Dieser Beitrag zielt darauf ab, ein Protokoll zur Herstellung von Recycling-Endosomen aus Säugetierzellen unter Verwendung der Saccharosedichtegradienten-Ultrazentrifugation vorzustellen.
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Methodenartikel
Dichtegradienten-Ultrazentrifugation zur Untersuchung des endozytären Recyclings in Säugetierzellen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der endosomale Transport ist ein essentieller zellulärer Prozess, der eine breite Palette biologischer Ereignisse reguliert. Proteine werden aus der Plasmamembran internalisiert und dann zu den frühen Endosomen transportiert. Die internalisierten Proteine könnten zum Abbau in das Lysosom überführt oder zur Plasmamembran zurückgeführt werden. Ein robuster endozytärer Recyclingweg ist erforderlich, um die Entfernung von Membranmaterialien aus der Endozytose auszugleichen. Es wird berichtet, dass verschiedene Proteine den Signalweg regulieren, einschließlich ADP-Ribosylierungsfaktor 6 (ARF6). Die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation ist eine klassische Methode zur Zellfraktionierung. Nach der Zentrifugation werden Organellen an ihrer isopyknen Oberfläche sedimentiert. Die Fraktionen werden gesammelt und für andere nachgelagerte Anwendungen verwendet. Hier beschrieben ist ein Protokoll zur Gewinnung einer Recycling-Endosomen-haltigen Fraktion aus transfizierten Säugetierzellen mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Die isolierten Fraktionen wurden zur Analyse ihres Proteingehalts einem Standard-Western-Blotting unterzogen. Durch die Anwendung dieser Methode identifizierten wir, dass die Plasmamembran, die auf Engulfment und Zellmotilität 1 (ELMO1), einen Ras-verwandten C3-Botulinumtoxin-Substrat 1 (Rac1) Guanin-Nukleotidaustauschfaktor, abzielt, durch ARF6-vermitteltes endozytäres Recycling erfolgt.
Einleitung
Der endosomale Transport ist ein essentieller physiologischer Prozess, der verschiedene biologische Ereignisse1impliziert, z. B. den Transport von Signalrezeptoren, Ionenkanälen und Adhäsionsmolekülen. Proteine, die an der Plasmamembran lokalisiert sind, werden durch Endozytoseinternalisiert 2. Die internalisierten Proteine werden dann nach dem frühen Endosom3sortiert. Einige der Proteine zielen auf Lysosomen zum Abbau ab4. Eine beträchtliche Menge an Proteinen wird jedoch durch schnelles Recycling und langsame Recyclingprozesse wieder auf die Zelloberfläche zurückgeführt. ....
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Protokoll
1. Zellkultur und Transfektion von Säugetieren
- Platte 2 x 106 Zellen in einer 100 mm Kulturschale. Verwenden Sie vier Gerichte für jede Transfektion.
HINWEIS: Die Anzahl der benötigten Zellen kann für verschiedene Zelllinien variieren. Möglicherweise ist eine Optimierung erforderlich, bevor Sie mit dem Isolationsschritt fortfahren. - Am nächsten Tag transfizieren Sie die Zellen mit Lipofektamin gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Zellernte
- Entsorgen Sie das Kulturmedium 48 h nach der Transfektion.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS (10 mM Natriumphosphate, 2,68 mM....
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Ergebnisse
Nach der Fraktionierung der nicht transfizierten HEK293-Zellen durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation wurden 12 Brüche von der Spitze des Gradienten gesammelt. Die geernteten Fraktionen wurden mit dem Verdünnungspuffer im Verhältnis 1:1 verdünnt und einer zweiten Zentrifugationsrunde unterzogen. Die Proben wurden dann einem Western Blotting unterzogen, um ihren Proteingehalt zu analysieren. Wie in Abbildung 1 gezeigt,wird der Recycling-Endosomenmarker Rab11 in Fraktion 7
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Diskussion
Das obige Protokoll beschreibt die Verfahren zur Isolierung von Recycling-Endosomen aus kultivierten Zellen durch Ultrazentrifugation. Die Zuverlässigkeit dieser Methode wurde durch die neueste Veröffentlichung22nachgewiesen, die beweist, dass Recycling-Endosomen erfolgreich aus anderen Organellen (Abbildung 1) wie dem Golgi-Apparat und den Mitochondrien isoliert werden. Einige kritische Schritte müssen beachtet werden, um ein gutes Trennergebnis zu erzielen. Bei der .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte mit dem Inhalt dieses Artikels haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Mittel des Research Grants Council Hong Kong, des CUHK Direct Grant Scheme, des United College Endowment Fund und des TUYF Charitable Trust unterstützt. Die Zahlen in dieser Arbeit wurden aus unserer früheren Publikation "ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1" übernommen, die im Oktober 2020 im FASEB Journal veröffentlicht wurde.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 ml, Dickwandiges Polypropylen-Röhrchen mit offenem Deckel, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm Gewebekulturschale | SPL | 20100 | |
| 13,2 ml, zertifiziertes freies Open-Top-Dünnwand-Ultra-Clear-Röhrchen, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Probenpuffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-freier Proteaseinhibitor-Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Kaninchen-mAb-Zellsignaltechnologie | 4850S | Monoklonaler Kaninchen-Antikörper zum Nachweis von COX IV. | |
| Cycloheximid | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit niedrigem Glukosegehalt | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 Antikörper (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Maus monoklonaler Antikörper zum Nachweis von ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 Antikörper (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | polyklonaler Antikörper aus Ziegen zum Nachweis von FE65. |
| Fötales Rinderserum, | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoklonaler Antikörper (6C5) | Ambion | AM4300 | Monoklonaler Maus-Antikörper zum Nachweis von GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Messung der Bandenintensität | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz | Invitrogen | 11668019 | |
| monoklonaler Anti-β-COP Antikörper | Sigma | G6160 | Maus monoklonaler Antikörper zum Nachweis von β-COP. |
| Myc-tag (9B11) Maus mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Monoklonaler Maus-Antikörper zum Nachweis von myc-markierten Proteinen. |
| OmniPur EDTA, Dinatriumsalz, Dihydrat | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tabletten | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | ||
| RAB11A-spezifischer polyklonaler Antikörper | Proteintech | 20229-1-AP | Polyklonaler Kaninchen-Antikörper zum Nachweis von Rab11. |
| Saccharose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Ausschwingrotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Festwinkelrotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0,05%), phenolrot | Gibco | 25300062 |
Referenzen
- Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research.
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Nachdrucke und Genehmigungen
