Erweiterung und Anreicherung von Gamma-Delta (γδ) T-Zellen aus Apheresed Human Product

Leukämierezidigung ist die häufigste Todesursache nach hämatopoetischer Zelltransplantation (HCT) bei Patienten mit AML1,2,3. Ein besseres leukämiefreies Überleben wurde mit der erhöhten Erholung von Blut-γδ-T-Zellen nach HCT ohne erhöhtes Risiko für eine Graft-versus-Host-Krankheit (GVHD)⁴ berichtet. Die Fähigkeit von γδ-T-Zellen, Antigene MHC-unabhängig zu erkennen und starke zytolytische und Th1-ähnliche Effektorfunktionen zu entwickeln, macht diese kleine Subpopulation von T-Zellen ideal für die Behandlung von AML-Patienten, die sich einer allogenen Transplantation mit Rückfallrisiko ^unterziehen5. Angesichts der Tatsache, dass die Vγ9Vδ2-T-Zellen eine untergeordnete Untergruppe von T-Lymphozyten im Bereich von 0,5% bis 5% der T-Zellen in der ^Peripherie6 sind, haben wir uns zum Ziel gesetzt, ein robustes System zur Erweiterung dieser seltenen Population von Blutzellen zu etablieren, um potenziell therapeutische Dosen für klinische Studien zu erreichen.

Obwohl andere erfolgreich γδ T-Zellen mit Zoledronsäure und sogar aAPCs erweitert haben, haben wir ein Verfahren entwickelt, das γδ T-Zellen potenziell um das 229.749-fache erweitern kann. Die Expansion ist biphasisch: Zuerst werden Lymphozyten durch Elutriation mit dem Trenninstrument gewonnen. Die Ausrüstung bietet ein geschlossenes System, das die Trennung von Zellen basierend auf ihrer Größe, Form und Dichte durch Gegenstromzentrifugation ermöglicht. Nach der Anreicherung für Lymphozyten wird die selektive Expansion von Vγ9Vδ2 T-Zellen durch Behandlung mit Zoledronsäure und IL-2 für 7 Tage erreicht. Unmittelbar nach dieser Behandlung werden TCR-αβ T-Zellen mit Hilfe der Mikrokügelchentechnologie depletiert, was eine anschließende Erweiterung der γδ-T-Zellen mit K562-abgeleiteten aAPCs ermöglicht.

Für die Prozessvalidierung wurden nur 5 × ¹⁰⁶ Zoledronsäure-expandierte γδ T-Zellen für die Phase-2-Cokulturexpansion mit aAPCs verwendet. In dieser zweiten Expansionsphase werden γδ-T-Zellen unter Verwendung einer aktuellen Good Manufacturing Practices (cGMP)-konformen Working Cell Bank (WCB) aus gentechnisch veränderten K562-abgeleiteten AAPCs (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) aktiviert, die bei Moffitt hergestellt werden. Die Begründung für diese biphasische Expansion basiert auf der Fähigkeit von Zoledronsäure, die Farnesyldiphosphat-Synthase (FDPS) in Monozyten zu hemmen, was zur Akkumulation von Isopentenylpyrophosphat führt, das die Vγ2Vδ2-Zellen direkt stimuliert. In der zweiten Expansionsphase bieten die von K562 abgeleiteten aAPCs (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) eine robuste Stimulation für alle T-Zellen. Das Zellprodukt wurde jedoch bereits für die γδ-T-Zellen angereichert, was zu einer robusten Expansion der γδ-T-Zellen führt.

Durch die Verwendung von speziellen Geräten und Kolben ist das Verfahren ein funktional geschlossenes System, wodurch das Risiko einer Kontamination verringert wird. Darüber hinaus ermöglicht der 1-l-Bioreaktor mit geschlossenem System ein maximales Wachstum und eine maximale Ausdehnung der Zellen in einem Gesamtvolumen von 1 L Medium mit minimalem Fütterungsbedarf. Der Vorteil der Moffitt-Methode besteht darin, dass sie ein schnelles, reproduzierbares und sehr praktikables GMP-System zur Herstellung eines hochreinen, aus dem Spender gewonnenen γδ-T-Zellprodukts für die allogene Verabreichung bietet. Diese Methode kann auf jede klinische Studie angewendet werden, die darauf abzielt, menschliche γδ T-Zellen, die Vγ2Vδ2-T-Zellrezeptoren exprimieren, als adoptive Immuntherapie zu verwenden, um immunität gegen Mikroben und Tumore bei Krebspatienten mit partieller und vollständiger Remission zu vermitteln. Darüber hinaus bietet es eine robuste Plattform für die Entwicklung und Produktion von γδ-chimären Antigenrezeptor-positiven (CAR⁺) T-Zellen.

HINWEIS: Die IRB-Genehmigung wurde eingeholt, und die Einwilligung der Spender nach Aufklärung wurde eingeholt.

1. Lymphozytenisolierung

1. Das Aphereseprodukt in einen Reinraum überführen.
   HINWEIS: Die Prozessvalidierung wurde unter Verwendung der normalen Spenderapherese von einem externen kommerziellen Anbieter durchgeführt, der den Vorschriften für die Sammlung von Rohzellstoffen entspricht.
2. Sammeln Sie Proben für Sterilitätstests, Zellzahl und Zellphänotypisierung.
3. Elutriat auf der Gegenstromzentrifugationsvorrichtung unter Verwendung eines primären Mediums von Hanks Balanced Salt Solution mit 1% humanem Serumalbumin (HSA) und einem sekundären Medium Kochsalzlösung (0,9% Natriumchlorid Injektions-USP) oder Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS). Stellen Sie die Elutriationszentrifugationsgeschwindigkeit auf 900 × g ein und sammeln Sie Fraktionen basierend auf Durchflussrate und Zeit.
4. Sammeln Sie Proben von Fraktion 2 und führen Sie die folgenden Tests durch: 2 ml für die Sterilitätsprüfung; 0,5 ml für Zellzahl und Lebensfähigkeit unter Verwendung von Acridinorange/Propidiumiodid (AO/PI); 5 × ¹⁰⁶ Zellen für die Zellphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie.
5. Expansion einer reinen Lymphozytenfraktion (Fraktion 2) von Zellen in Kultur bei 10 × ¹⁰⁶ Zellen/^cm2 in einem 1 L Geschlossensystem-Bioreaktor mit 5 μmol/L Zoledronsäure und 300 I.E./ml IL-2.
6. Sieben Tage lang in einem bei 37 °C eingestellten Inkubator mit 5% _{CO2 inkubieren}.

2. Alpha-Beta (αβ) T-Zell-Depletion

1. Ernte von Zellen aus dem 1 L-Bioreaktorkolben mit geschlossenem System. Schweißen Sie ein 1-Liter-Transferpaket steril an die rote Linie des Bioreaktors mit geschlossenem System und verwenden Sie die entsprechende pharmazeutische Pumpe, um die Zellen in das Transferpaket zu übertragen.
2. Nehmen Sie die folgenden Proben: 10 ml für verbrauchte mittlere Sterilität; 0,5 ml Zellen für Zellanzahl und Lebensfähigkeit unter Verwendung von AO / PI; 5 × ¹⁰⁶ Zellen für die Durchflusszytometrie
3. Resuspendieren Sie die Zellen bei ~5 × ¹⁰⁸ Zellen/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder (PBS/Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)) Puffer + 0,5% HSA und biotinyliertem TCR αβ-spezifischem Antikörper.
4. Den Shaker in den Kühlschrank stellen und die Zellen bei 2-8 °C ca. 15 min unter Schütteln inkubieren.
5. Waschen Sie die Zellen mit insgesamt 600 ml PBS/EDTA-Puffer + 0,5% HSA. Zentrifuge zur Entfernung des ungebundenen Antikörpers bei 200-500 × g für 15 min bei 2-8 °C. Resuspend ~5 × ¹⁰⁸ Zellen/ml im PBS/EDTA-Puffer + 0,5% HSA mit Anti-Biotin-spezifischen Mikrokügelchen (7,5 ml/1 Durchstechflasche).
6. Den Shaker in den Kühlschrank stellen und die Zellen bei 2-8 °C ca. 15 min unter Schütteln inkubieren. Nach der Inkubation werden die Zellen bei 200-500 × g für 15 min bei 2-8 °C zentrifugiert, um die ungebundenen Mikrokügelchen zu entfernen. Resuspend ~ 6 × ¹⁰⁷ Zellen / ml in PBS / EDTA-Puffer + 0,5% HSA und übertragen Sie sie in einen Transferpackbeutel.
7. Installieren Sie den Schlauchsatz in der magnetischen Zelltrennvorrichtung in klinischer Qualität, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen, legen Sie die Packungen mit dem PBS / EDTA-Puffer und das Transferpaket mit dem Zellprodukt in das Instrument und spitzen Sie es auf Anweisung des Geräts.
8. Wählen Sie das Depletion 1.2-Protokoll für die Depletion der markierten αβ T-Zellen aus.
9. Zentrifugieren Sie die Zielfraktion (angereicherte γδ T-Zellen) und resuspenieren Sie die Zellen in Medium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum.
10. Nehmen Sie eine 0,5 ml Probe und führen Sie eine Zellzahl und Lebensfähigkeit mit AO / PI-Färbung durch. Bringen Sie die Zellen auf eine Endkonzentration von etwa 1 × ¹⁰⁶ Zellen / ml. Nehmen Sie eine Probe von 5 × ¹⁰⁶ Zellen des Produkts für die Durchflusszytometrie-Phänotypisierung nach der Depletion.

3. Co-Kultur mit aAPCs

1. Bestrahlung von 5 × ¹⁰⁷ aAPCs/Kolben bei 100 Gy auf das Röntgengerät.
2. Verwenden Sie die aAPCs in Co-Kultur im Verhältnis 10:1 mit den γδ T-Zellen. Die bestrahlten aAPCs (5 × ¹⁰⁷ Zellen/Kolben) und γδ T-Zellen (5 × ¹⁰⁶ Zellen/Kolben) werden in 1 L-Bioreaktorflaschen mit 1 L Kulturmedium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum, gegeben. Samen Sie bis zu 10 Kolben.
3. Die Zellen in Kultur für 10 Tage in einem Inkubator bei 37 °C und 5% _{CO2 ausdehnen}.
4. Überwachen Sie den Glukose- und Laktatspiegel alle 3-4 Tage mit Streifen, Glukose und einem Laktatmessgerät.
5. Wenn die Glukose auf 250 mg/dl sinkt, wird das Volumen im Kolben mit einer pharmazeutischen Pumpe auf 200 ml reduziert, indem eine 1-Liter-Transferpackung zur roten Linie des Bioreaktors des geschlossenen Systems steril geschweißt wird.
6. Mischen Sie die Zellen in den verbleibenden 200 ml und nehmen Sie eine 0,5 ml Probe für die Zellzählung und Lebensfähigkeitsmessung durch AO-PI-Färbung. Wenn die Zellzahl ≥¹⁰⁹ beträgt, teilen Sie einen Kolben in zwei Kolben auf und füllen Sie jeden Kolben bis zu 1 l mit AIM-V, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum. Wenn die Zellzahl <¹⁰⁹ beträgt, füttern Sie die Zellen mit einem frischen Liter Kulturmedium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum.
7. Wiederholen Sie Schritt 3.6 für alle Kolben und bringen Sie sie bei 37 °C und 5 % _CO2 in den Inkubator zurück. Wiederholen Sie die Schritte 3.4-3.7 alle 3 bis 4 Tage.

4. Zellernte

1. Am Ende von 10 Tagen in Co-Kultur alle Bioreaktorkolben ernten. Ernten Sie jeweils 1 Bioreaktorkolben und fassen Sie alle Zellen in einer Transferpackung von geeigneter Größe zusammen. Schweißen Sie das Transferpaket steril an die rote Linie des Bioreaktors des geschlossenen Systems und verwenden Sie die pharmazeutische Pumpe, um die Zellen in das Transferpaket zu übertragen.
2. Entfernen Sie die folgenden Qualitätskontrollproben: 1% des Arzneimittels (DP) für die Sterilität durch Blutkultur und Grammfärbung; 0,5 ml für Zellzählung und Lebensfähigkeit mit AO/PI; 5-10 × ¹⁰⁶ Zellen für die Durchflusszytometrie (siehe Abbildung 1 zur Gating-Strategie); 0,5 ml für Endotoxin; 0,5 ml für gramm Färben; ¹⁰⁶ Zellen wurden für Mykoplasmentests auf 10 ml verbrauchtes Medium aufgespießt.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200-500 × g für 15 min bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den Überstand.
4. Waschen Sie die Zellen in einer Lösung aus ausgewogener kristalloider Lösung + 0,5% HSA bei 200-500 × g für 15 min bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie sie in einem Zielvolumen von 100-300 ml balancierter kristalloider Lösung + 0,5% HSA.

5. Release-Tests

1. Durchführung von Qualitätskontrolltests der γδ-T-Zelle DP auf Folgendes: Reinheit und Identität durch Durchflusszytometrie (Lebend/Tot, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); Lebensfähigkeit durch AO/PI-Färbung; Endotoxin; Mykoplasmentest durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR); Sterilität durch Grammfärbung und aerobe und anaerobe Blutkulturen; Rest-K562-Assay mittels Durchflusszytometrie (CD3-CD16-CD56-CD71⁺).

Der γδ-T-Zell-Prozess wurde für die Herstellung des γδ-T-Zell-Wirkstoffprodukts charakterisiert und optimiert. Die Prozessoptimierung umfasste 1) Lymphozytenanreicherung mittels Elutriation, 2) γδ-T-Zell-Wirkstoffsubstanz (DS) zellspezifische Expansion mit Zoledronsäure, 3) γδ T-Zell-DS-Depletion von TCRαβ, 4) sekundäre Expansion der γδ-T-Zell-DS unter Verwendung von K562-abgeleiteten aAPCs und 5) endgültige DP-Ernte und Formulierung des Produkts zur Verabreichung oder Kryokonservierung. Nach der Prozessoptimierung wurden Bestätigungsläufe in großem Maßstab unter Verwendung des von drei gesunden Spendern gewonnenen Materials durchgeführt, um die Eignung der Zellverarbeitung zu bestätigen. Alle Daten wurden analysiert und sind in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3 zusammengefasst. Die von der Post-Counterflow-Zentrifugationsfraktion 2 (F2) getrennten Zellen ergaben eine reine Lymphozytenpopulation mit durchschnittlich 99,23% CD45+ -Zellen (berichtet als Häufigkeit des gesamten Live-Gates) und einer ausgezeichneten durchschnittlichen Lebensfähigkeit von 95,80% (Tabelle 1).

Die γδ-T-Zell-spezifische Expansion mit Zoledronsäure hing vom Anfangsprozentsatz der natürlichen Killerzellen (NK) ab, die nach der Elutriation in der Lymphozytenfraktion (F2) vorhanden waren. Die Anreicherung von γδ-T-Zell-DS mit TCRαβ-Depletion war konsistent (Tabelle 2). Die aus drei gesunden Spendern hergestellte γδ-T-Zell-DP hatte durchschnittlich 0,11% ± 0,05% CD20+ B-Zellen und 0,00% ± 0,00% TCR αβ+ T-Zellen und erfüllte damit das Freisetzungskriterium von ≤1% der TCR αβ+ T-Zellen. Der durchschnittliche Prozentsatz der NK-Zellen im Endprodukt beträgt 17,06% ± 26,19% und erfüllt das Freisetzungskriterium von <35%. Darüber hinaus betrug der durchschnittliche Prozentsatz der T-Zell- und NK-Zelllinien-negativen Zellen im Endprodukt 0,48% ± 0,42% (Tabelle 3). Zelloberflächenfärbung und durchflusszytometrische Analyse wurden verwendet, um die Identität, Reinheit und Prozessverunreinigungen von DS und DP zu charakterisieren, wie in Abbildung 2A-D gezeigt.

Die sekundäre Expansion, die durch die Kokultur der aAPC (K562CL6(CD3-CD137L:CD28-IL-15RA)) WCB und γδ T Zell DS im Verhältnis 10:1 erreicht wurde, erzeugte eine γδ T-Zell-DP, die alle Freisetzungskriterien erfüllte, wie in Tabelle 4 gezeigt. Darüber hinaus wurden die Zellen gefärbt und mittels Durchflusszytometrie an Tag 0-Gegenstromzentrifugation F2-Zellen, Tag 7-Zoledronsäure-expandierte T-Zellen, Tag 7-TCR αβ T-Zell-Depletion, Tag 17-final DP für die folgenden Biomarker Cluster der Differenzierung (CD) 3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CC Chemokinrezeptor 7 (CCR7), programmiertes Zelltodprotein-1 (PD-1), zytotoxisches T-Lymphozyten-assoziiertes Protein 4 (CTLA4), Lymphozyten-aktivierendes Gen 3 (LAG3) und T-Zell-Immunglobulin und Mucin-Domänen-haltiges Protein 3 (TIM3). Die in Abbildung 3 gezeigten Daten werden aus drei unabhängigen Durchläufen gemittelt und zeigen, dass die Zellen die Erschöpfung noch nicht erreicht haben. Das Moffitt CTF entwickelte auch einen Rest-K562-Assay, um die DP-Verunreinigungen im Zusammenhang mit den von K562 abgeleiteten aAPCs zu bestimmen (Abbildung 4).

Die durchflusszytometrische Gating-Strategie, die zur Charakterisierung der Prozentsätze der Zelltypen verwendet wurde, war wie folgt: 1) Gating auf T- und NK-Zelllinien-negativer Population (CD3-CD56-CD16-); 2) Gate auf CD71+ (Transferrinrezeptor exprimiert in erythroider Abstammung und AML ermöglicht den Nachweis von K562-Restzellen). Diese Gating-Strategie ermöglichte die Auswertung der CD3-CD16-CD56-CD71+-Zellen, bei denen es sich um die aAPC(K562CL6(scFv-CD3-CD137;scFv-CD28-IL15-RA)) WCB (in Abbildung 4 als "Residual K562" bezeichnet) handelt.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.