Implantation eines kranialen Fensters für wiederholte In-vivo-Bildgebung bei wachen Mäusen

Die Fähigkeit, in vivo Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie im Kortex von Mäusen durchzuführen, ist von größter Bedeutung für die Untersuchung der zellulären Signalgebung und Struktur 1,2,3,4,5,6,7,8,9, der Krankheitspathologie 10,11 und der zellulären Entwicklung ^12,13 . Mit der Implantation chronischer Schädelfenster ist eine Längsschnittbildgebung möglich, die eine wiederholte Bildgebung von kortikalen Arealen für Tage, Wochen oder Monate^13,14 bei lebenden Tieren ermöglicht. Die Multiphotonenmikroskopie ist ideal für die wiederholte In-vivo-Bildgebung aufgrund der verbesserten Tiefensondierung und der reduzierten Lichtschäden im Zusammenhang mit dem verwendeten Infrarotlaser. Dies ermöglicht die Untersuchung der molekularen und zellulären Dynamik bestimmter Zellen in verschiedenen kortikalen Regionen.

Die Multiphotonenmikroskopie wurde für die In-vivo-Bildgebung von neuronalen und Gliazellen in Mäusen 15,16,17,18,19,20 verwendet. Verschiedene Strategien können implementiert werden, um bestimmte Zelltypen und Interessengebiete zu kennzeichnen. Ein gängiger Ansatz besteht darin, die Expression genetisch kodierter fluoreszierender Proteine auf zellspezifische Weise mit dem Cre-Lox-Rekombinationssystem voranzutreiben. Dies kann mit gentechnisch veränderten Mäusen durchgeführt werden, z. B. durch Kreuzung der "floxierten" Maus (Ai14) mit einer Maus, die die Cre-Rekombinase unter einem Promotor von Interesse^{exprimiert 21}. Alternativ kann eine zell- und standortspezifische Markierung mit viralen Injektionen erreicht werden. Hier werden ein Virus, das für die Cre-Rekombinase unter einem zellspezifischen Promotor kodiert, und ein Virus, das für ein floxiertes Gen von Interesse kodiert, in eine definierte Region injiziert. Geeignete Zelltypen, die beide viralen Vektoren erhalten, exprimieren dann die gewünschten Gene. Diese Gene können strukturelle Marker wie tdTomato sein, um Veränderungen in der Zellmorphologie 22 zu sehen, oder genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs), wie GCaMP und / oder^RCaMP, um die Kalziumdynamik²³ zu untersuchen. Methoden der genetischen Rekombination können einzeln oder in Kombination angewendet werden, um einen oder mehrere Zelltypen zu markieren. Ein dritter Ansatz, der keine transgenen Mäuse oder viralen Konstrukte (die eine begrenzte Verpackungskapazität haben) erfordert, ist die In-utero-Elektroporation von DNA-Konstrukten²⁴. Abhängig vom Zeitpunkt der Elektroporation können verschiedene Zelltypen anvisiert werden^25,26,27.

Bei der Durchführung von Multiphotonen-Bildgebung können Mäuse im Wachzustand oder in Narkose abgebildet werden. Die Bildgebung von wachen Mäusen kann durchgeführt werden, indem die Maus über eine angebrachte Kopfplatte²⁸ gesichert wird. Dieser Ansatz wird weniger stressig, indem eine relativ freie Bewegung des Tieres mit Methoden wie freischwebenden, luftgestützten Styroporkugeln²⁹, frei schwebenden Laufbändern¹ oder einem luftgestützten Heimkäfigsystem ermöglicht wird, bei dem Mäuse durch eine angebrachte Kopfplatte befestigt werden und sich in einer offenen Kammer³⁰ bewegen dürfen. Für jede dieser Bildgebungsbedingungen ist es zunächst notwendig, die Mäuse an den Bildgebungsaufbau zu gewöhnen. Dieses Papier beschreibt das Gewöhnungs- und Bildgebungsverfahren unter Verwendung eines luftgestützten Heimkäfigsystems.

Dieses Protokoll beschreibt die Implantation eines chronischen Schädelfensters für die longitudinale In-vivo-Bildgebung im Kortex. Hier werden wir Mäuse verwenden, die GCaMP6f in Astrozyten bedingt exprimieren, um die Dynamik der Kalziumsignalisierung zu überwachen. Darüber hinaus beschreibt dieses Papier das Verfahren für virale Injektionen mit tdTomato als Label für Neuronen. Dies ermöglicht die Bestimmung von Veränderungen der neuronalen synaptischen Struktur und/oder der Verfügbarkeit als Strukturmarker, der eine wiederholte Bildgebung desselben Astrozyten ermöglicht. Während des gesamten Protokolls werden entscheidende Schritte hervorgehoben, um die bestmögliche Qualität der Bilder aus der Multiphotonenmikroskopie zu gewährleisten.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den von der IACUC am University of Nebraska Medical Center genehmigten Richtlinien durchgeführt.

1. Vor der Operation

1. Bereiten Sie Pipetten für virale Injektionen vor. Ziehen Sie Borosilikatglaskapillaren mit einem Pipettenabzieher und fase Sie die Pipette in einem Winkel von 20°. Sterilisieren Sie die Pipetten über Nacht.
2. Bereiten Sie frische Stücke sterilen Gelschaums vor, indem Sie sie in kleine Quadrate schneiden. Tauchen Sie den Gelschaum in ein steriles Mikrofugenröhrchen, das 0,5 ml Kochsalzlösung enthält. Weichen Sie den Gelschaum vor Gebrauch mindestens 30 Minuten in Kochsalzlösung ein.
3. Bereiten Sie frische Stücke von Schwammstreifen vor, indem Sie sie in dünne Streifen schneiden.
4. Zwanzig Minuten vor der Operation injizieren Sie 4-6 Wochen alten GLAST-CreER/GCaMP6f-Mäusen intraperitoneal 0,2 mg/kg Dexamethason, um eine Schwellung des Gehirns zu verhindern, und 5 mg/kg Carprofen zur Verringerung der Entzündung.
   HINWEIS: Um die Rekombination und Expression von GCaMP6f in etwa 40% der Astrozyten zu induzieren, wurden GLAST-CreER/GCaMP6f-Mäusen nach 3 Wochen an 5 aufeinanderfolgenden Tagen 100 mg/kg Tamoxifen injiziert.

2. Beginn der Operation

1. Nach 20 min die Mäuse mit 3% Isofluran mit Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1 L/min für ca. 1,5 min betäuben.
2. Legen Sie die Maus nach der Betäubung auf einen stereotaktischen Rahmen, der auf einer Wasserumlaufdecke sitzt, um während der gesamten Operation eine Körpertemperatur von 37 ° C aufrechtzuerhalten. Befestigen Sie die Maus mit der Schnauzenklemme und den Ohrbügeln am Rahmen. Stellen Sie sicher, dass die Schnauzenklemme und die Ohrstangen stabil genug sind, dass sich der Kopf während des Eingriffs nicht bewegt, aber nicht so fest, dass der Schädel beschädigt wird.
3. Halten Sie die Anästhesie mit 1-1,5% Isofluran mit Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1-2 l / min aufrecht. Beachten Sie, dass einige Tiere möglicherweise mehr oder weniger Isofluran benötigen, um die Sedierung aufrechtzuerhalten. Überwachen Sie die Atmung des Tieres sowie seine Reflexe auf Zehen- und Schwanzkneifen und passen Sie das Isofluran entsprechend an.
4. Tragen Sie Augensalbe mit einem Baumwollspitzenapplikator auf jedes Auge auf, um zu verhindern, dass die Augen während des Eingriffs austrocknen.
5. Rasieren Sie mit Nagetiertrimmern die Haare vom Hals bis knapp hinter den Augen. Seien Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Schnurrhaare des Tieres nicht versehentlich beschnitten werden.
6. Reinigen Sie den rasierten Bereich mit einem Jod-Prep-Pad, gefolgt von einem Alkohol-Prep-Pad.
7. Schneiden und entfernen Sie mit steriler Gewebezange und chirurgischer Schere die Haut von den frontalen Nähten vor der Bregma bis hin zum Lambda.
8. Sobald die Haut entfernt ist, fügen Sie dem Schädel etwa 0,1 ml 1% Xylocain (Lidocain mit Adrenalin 1: 200.000) hinzu, um die Blutung des Schädels zu minimieren.
9. Mit einer sterilen chirurgischen Klinge aus Kohlenstoffstahl der Größe 11, die an einem Griff befestigt ist, kratzen Sie das Bindegewebe vorsichtig vom Schädel. Seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie das Bindegewebe in der Nähe des Schädelrandes entfernen, da verbleibendes Gewebe später eine starke Haftung des Glases oder der Kopfplatte verhindern könnte.
10. Verwenden Sie sterile Gewebezangen, um loses Bindegewebe aus dem Schädel zu entfernen.
11. Reinigen Sie mit sterilen Baumwollspitzenapplikatoren das verbleibende Xylocain aus dem Schädel.
12. Sobald Sie fertig sind, entfetten Sie den Schädel gründlich mit einem sterilen Baumwollspitzenapplikator, der in Aceton getaucht ist. Verwenden Sie Druckluft, um den Schädel sofort zu föhnen.

3. Kraniotomie

1. Messen Sie mit einem Feinpunktmarker und einem Lineal die passende Größe für die Öffnung an der gewünschten Stelle. Bestätigen Sie die Größe der Öffnung, indem Sie sie mit der Größe des Deckglases (3 oder 5 mm Durchmesser) vergleichen. Stellen Sie sicher, dass die Öffnung etwas kleiner als die Größe des Deckglases ist.
2. Zeichnen Sie mit einem Zahnbohrer allmählich die Umrisse der Öffnung nach und dünnen Sie den Knochen aus. Bohren Sie langsam, um ein Bohren durch den Knochen zu verhindern, und bohren Sie in konzentrischen Kreisen, um eine gleichmäßige Ausdünnung des Knochens zu erleichtern.
3. Fügen Sie nach jedem konzentrischen Durchgang ein oder zwei Tropfen steriler Kochsalzlösung in den gebohrten Bereich ein. Lassen Sie die Kochsalzlösung mindestens 10 s sitzen, um zu verhindern, dass der Knochen überhitzt und die darunter liegende Dura beschädigt.
4. Verwenden Sie einen sterilen Baumwollspitzenapplikator, um verbleibende Kochsalzlösung zu absorbieren. Blasen Sie Druckluft über den Bereich, um sicherzustellen, dass die gesamte verbleibende Kochsalzlösung verdampft ist, bevor Sie das Bohren wieder aufnehmen. Tun Sie dies, um Knochenreste wegzublasen.
5. Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.4, bis der Knochen für die Entfernung ausreichend ausgedünnt ist.
6. Stellen Sie sicher, dass der Knochen für die Entfernung ausreichend ausgedünnt ist, indem Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig auf den zentralen Bereich des Knochens drücken, um zu überprüfen, ob sich der ausgedünnte Schädel bewegt. Das darunter liegende Gefäßsystem sollte dort sichtbar sein, wo die Bohrungen stattgefunden haben. Beachten Sie, dass der Knochen so aussehen kann, als würde er dort reißen, wo eine Ausdünnung aufgetreten ist.
   HINWEIS: Das Training in diesem Stadium ist entscheidend, um festzustellen, wann der Knochen entsprechend ausgedünnt wurde.
7. Bevor Sie versuchen, den Knochen zu entfernen, überprüfen Sie die Maus, um sicherzustellen, dass sie vollständig sediert ist. Wenn nicht, erhöhen Sie allmählich die Isofluran-Wartung, um eine Schwellung des Gehirns beim Entfernen des Knochens zu verhindern.
8. Fügen Sie dem ausgedünnten Schädel ein kleines Stück Gelschaum hinzu, das in Kochsalzlösung gesättigt ist. Fügen Sie ein oder zwei zusätzliche Tropfen Kochsalzlösung zum ausgedünnten Schädel hinzu.
   HINWEIS: Viel Kochsalzlösung über dem ausgedünnten Schädel hilft, Blutungen zu reduzieren und die Dura beim Entfernen der Knochenklappe zu schützen.
9. Führen Sie die Klinge vorsichtig mit einer 15° spitzen Miniaturklinge in den ausgedünnten Knochen ein und schneiden Sie sie entlang des ausgedünnten Knochens. Halten Sie den Gelschaum in Kochsalzlösung getränkt, um eventuell auftretende Blutungen zu stoppen.
10. Heben Sie den Knochen vorsichtig mit einer Pinzette an und entfernen Sie ihn. Seien Sie so sanft wie möglich, um Schäden am darunter liegenden Gewebe und Gefäßsystem zu vermeiden. Achten Sie äußerst darauf, die Dura Mater nicht zu beschädigen.
11. Sobald der Knochenlappen entfernt ist, fügen Sie ein frisches Stück Gelschaum, das in Kochsalzlösung gesättigt ist, in den Kortex ein. Fügen Sie ein paar Tropfen Kochsalzlösung hinzu, um zu verhindern, dass der Gelschaum austrocknet, da dies zu Schäden am darunter liegenden Gewebe führt.

4. Virale Injektionen

1. Führen Sie virale Injektionen mit einem stereotaktischen Gerät durch.
   1. Bereiten Sie AAV1 vor. CaMKII.0.4.Cre (Titer von 3 × 10^{13 Genomkopien} (GC)/ml) bei 1:5.000 durch serielle Verdünnungen in Kochsalzlösung.
   2. Bereiten Sie die Mischung aus AAV1 vor. CaMKII.0.4.Cre (1:5.000) und AAV1. CAG. FLEX.tdTomate (Titer von 5 × 10¹² GC/ml) auf einem kleinen Stück Parafilm.
   3. Füllen Sie eine sterile abgeschrägte Glaspipette mit einer Spitzengröße von 20 μm mit der Virusmischung, indem Sie die Pipette vorsichtig auf die Lösung legen.
   4. Senken Sie die Pipette ab, so dass sie nur die Oberfläche des Gehirns berührt, und senken Sie sie für weitere 200-300 μm für L2/3-Injektionen. Unter Verwendung eines intrazellulären Mikroinjektions-Dosiersystems (siehe Materialtabelle) wird 12-15 Mal über 2 min (20 psi, 9 ms Pulsdauer) unter Druck injiziert. Beobachten Sie den Meniskus im Pipettentropfen bei jeder Injektion, um sicherzustellen, dass die Pipette nicht verstopft ist.
   5. Lassen Sie die Pipette nach der Injektion 4-5 Minuten im Gehirn, um einen Rückfluss zu verhindern. Ziehen Sie die Pipette langsam zurück.
   6. Wiederholen Sie die Injektionen an 2-3 Stellen (ca. 500 μm Abstand).
   7. Entsorgen Sie die gebrauchten Glaspipetten, Parafilme, Pipettenspitzen und Mikrofugenröhrchen, die für serielle Verdünnungen des Cre-Virus verwendet werden, in 10% Bleichmittel.

5. Implantation des Schädelfensters

1. Entfernen Sie den Gelschaum und verwenden Sie einen kleinen Streifen Schwammstreifen, um die restliche Kochsalzlösung aufzusaugen.
2. Geben Sie ein paar Tropfen des Antibiotikums Enrofloxacin (22,7 μg / ml) in die Öffnung und lassen Sie es dort für 1 min bleiben. Verwenden Sie nach 1 Minute ein frisches Stück Schwammstreifen, um das verbleibende Enrofloxacin zu absorbieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zwei weitere Male.
3. Nach dem dritten Waschen ein paar Tropfen Kochsalzlösung in die Öffnung geben und dort 1 min verbleiben lassen. Verwenden Sie nach 1 min ein frisches Stück Schwammstreifen, um die restliche Kochsalzlösung zu absorbieren. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch zwei weitere Male und fügen Sie nach der dritten Wäsche einen kleinen Tropfen Kochsalzlösung in die Öffnung ein.
4. Legen Sie das Deckglas über die Öffnung. Verwenden Sie eine Pinzette, um sicherzustellen, dass das Glas bündig über die Öffnung ist, um Bilder von guter Qualität zu erhalten.
5. Während Sie das Glas vorsichtig an Ort und Stelle halten, tragen Sie Cyanacrylat-Klebegel (Table of Materials) um den Umfang des Glases auf, um die Kanten des Fensters mit dem Schädel zu versiegeln. Achten Sie darauf, den Kleber nicht unter das Deckglas sickern zu lassen, und halten Sie so viel Kleber wie möglich von der Oberfläche des Deckglases fern.
6. Tragen Sie eine Schicht Sekundenkleber über das Klebegel auf. Fügen Sie eine Schicht Zahnzementflüssigkeit über den Kleber hinzu, damit er aushärten kann.
7. Nehmen Sie eine Hubschrauberkopfplatte in geeigneter Größe und tragen Sie eine dünne Schicht Klebstoff um die zentrale Öffnung auf. Legen Sie die Kopfplatte über das Deckglas und lassen Sie den Kleber kurz trocknen.
8. In einem 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen fügen Sie der 0,1-ml-Markierung auf der Tube Zahnzementpulver hinzu. Fügen Sie 7-8 Tropfen schnell aushärtender, sofortiger Klebstoff hinzu und mischen Sie. Ziehen Sie in eine 1-ml-Spritze mit einer 19-G-Nadel, die geschnitten wurde, um eine größere Öffnung zu schaffen.
9. Injizieren Sie die Mischung durch die seitlichen Löcher der Hubschrauberstange, bis sie von beiden Seiten versickert. Tragen Sie die Zahnzement-Klebstoff-Mischung auf den Rest des freiliegenden Schädels auf, um die Kopfplatte am Schädel zu befestigen, wodurch Bewegungsartefakte während der Bildgebung reduziert werden.
10. Lassen Sie die Mischung mindestens 15 Minuten an der Luft trocknen.
11. Injizieren Sie der Maus subkutan 0,5 ml Kochsalzlösung, um die Genesung zu unterstützen.

6. Nach dem Betrieb

1. Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Frame und bringen Sie sie in ihren Käfig zurück.
2. Legen Sie einen Teil des Käfigs auf eine Wasserumlaufdecke, Raumgel-Heizkissen oder Isothermiepads, um die Erholung zu unterstützen.
3. Stellen Sie dem Tier zusätzlich zu seiner normalen Ernährung eine kleine Portion Futterpellets und Nassfutter zur Verfügung, um die Genesung weiter zu unterstützen. Fügen Sie jeden Tag nach der Operation für die Dauer der Genesung neue Futterpellets und Nassfutter hinzu.
4. Injizieren Sie Mäusen am Tag nach der Operation einmal 5 mg/kg Carprofen und 5 mg/kg Enrofloxacin.
5. Injizieren Sie den Mäusen an den Tagen 2-6 einmal 5 mg/kg Carprofen und zweimal 5 mg/kg Enrofloxacin, vorbehaltlich der Zulassung durch die lokale IACUC. Trennen Sie die Enrofloxacin-Injektionen um mindestens 8 h.
6. Injizieren Sie den Mäusen an den Tagen 7-20 täglich 5 mg/kg Carprofen.

7. Tiergewöhnung für die Bildgebung

1. Untersuchen Sie am 14. Tag nach der Operation das Schädelfenster auf optische Klarheit. Verwenden Sie keine Mäuse mit unklaren oder anderweitig beschädigten Fenstern (z. B. übermäßige Angiogenese).
2. Überprüfen Sie die tdTomato-Expression unter einem Fluoreszenzmikroskop. Wenn markierte Zellen identifiziert werden können, fahren Sie mit der Tiergewöhnung fort.
3. Erster Tag der Gewöhnung (Handhabung)
   1. Halten Sie die Maus einige Minuten lang gedrückt und bringen Sie sie nach der Handhabung in ihren Käfig zurück. Wiederholen Sie die Handhabung dreimal mit einem Abstand von 15 Minuten zwischen den Sitzungen.
   2. Gewöhnen Sie sich nach dem dritten Versuch an die Maus, indem Sie das Tier in ein kleines Stück Stoff wickeln.
   3. Halten Sie die Maus in Stoff gewickelt für ca. 1 min.
   4. Bringen Sie die Maus nach dem Versuch in ihren Käfig zurück. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zwei weitere Male, so dass zwischen den einzelnen Versuchen ein Intervall von 15 Minuten liegt.
4. Zweiter Tag der Gewöhnung
   1. Wiegen und notieren Sie das Gewicht der Maus.
   2. Wickeln Sie die Maus in ein Tuch und befestigen Sie sie über ihre Kopfplatte am Kopffixationsarm des luftgestützten Heimkäfigs.
   3. Lassen Sie den Hauskäfig dem Licht ausgesetzt.
   4. Lassen Sie die Maus 15 Minuten lang im Wohnmobilkäfig gesichert bleiben.
   5. Entfernen Sie nach der Gewöhnung die Maus aus dem Hauskäfig und schalten Sie den Luftstrom aus.
   6. Wiegen Sie die Maus und bringen Sie sie in ihren Käfig zurück. Achten Sie darauf, nur Mäuse einzubeziehen, die nicht mehr als 10% ihres Körpergewichts verlieren. Schließen Sie Mäuse, die an einem beliebigen Tag der Gewöhnung mehr als 10% ihres Gewichts verlieren, von bildgebenden Experimenten aus.
5. Tag drei der Gewöhnung und darüber hinaus
   1. Wiegen und notieren Sie das Mausgewicht, bevor Sie es am luftgehissten Heimkäfig befestigen.
   2. Befestigen Sie die Maus am luftgestützten Heimkäfig.
   3. Decken Sie den Hauskäfig mit etwas ab, das ein dunkles Interieur bietet, z. B. eine Box, und lassen Sie die Maus 30 Minuten lang gesichert bleiben.
   4. Entdecken Sie nach 30 Minuten den Heimkäfig, entfernen Sie die Maus und schalten Sie den Luftstrom aus.
   5. Wiegen und notieren Sie das Gewicht der Maus nach der Gewöhnung.
   6. Wiederholen Sie diesen Vorgang jeden Tag und erhöhen Sie die Dauer, die die Maus am Heimkäfig befestigt ist, um 15 Minuten. Setzen Sie diesen Vorgang fort, bis die Maus für 1,5 Stunden am Heimkäfig befestigt werden kann, da dies die ungefähre Dauer einer Zwei-Photonen-Bildgebungssitzung ist.
   7. Um die Maus an Geräusche zu gewöhnen, führen Sie einige Gewöhnungssitzungen am Mikroskop durch, um die Maus an die Geräusche der Laserscanning-Spiegel zu gewöhnen. Schließen Sie Mäuse aus, die sich nicht ausreichend gewöhnen (z. B. Vokalisationen und stressinduzierte Defäkation).

8. Multiphotonen-Bildgebung

1. Beginnen Sie 3 Wochen nach der Operation mit der Bildgebung, damit sich das Fenster öffnen kann.
2. Führen Sie die Bildgebung auf einem maßgeschneiderten oder handelsüblichen Multiphotonenmikroskop durch, das mit einem Ti:Saphir-Laser ausgestattet ist. Erfassen Sie Bilder mit einem Wassertauchobjektiv mit hoher numerischer Apertur (NA).
   HINWEIS: Die Zweikanal-Bildgebung wird durch die Verwendung eines dichroitischen 565-nm-Spiegels und zweier externer Photomultiplierröhren erreicht. Ein 535/50-Bandpassfilter wird verwendet, um GCaMP6f-Emissionen zu erkennen, und ein 610/75-Bandpassfilter wird verwendet, um tdTomato zu erkennen. Ein 25-faches Wassertauchobjektiv (1,05 NA) und Resonanzscanner wurden verwendet, um Bilder in Abbildung 1 und Abbildung 2 zu erfassen. Jede Region von Interesse bestand aus einem Stapel von Bildern, die axial durch 1 μm getrennt waren. Jeder optische Abschnitt wurde mit 512 x 512 Pixeln, 0,18 μm/Pixel gesammelt. Bilder wurden aus dem Vordergliedmaßenbereich des primären motorischen Kortex aufgenommen, der durch stereotaktische Koordinaten bestimmt wurde.
3. Stellen Sie die Wellenlänge des Lasers auf 920 nm ein (990 nm, wenn ein rotverschobener GECI verwendet wird).
4. Legen Sie die Maus auf den Käfig des Wohnmobils und klemmen Sie die Kopfplatte an den Kopfbefestigungsarm.
5. Fügen Sie ein paar Tropfen Wasser in die Mitte des Fensters hinzu.
6. Wählen Sie im Weitfeldmodus des Mikroskops 2-3 Positionen eines leicht identifizierbaren Gefäßsystems aus. Speichern Sie die Bilder dieser Blutgefäße und zeichnen Sie die X- und Y-Koordinaten auf, die auf dem Motorcontroller erscheinen, um die tdTomato-markierten Dendriten für nachfolgende Bildgebungssitzungen zu verschieben. Passen Sie die X- und Y-Koordinaten jedes Mal an, um sie mit den gespeicherten Bildern der Blutgefäße neu auszurichten.
7. Sobald das Gefäßsystem abgebildet und die Positionen aufgezeichnet wurden, lokalisieren Sie die Regionen mit Neuronen, die tdTomato exprimieren (Abbildung 1). Stellen Sie die synaptischen Strukturen (Dendriten und Axone) von Neuronen und die GCaMP6f-Aktivität in Astrozyten dar.
   HINWEIS: Die Dendriten dienen als Landmarken, um zuverlässig in die gleichen Regionen zurückzukehren und die gleichen Dendriten und Astrozyten über wiederholte Tage abzubilden. Bei stabiler Kopffixierung und nach Gewöhnung an die Kopffixierung wurde keine nachweisbare Verschiebung in der Bildgebungsebene beobachtet. Verschiebungen, die in X- und Y-Richtung auftreten, werden bewegungskorrigiert.
8. Bringen Sie die Maus nach der Bildgebung in ihren Käfig zurück.
   HINWEIS: Mäuse werden in der Regel maximal 2 Stunden auf dem Zielfernrohr gehalten. Wenn die Bildgebung lange anhält, kann das Wasser unter dem Objektiv trocknen. Während der Experimente sollte Wasser hinzugefügt werden. Alternativ kann anstelle von Wasser ein Ultraschallgel verwendet werden.

Die Qualität des Schädelfensters kann daran gemessen werden, wie scharf die neuronalen Strukturen erscheinen. In einem guten Fenster sind dendritische Stacheln deutlich sichtbar (Abbildung 1). Mit den gespeicherten Struktur- und Positionsdaten kann dasselbe Tier wiederholt Tage, Wochen oder Monate lang abgebildet werden, um dieselben Zellen zu untersuchen (Abbildung 1). Die Bilder in Abbildung 1 wurden aus dem Vordergliedmaßenbereich des primären motorischen Kortex (in einem 5-mm-Fenster) aufgenommen. Eine Vielzahl von Parametern kann gemessen werden, einschließlich der Dichte und Dynamik von dendritischen Stacheln und axonalen Boutons, um die strukturelle synaptische Plastizität zu untersuchen. Die astrozytäre Aktivität kann durch Analyse der raumzeitlichen Dynamik der Calciumsignalisierung untersucht werden (Abbildung 2). Abhängig von den Mikroskopfähigkeiten (d. h. Resonanzscanner, Piezomotor, der das Objektiv steuert) und der experimentellen Fragestellung kann die Zeitrafferbildgebung in einer einzelnen Fokusebene oder in einem Volumen oder einer Multiregion durchgeführt werden, um die Kalziumaktivität mit der gewünschten Erfassungsfrequenz zu überwachen.

Abbildung 1: Wiederholte Bildgebung von Dendriten und Astrozyten über Tage. Eine Dendriten-exprimierende tdTomate (Magenta) ermöglicht die Identifizierung und wiederholte Abbildung von GCaMP6f-exprimierenden Astrozyten (weiß) in unmittelbarer Nähe. Die Ca2+ Aktivität in Astrozyten wird zu verschiedenen Zeitpunkten an verschiedenen Tagen gezeigt. Synaptische strukturelle Plastizität kann gleichzeitig abgebildet werden. Zwei neue Stacheln, die an Tag 2 erschienen sind, sind mit Pfeilen markiert. Während eine Wirbelsäule persistierte und an Tag 5 sichtbar war (blauer Pfeil), wurde die andere Wirbelsäule eliminiert (grüner Pfeil). Maßstabsleiste = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Bildgebung der astrozytären Kalziumsignalisierung. Bilder, die Ca2+ Aktivität von einem Astrozyten zeigen, der GCaMP6f exprimiert. Die Panels zeigen die Ca2+- Aktivität, die von einem 4-μm-Volumen zu verschiedenen Zeitpunkten während der Erfassung aufgezeichnet wurde. Calcium-Signale in Prozessen und Mikrodomänen können während der Ruhezeiten beobachtet werden. Ein globales Ereignis, das die gesamte Zelle umfasst, kann während eines Fortbewegungsanfalls bei 188 s beobachtet werden. Maßstabsleiste = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Here, we have presented a protocol for the implantation of chronic cranial windows for in vivo imaging of cortical astrocytes and neurons in awake, head-restrained mice on an air-lifted home cage. Specific examples have been provided of the cranial window application for imaging astrocytes that express GECIs and neuronal synaptic structures. With the use of multiphoton microscopy, astrocytic calcium signaling dynamics and structural synaptic dynamics can be recorded repeatedly over days.

A chronic cranial window provides good optical imaging quality and allows for multiple imaging sessions to be performed of the same neuronal and glial structures. The approach also makes it possible to perform intracranial viral injections before covering the craniotomy with a cover glass.
Users should be aware of a number of limitations incurred through the implantation of chronic cranial windows. Experience and much practice are needed to achieve a high-quality window and to ensure animal survival. Moreover, the surgery is invasive and can result in an inflammatory response. Pharmacological treatment during surgery and post-surgical recovery includes anti-inflammatory drugs and antibiotics³¹. The use of anti-inflammatory drugs may not be appropriate in studies investigating models of neuroinflammation as these drugs may also affect the phenomenon under study.

More recently, meningeal lymphangiogenesis has been shown to occur in response to cranial window implantation³². Thus, the chronic cranial window might not be therefore acceptable for studies investigating meningeal lymphatic vessels. Importantly, a 2-3-week waiting period post-surgery is necessary before imaging experiments^31,33. Additionally, the age of the mice, as well as post-operation recovery time, limits the ability to image very early developmental events. While cranial windows can be implanted in younger mice (P15-21)³⁴, possible side effects, such as inflammation, need to be considered.

As an alternative to the chronic cranial window, thinned skull preparations may also be made. This method results in the thinning of the skull over the region of interest before imaging. A thinned skull window is less invasive and overcomes the need for anti-inflammatory drug administration, making it a choice in studies investigating models of neuroinflammation and neuroimmune interactions. However, should repeated imaging be desired, the skull needs to be re-thinned before imaging, and bone can only be re-thinned a limited number of times before image quality degrades³⁵.

Although a modified version of a reinforced thin-skull method that does not require rethinning has been described³⁶, a non-uniform skull thickness may cause spherical aberrations, resulting in the distortion of fluorescent structures³⁷. Thus, when quantitative measurements are being recorded, such as calcium signaling dynamics³⁸ or levels of synaptic proteins²⁷, as opposed to the identification of structures such as dendritic spines, the chronic cranial window provides a more optically stable and reliable preparation. Thus, for longitudinal, in vivo imaging, the insertion of cranial windows is the superior method for examining changes as a result of drug treatment³⁹, training in a behavioral paradigm^4,25, and synaptic remodeling in neurological disorders^11,27.

The described procedure is technically challenging and provides a barrier for quality image acquisition. Extreme care must be taken at each step to ensure that the window stays free of infection, and damage to the underlying tissue is avoided. This includes gentle scraping of connective tissue on the skull, taking adequate breaks for cooling the bone when drilling, ensuring uniform thinning to facilitate easy bone removal, preventing brain swelling, and extreme care to not damage the dura mater during surgery. Only the best window preparations remain optically transparent for longer periods of imaging.

While changes in synaptic structures can be imaged in anesthetized mice over days, this is not preferred when examining astrocyte calcium signaling as anesthesia has been shown to disrupt astrocyte calcium signaling in vivo⁴⁰. To perform in vivo imaging in awake, head-restrained mice, it is essential to habituate the animal to the imaging conditions in the mobile home cage, free-floating treadmill, air-lifted Styrofoam ball, or other apparatus. Proper habituation will not only reduce stress during imaging, but also act to minimize movement artifacts during the imaging sessions.

In summary, in vivo multiphoton microscopy through a chronic cranial window is a useful tool for studying structural and functional changes of cells in the cortex. Using cell-specific fluorescent dyes and reporters, it is possible to study cellular morphology, interactions, and activity. With the longitudinal imaging allowed by chronic cranial windows, it is possible to examine how synaptic structures change and develop over time^13,14. Using the protocol presented here, it is possible to examine calcium signaling dynamics in astrocytes due to sensory stimulation^23,38, locomotion or startle^6,41, disease^15,42, or other parameters of interest.