Methodenartikel

Erweiterung und Anreicherung von Gamma-Delta (γδ) T-Zellen aus Apheresed Human Product

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DOI:

10.3791/62622

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22. September 2021

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1Cell Therapy Facility, Moffitt Cancer Center and Research Institute, 2Department of Immunology, Moffitt Cancer Center and Research Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Vorgestellt wird ein Protokoll für die Expansion von Gamma-Delta (γδ) T-Zell-Arzneimittel. Lymphozyten werden durch Elutriation isoliert und γδ-angereichert mit Zoledronsäure und Interleukin-2. Alpha-Beta-T-Zellen werden mit einem magnetischen Trenngerät in klinischer Qualität erschöpft. Die γδ-Zellen werden mit K562-abgeleiteten, künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen ko-kultiviert und expandiert.

Zusammenfassung

Obwohl Vγ9Vδ2-T-Zellen eine untergeordnete Untergruppe von T-Lymphozyten sind, ist diese Population wegen ihrer Fähigkeit gefragt, Antigene in einer MHC-unabhängigen Weise zu erkennen und eine starke zytolytische Effektorfunktion zu entwickeln, die sie zu einem idealen Kandidaten für die Krebsimmuntherapie macht. Aufgrund der geringen Häufigkeit von Gamma-Delta (γδ) T-Zellen im peripheren Blut haben wir ein effektives Protokoll entwickelt, um ein hochreines γδ-T-Zell-Arzneimittel für die erstmalige Verwendung von allogenen γδ-T-Zellen bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) stark zu erweitern. Unter Verwendung einer gesunden Spenderapherese als allogene Zellquelle werden die Lymphozyten mit einem validierten Gerät für eine Gegenstromzentrifugationsmethode zur Trennung von Zellen nach Größe und Dichte isoliert.

Die lymphozytenreiche Fraktion wird genutzt, und die γδ T-Zellen werden bevorzugt mit Zoledronsäure (FDA-zugelassen) und Interleukin (IL)-2 für 7 Tage aktiviert. Nach der bevorzugten Expansion von γδ-T-Zellen werden ein magnetisches Zelltrennvorrichtung klinischer Qualität und TCRαβ-Kügelchen verwendet, um kontaminierende T-Zell-Rezeptor-(TCR)αβ-T-Zellen zu depletieren. Die hochangereicherten γδ-T-Zellen durchlaufen dann eine zweite Expansion unter Verwendung von künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen (aAPCs), die aus K562-Zellen abgeleitet sind - gentechnisch verändert, um ein einkettiges variables Fragment (scFv) für CD3 und CD28, 41BBL (CD137L) und IL15-RA zusammen mit Zoledronsäure und IL-2 zu exprimieren. Die Aussaat aller day-7 angereicherten γδ T-Zellen in Kokultur mit den aAPCs erleichtert die Herstellung hochreiner γδ T-Zellen mit einer durchschnittlichen Faltenausdehnung von >229.000-fach aus gesundem Spenderblut.

Einleitung

Leukämierezidigung ist die häufigste Todesursache nach hämatopoetischer Zelltransplantation (HCT) bei Patienten mit AML1,2,3. Ein besseres leukämiefreies Überleben wurde mit der erhöhten Erholung von Blut-γδ-T-Zellen nach HCT ohne erhöhtes Risiko für eine Graft-versus-Host-Krankheit (GVHD)4 berichtet. Die Fähigkeit von γδ-T-Zellen, Antigene MHC-unabhängig zu erkennen und starke zytolytische und Th1-ähnliche Effektorfunktionen zu entwickeln, macht diese kleine Subpopulation von T-Zellen ideal für die Behandlung von AML-Patienten, die sich einer allogenen Transplantation mit Rückfallrisiko unterziehen5. Angesichts der Tatsache, dass die Vγ9Vδ2-T-Zellen eine untergeordnete Untergruppe von T-Lymphozyten im Bereich von 0,5% bis 5% der T-Zellen in der Peripherie6 sind, haben wir uns zum Ziel gesetzt, ein robustes System zur Erweiterung dieser seltenen Population von Blutzellen zu etablieren, um potenziell therapeutische Dosen für klinische Studien zu erreichen.

Obwohl andere erfolgreich γδ T-Zellen mit Zoledronsäure und sogar aAPCs erweitert haben, haben wir ein Verfahren entwickelt, das γδ T-Zellen potenziell um das 229.749-fache erweitern kann. Die Expansion ist biphasisch: Zuerst werden Lymphozyten durch Elutriation mit dem Trenninstrument gewonnen. Die Ausrüstung bietet ein geschlossenes System, das die Trennung von Zellen basierend auf ihrer Größe, Form und Dichte durch Gegenstromzentrifugation ermöglicht. Nach der Anreicherung für Lymphozyten wird die selektive Expansion von Vγ9Vδ2 T-Zellen durch Behandlung mit Zoledronsäure und IL-2 für 7 Tage erreicht. Unmittelbar nach dieser Behandlung werden TCR-αβ T-Zellen mit Hilfe der Mikrokügelchentechnologie depletiert, was eine anschließende Erweiterung der γδ-T-Zellen mit K562-abgeleiteten aAPCs ermöglicht.

Für die Prozessvalidierung wurden nur 5 × 106 Zoledronsäure-expandierte γδ T-Zellen für die Phase-2-Cokulturexpansion mit aAPCs verwendet. In dieser zweiten Expansionsphase werden γδ-T-Zellen unter Verwendung einer aktuellen Good Manufacturing Practices (cGMP)-konformen Working Cell Bank (WCB) aus gentechnisch veränderten K562-abgeleiteten AAPCs (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) aktiviert, die bei Moffitt hergestellt werden. Die Begründung für diese biphasische Expansion basiert auf der Fähigkeit von Zoledronsäure, die Farnesyldiphosphat-Synthase (FDPS) in Monozyten zu hemmen, was zur Akkumulation von Isopentenylpyrophosphat führt, das die Vγ2Vδ2-Zellen direkt stimuliert. In der zweiten Expansionsphase bieten die von K562 abgeleiteten aAPCs (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) eine robuste Stimulation für alle T-Zellen. Das Zellprodukt wurde jedoch bereits für die γδ-T-Zellen angereichert, was zu einer robusten Expansion der γδ-T-Zellen führt.

Durch die Verwendung von speziellen Geräten und Kolben ist das Verfahren ein funktional geschlossenes System, wodurch das Risiko einer Kontamination verringert wird. Darüber hinaus ermöglicht der 1-l-Bioreaktor mit geschlossenem System ein maximales Wachstum und eine maximale Ausdehnung der Zellen in einem Gesamtvolumen von 1 L Medium mit minimalem Fütterungsbedarf. Der Vorteil der Moffitt-Methode besteht darin, dass sie ein schnelles, reproduzierbares und sehr praktikables GMP-System zur Herstellung eines hochreinen, aus dem Spender gewonnenen γδ-T-Zellprodukts für die allogene Verabreichung bietet. Diese Methode kann auf jede klinische Studie angewendet werden, die darauf abzielt, menschliche γδ T-Zellen, die Vγ2Vδ2-T-Zellrezeptoren exprimieren, als adoptive Immuntherapie zu verwenden, um immunität gegen Mikroben und Tumore bei Krebspatienten mit partieller und vollständiger Remission zu vermitteln. Darüber hinaus bietet es eine robuste Plattform für die Entwicklung und Produktion von γδ-chimären Antigenrezeptor-positiven (CAR+) T-Zellen.

Protokoll

HINWEIS: Die IRB-Genehmigung wurde eingeholt, und die Einwilligung der Spender nach Aufklärung wurde eingeholt.

1. Lymphozytenisolierung

  1. Das Aphereseprodukt in einen Reinraum überführen.
    HINWEIS: Die Prozessvalidierung wurde unter Verwendung der normalen Spenderapherese von einem externen kommerziellen Anbieter durchgeführt, der den Vorschriften für die Sammlung von Rohzellstoffen entspricht.
  2. Sammeln Sie Proben für Sterilitätstests, Zellzahl und Zellphänotypisierung.
  3. Elutriat auf der Gegenstromzentrifugationsvorrichtung unter Verwendung eines primären Mediums von Hanks Balanced Salt Solution mit 1% humanem Serumalbumin (HSA) und einem sekundären Medium Kochsalzlösung (0,9% Natriumchlorid Injektions-USP) oder Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS). Stellen Sie die Elutriationszentrifugationsgeschwindigkeit auf 900 × g ein und sammeln Sie Fraktionen basierend auf Durchflussrate und Zeit.
  4. Sammeln Sie Proben von Fraktion 2 und führen Sie die folgenden Tests durch: 2 ml für die Sterilitätsprüfung; 0,5 ml für Zellzahl und Lebensfähigkeit unter Verwendung von Acridinorange/Propidiumiodid (AO/PI); 5 × 106 Zellen für die Zellphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie.
  5. Expansion einer reinen Lymphozytenfraktion (Fraktion 2) von Zellen in Kultur bei 10 × 106 Zellen/cm2 in einem 1 L Geschlossensystem-Bioreaktor mit 5 μmol/L Zoledronsäure und 300 I.E./ml IL-2.
  6. Sieben Tage lang in einem bei 37 °C eingestellten Inkubator mit 5% CO2 inkubieren.

2. Alpha-Beta (αβ) T-Zell-Depletion

  1. Ernte von Zellen aus dem 1 L-Bioreaktorkolben mit geschlossenem System. Schweißen Sie ein 1-Liter-Transferpaket steril an die rote Linie des Bioreaktors mit geschlossenem System und verwenden Sie die entsprechende pharmazeutische Pumpe, um die Zellen in das Transferpaket zu übertragen.
  2. Nehmen Sie die folgenden Proben: 10 ml für verbrauchte mittlere Sterilität; 0,5 ml Zellen für Zellanzahl und Lebensfähigkeit unter Verwendung von AO / PI; 5 × 106 Zellen für die Durchflusszytometrie
  3. Resuspendieren Sie die Zellen bei ~5 × 108 Zellen/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder (PBS/Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)) Puffer + 0,5% HSA und biotinyliertem TCR αβ-spezifischem Antikörper.
  4. Den Shaker in den Kühlschrank stellen und die Zellen bei 2-8 °C ca. 15 min unter Schütteln inkubieren.
  5. Waschen Sie die Zellen mit insgesamt 600 ml PBS/EDTA-Puffer + 0,5% HSA. Zentrifuge zur Entfernung des ungebundenen Antikörpers bei 200-500 × g für 15 min bei 2-8 °C. Resuspend ~5 × 108 Zellen/ml im PBS/EDTA-Puffer + 0,5% HSA mit Anti-Biotin-spezifischen Mikrokügelchen (7,5 ml/1 Durchstechflasche).
  6. Den Shaker in den Kühlschrank stellen und die Zellen bei 2-8 °C ca. 15 min unter Schütteln inkubieren. Nach der Inkubation werden die Zellen bei 200-500 × g für 15 min bei 2-8 °C zentrifugiert, um die ungebundenen Mikrokügelchen zu entfernen. Resuspend ~ 6 × 107 Zellen / ml in PBS / EDTA-Puffer + 0,5% HSA und übertragen Sie sie in einen Transferpackbeutel.
  7. Installieren Sie den Schlauchsatz in der magnetischen Zelltrennvorrichtung in klinischer Qualität, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen, legen Sie die Packungen mit dem PBS / EDTA-Puffer und das Transferpaket mit dem Zellprodukt in das Instrument und spitzen Sie es auf Anweisung des Geräts.
  8. Wählen Sie das Depletion 1.2-Protokoll für die Depletion der markierten αβ T-Zellen aus.
  9. Zentrifugieren Sie die Zielfraktion (angereicherte γδ T-Zellen) und resuspenieren Sie die Zellen in Medium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum.
  10. Nehmen Sie eine 0,5 ml Probe und führen Sie eine Zellzahl und Lebensfähigkeit mit AO / PI-Färbung durch. Bringen Sie die Zellen auf eine Endkonzentration von etwa 1 × 106 Zellen / ml. Nehmen Sie eine Probe von 5 × 106 Zellen des Produkts für die Durchflusszytometrie-Phänotypisierung nach der Depletion.

3. Co-Kultur mit aAPCs

  1. Bestrahlung von 5 × 107 aAPCs/Kolben bei 100 Gy auf das Röntgengerät.
  2. Verwenden Sie die aAPCs in Co-Kultur im Verhältnis 10:1 mit den γδ T-Zellen. Die bestrahlten aAPCs (5 × 107 Zellen/Kolben) und γδ T-Zellen (5 × 106 Zellen/Kolben) werden in 1 L-Bioreaktorflaschen mit 1 L Kulturmedium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum, gegeben. Samen Sie bis zu 10 Kolben.
  3. Die Zellen in Kultur für 10 Tage in einem Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 ausdehnen.
  4. Überwachen Sie den Glukose- und Laktatspiegel alle 3-4 Tage mit Streifen, Glukose und einem Laktatmessgerät.
  5. Wenn die Glukose auf 250 mg/dl sinkt, wird das Volumen im Kolben mit einer pharmazeutischen Pumpe auf 200 ml reduziert, indem eine 1-Liter-Transferpackung zur roten Linie des Bioreaktors des geschlossenen Systems steril geschweißt wird.
  6. Mischen Sie die Zellen in den verbleibenden 200 ml und nehmen Sie eine 0,5 ml Probe für die Zellzählung und Lebensfähigkeitsmessung durch AO-PI-Färbung. Wenn die Zellzahl ≥109 beträgt, teilen Sie einen Kolben in zwei Kolben auf und füllen Sie jeden Kolben bis zu 1 l mit AIM-V, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum. Wenn die Zellzahl <109 beträgt, füttern Sie die Zellen mit einem frischen Liter Kulturmedium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum.
  7. Wiederholen Sie Schritt 3.6 für alle Kolben und bringen Sie sie bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator zurück. Wiederholen Sie die Schritte 3.4-3.7 alle 3 bis 4 Tage.

4. Zellernte

  1. Am Ende von 10 Tagen in Co-Kultur alle Bioreaktorkolben ernten. Ernten Sie jeweils 1 Bioreaktorkolben und fassen Sie alle Zellen in einer Transferpackung von geeigneter Größe zusammen. Schweißen Sie das Transferpaket steril an die rote Linie des Bioreaktors des geschlossenen Systems und verwenden Sie die pharmazeutische Pumpe, um die Zellen in das Transferpaket zu übertragen.
  2. Entfernen Sie die folgenden Qualitätskontrollproben: 1% des Arzneimittels (DP) für die Sterilität durch Blutkultur und Grammfärbung; 0,5 ml für Zellzählung und Lebensfähigkeit mit AO/PI; 5-10 × 106 Zellen für die Durchflusszytometrie (siehe Abbildung 1 zur Gating-Strategie); 0,5 ml für Endotoxin; 0,5 ml für gramm Färben; 106 Zellen wurden für Mykoplasmentests auf 10 ml verbrauchtes Medium aufgespießt.
  3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200-500 × g für 15 min bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den Überstand.
  4. Waschen Sie die Zellen in einer Lösung aus ausgewogener kristalloider Lösung + 0,5% HSA bei 200-500 × g für 15 min bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie sie in einem Zielvolumen von 100-300 ml balancierter kristalloider Lösung + 0,5% HSA.

5. Release-Tests

  1. Durchführung von Qualitätskontrolltests der γδ-T-Zelle DP auf Folgendes: Reinheit und Identität durch Durchflusszytometrie (Lebend/Tot, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); Lebensfähigkeit durch AO/PI-Färbung; Endotoxin; Mykoplasmentest durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR); Sterilität durch Grammfärbung und aerobe und anaerobe Blutkulturen; Rest-K562-Assay mittels Durchflusszytometrie (CD3-CD16-CD56-CD71+).

Ergebnisse

Der γδ-T-Zell-Prozess wurde für die Herstellung des γδ-T-Zell-Wirkstoffprodukts charakterisiert und optimiert. Die Prozessoptimierung umfasste 1) Lymphozytenanreicherung mittels Elutriation, 2) γδ-T-Zell-Wirkstoffsubstanz (DS) zellspezifische Expansion mit Zoledronsäure, 3) γδ T-Zell-DS-Depletion von TCRαβ, 4) sekundäre Expansion der γδ-T-Zell-DS unter Verwendung von K562-abgeleiteten aAPCs und 5) endgültige DP-Ernte und Formulierung des Produkts zur Verabreichung oder Kryokonservierung. Nach der Prozessoptimierung wurden Bestätigungsläufe in großem Maßstab unter Verwendung des von drei gesunden Spendern gewonnenen Materials durchgeführt, um die Eignung der Zellverarbeitung zu bestätigen. Alle Daten wurden analysiert und sind in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3 zusammengefasst. Die von der Post-Counterflow-Zentrifugationsfraktion 2 (F2) getrennten Zellen ergaben eine reine Lymphozytenpopulation mit durchschnittlich 99,23% CD45+ -Zellen (berichtet als Häufigkeit des gesamten Live-Gates) und einer ausgezeichneten durchschnittlichen Lebensfähigkeit von 95,80% (Tabelle 1).

Die γδ-T-Zell-spezifische Expansion mit Zoledronsäure hing vom Anfangsprozentsatz der natürlichen Killerzellen (NK) ab, die nach der Elutriation in der Lymphozytenfraktion (F2) vorhanden waren. Die Anreicherung von γδ-T-Zell-DS mit TCRαβ-Depletion war konsistent (Tabelle 2). Die aus drei gesunden Spendern hergestellte γδ-T-Zell-DP hatte durchschnittlich 0,11% ± 0,05% CD20+ B-Zellen und 0,00% ± 0,00% TCR αβ+ T-Zellen und erfüllte damit das Freisetzungskriterium von ≤1% der TCR αβ+ T-Zellen. Der durchschnittliche Prozentsatz der NK-Zellen im Endprodukt beträgt 17,06% ± 26,19% und erfüllt das Freisetzungskriterium von <35%. Darüber hinaus betrug der durchschnittliche Prozentsatz der T-Zell- und NK-Zelllinien-negativen Zellen im Endprodukt 0,48% ± 0,42% (Tabelle 3). Zelloberflächenfärbung und durchflusszytometrische Analyse wurden verwendet, um die Identität, Reinheit und Prozessverunreinigungen von DS und DP zu charakterisieren, wie in Abbildung 2A-D gezeigt.

Die sekundäre Expansion, die durch die Kokultur der aAPC (K562CL6(CD3-CD137L:CD28-IL-15RA)) WCB und γδ T Zell DS im Verhältnis 10:1 erreicht wurde, erzeugte eine γδ T-Zell-DP, die alle Freisetzungskriterien erfüllte, wie in Tabelle 4 gezeigt. Darüber hinaus wurden die Zellen gefärbt und mittels Durchflusszytometrie an Tag 0-Gegenstromzentrifugation F2-Zellen, Tag 7-Zoledronsäure-expandierte T-Zellen, Tag 7-TCR αβ T-Zell-Depletion, Tag 17-final DP für die folgenden Biomarker Cluster der Differenzierung (CD) 3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CC Chemokinrezeptor 7 (CCR7), programmiertes Zelltodprotein-1 (PD-1), zytotoxisches T-Lymphozyten-assoziiertes Protein 4 (CTLA4), Lymphozyten-aktivierendes Gen 3 (LAG3) und T-Zell-Immunglobulin und Mucin-Domänen-haltiges Protein 3 (TIM3). Die in Abbildung 3 gezeigten Daten werden aus drei unabhängigen Durchläufen gemittelt und zeigen, dass die Zellen die Erschöpfung noch nicht erreicht haben. Das Moffitt CTF entwickelte auch einen Rest-K562-Assay, um die DP-Verunreinigungen im Zusammenhang mit den von K562 abgeleiteten aAPCs zu bestimmen (Abbildung 4).

Die durchflusszytometrische Gating-Strategie, die zur Charakterisierung der Prozentsätze der Zelltypen verwendet wurde, war wie folgt: 1) Gating auf T- und NK-Zelllinien-negativer Population (CD3-CD56-CD16-); 2) Gate auf CD71+ (Transferrinrezeptor exprimiert in erythroider Abstammung und AML ermöglicht den Nachweis von K562-Restzellen). Diese Gating-Strategie ermöglichte die Auswertung der CD3-CD16-CD56-CD71+-Zellen, bei denen es sich um die aAPC(K562CL6(scFv-CD3-CD137;scFv-CD28-IL15-RA)) WCB (in Abbildung 4 als "Residual K562" bezeichnet) handelt.

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Diskussion

Das Moffit Cell Therapy Lab hat ein Protokoll mit einer biphasischen Expansion von hochreinen γδ T-Zellen für den Einsatz als DP in klinischen Studien entwickelt. Dieses Protokoll bietet eine Herstellungsmethode nach cGMP-Richtlinien in einem geschlossenen System, die eine hochreine γδ-T-Zell-DP ergibt, die erfolgreich durch Zoledronsäure und die WCB-aAPCs aktiviert und expandiert wird. Dieses Protokoll wurde von der FDA für die Herstellung eines allogenen γδ-T-Zell-DP für AML-Patienten zugelassen. Mit gesunden Spendern konnten wir die kleine Population von Spender-γδ-T-Zellen in nur 7 Tagen von 2,06 ± 0,45% auf 54,45 ± 28,34% erweitern. Nach der 7-tägigen Expansion mit Zoledronsäure wurde beobachtet, dass Spender 2 eine Zunahme der NK-Population aufwies.

Zoledronsäure hemmt die Farnesyldiphosphat-Synthase (FDPS) in Monozyten, was wiederum zur Akkumulation von Isopentenylpyrophosphat (IPP) führt, was mit einer signifikanten Zunahme der Proliferation von T-Zellen und natürlichen NK-Zellen korreliert wurde7,8,9. Diese erhöhte NK-Population behindert die 2. Expansionsphase mit den aAPCs, da die aAPCs nur zur weiteren Expansion der NK-Zellen beitragen werden. Aus diesem Grund wurden die Spenderkriterien modifiziert, um Spender mit hohen NK-Populationen auszuschließen. Nach Erschöpfung der αβ-T-Zellen wurden die γδ-T-Zellen weiter auf 76,61 ± 27,51% angereichert. Dieses einzigartige Protokoll umfasst eine zweite Erweiterung unter Verwendung der von Moffit hergestellten aAPCs, um auf die CD8-, CD28- und CD127L-Rezeptoren in den γδ-T-Zellen abzuzielen. Diese zweite Expansionsphase mit den aAPCs ergab einen DP mit ≥65% für CD3+TCR γδ+ T Zellen, ≤1% TCRαβ T und <35% CD3-CD16+CD56+ NK Zellen. Aufgrund der Verwendung von K562-abgeleiteten aAPCs musste nachgewiesen werden, dass diese aAPCs <1% des Endprodukts ausmachten.

Das Moffit CTF entwickelte einen durchflusszytometrischen Assay, der für die Freisetzungskriterien verwendet wird, um den Prozentsatz der verbleibenden K562-Zellen in der endgültigen DP zu messen. Dieser durchflusszytometrische Assay mildert alle Probleme bei der Verwendung von Zelloberflächenantigenen zur Identifizierung der K562-Zellen. Da aktivierte T-Zellen CD71 exprimieren können, entwickelten wir eine Strategie, um alle T-Zellen und NK-Zellen auszuschließen, indem wir auf CD3-CD56- und CD16-Populationen gating und dann die CD71+ Zellen untersuchten, die ausschließlich K562-Zellen wären. Dieses Protokoll zeigt, dass die γδ-T-Zell-DP 0,48 ± 0,42% der verbleibenden K562-Zellen liefert und alle Freisetzungskriterien von ≥70% Lebensfähigkeit, Mykoplasmen-Negativität durch PCR, keine Organismen, die durch Grammfärbung gesehen werden, ≤2 EU / ml Endotoxin und keine endgültige (14 Tage) Blutkultursterilität erfüllt.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken dem Cellular Immunotherapies-Investigator Initiated Trials Award Intramural Funding Opportunity des Moffitt Cancer Center für die Bereitstellung der Finanzierung dieser Protokollentwicklung. Wir danken auch Dr. Claudio Anasetti für seine unschätzbare Hilfe und Anleitung durch dieses Projekt. Abschließend danken wir Dr. Justin Boucher für seine Einsichten und die Überprüfung des Manuskripts.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Hanks Balanced Salt SolutionR& D285-GMP
Humanalbumin 25%Grifolis65483-16-071
Plasmalyt AFisher2B2543Q
Zoledronsäure (Zometa)Hos pira4215-04--8FDA-zugelassenes Medikament
DMSOWAK-CHEMIE MEDICAL GMBHWAK-DMSO-10
CS10BIOLIFE SOLUTIONS210374
3 mL SpritzeBD309657
10 mL SpritzeBD309604
20 mL SpritzeBD302830
50 mL SpritzeBD309653
100 mL SpritzeJMS992861
18 g NadelFisher305198
Kryoröhrchen 1,8 mLFisher375418
5 mL PipetteFisher1367811D
50 mL PipetteFisher1367610Q
10 mL PipetteFisher1367811E
100 mL PipetteFisher07-200-620
15 mL konischFisher05-539-12
50 mL konischFisher05-539-7
250 mL konischFisher430776
600 mL TransferpackungTERUMO BCT INC1BBT060CB71
4" Plasmatransfer-SetINDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES03-220-90
Elutra Schlauch-SetTerumoBCT70800
100 MCS GREXWILSON WOLF MFG CORP81100-CS
Ashton Sterile Pumpmatic FlüssigkeitsabgabesystemFisher Scientific22-246660
Akazie PumpenstiefelMPS Medical In17789HP3MLL
CliniMACS PBS/EDTA BufferMiltenyi Biotec Inc130-070-525
Dornase AlphaGenentech, Inc50242-100-40/186-0055FDA zugelassenes Medikament
1000 mL 0,22 μm FilterFisher157-0020
Blutfilter 170umB. BraunV2500
CliniMACs SchlauchsetMiltenyi Biotec Inc130-090-719
CliniMACS TCRα/β KitMiltenyi Biotec Inc130-021-301
Y-Typ BlutsetFenwalFWL4C2498H
75 mL FlascheFisher430641U
IL-2Prometheus65483-116-071FDA zugelassenes Medikament
AIM-VFisher0870112BK
Human AB SerumGemini Bio-Produkt100H41T
3 Liter TransferpackungIndependent Medical AssociatesT3109
1000  PipettenspitzenFisher Scientific5991040
CF-250KOLBioCF-250
ElutraTERUMOBCT
CliniMACSMiltenyi Biotec Inc
GatheRex Liquid Handling, ZellerntepumpeWILSON WOLF MFG CORP
HERAcell Vios CO2-InkubatorThermo Scientific

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

T-Zell-ExpansionAphereseproduktAkute Myeloische LeukämieMagnetische ZellseparationDurchflusszytometrieAlpha-Beta-T-Zell-DepletionKünstliche Antigen-präsentierende ZellenZoledronsäure-AktivierungLymphozytenanreicherung
Erweiterung und Anreicherung von Gamma-Delta (γδ) T-Zellen aus Apheresed Human Product
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