）。密度较低的波瓣对应于IMM15，17。可以通过自由移动的斜长层体来定义合适的制剂，该斜长层可以很容易地与细胞碎片区分开来。然而，重要的是要减少碎屑的数量以避免IMM的污染，这可能会影响玻璃移液器与膜的密封质量。显微镜下的这种扫描步骤使得选择具有高IMM完整性的丝状体成为可能，其密度低于OMM所限定的波瓣，因此增加了成功闯入的机会。
该技术首次提供了对其天然膜内UCP1和AAC依赖性H + 电流的直接测量。然而，由于OMM和可能的crista的破裂，线粒体完整性和区室化不再存在。因此，必须用线粒体呼吸等其他经典方法补充膜片钳分析，以确认新表征的蛋白质在完整线粒体中的生理作用。
应用于线粒体的膜片钳技术为更好地了解负责线粒体H + 泄漏和产热的分子机制提供了新的可能性。结合现代细胞和分子技术，这种创新方法将为控制线粒体产热能力的机制以及如何靶向它们以对抗与线粒体功能障碍相关的疾病提供新的见解。
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Disclosures
提交人宣布没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
我感谢Yuriy Kirichok博士在他的实验室中参与的伟大科学，并感谢Kirichok实验室的成员进行了有益的讨论。我还要感谢Douglas C. Wallace博士提供 AAC1 敲除小鼠。 资助：A.M.B.由美国心脏协会职业发展奖19CDA34630062支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
References
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