Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Implantation eines kranialen Fensters für wiederholte In-vivo-Bildgebung bei wachen Mäusen

8.5K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/62633

⸱

22. Juni 2021

 ,  , 
1Department of Neurological Sciences, University of Nebraska Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Implantation eines chronischen Schädelfensters für die Längsbildgebung von Gehirnzellen in wachen, kopfgefesselten Mäusen vorgestellt.

Zusammenfassung

Um die zelluläre Physiologie von Neuronen und Gliazellen bei sich benehmenden Tieren vollständig zu verstehen, ist es notwendig, ihre Morphologie zu visualisieren und ihre Aktivität in vivo bei sich verhaltenden Mäusen aufzuzeichnen. Dieses Papier beschreibt eine Methode zur Implantation eines chronischen Schädelfensters, um die Längsbildgebung von Gehirnzellen in wachen, kopfgefesselten Mäusen zu ermöglichen. In Kombination mit genetischen Strategien und viralen Injektionen ist es möglich, bestimmte Zellen und Regionen von Interesse mit strukturellen oder physiologischen Markern zu markieren. Dieses Protokoll zeigt, wie virale Injektionen kombiniert werden können, um Neuronen in der Nähe von GCaMP6-exprimierenden Astrozyten im Kortex zu markieren, um beide Zellen gleichzeitig durch ein Schädelfenster abzubilden. Multiphotonen-Bildgebung der gleichen Zellen kann für Tage, Wochen oder Monate in wachen, sich verhaltenden Tieren durchgeführt werden. Dieser Ansatz bietet Forschern eine Methode zur Betrachtung der Zelldynamik in Echtzeit und kann angewendet werden, um eine Reihe von Fragen in den Neurowissenschaften zu beantworten.

Einleitung

Die Fähigkeit, in vivo Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie im Kortex von Mäusen durchzuführen, ist von größter Bedeutung für die Untersuchung der zellulären Signalgebung und Struktur 1,2,3,4,5,6,7,8,9, der Krankheitspathologie 10,11 und der zellulären Entwicklung 12,13 . Mit der Implantation chronischer Schädelfenster ist eine Längsschnittbildgebung möglich, die eine wiederholte Bildgebung von kortikalen Arealen für Tage, Wochen oder Monate13,14 bei lebenden Tieren ermöglicht. Die Multiphotonenmikroskopie ist ideal für die wiederholte In-vivo-Bildgebung aufgrund der verbesserten Tiefensondierung und der reduzierten Lichtschäden im Zusammenhang mit dem verwendeten Infrarotlaser. Dies ermöglicht die Untersuchung der molekularen und zellulären Dynamik bestimmter Zellen in verschiedenen kortikalen Regionen.

Die Multiphotonenmikroskopie wurde für die In-vivo-Bildgebung von neuronalen und Gliazellen in Mäusen 15,16,17,18,19,20 verwendet. Verschiedene Strategien können implementiert werden, um bestimmte Zelltypen und Interessengebiete zu kennzeichnen. Ein gängiger Ansatz besteht darin, die Expression genetisch kodierter fluoreszierender Proteine auf zellspezifische Weise mit dem Cre-Lox-Rekombinationssystem voranzutreiben. Dies kann mit gentechnisch veränderten Mäusen durchgeführt werden, z. B. durch Kreuzung der "floxierten" Maus (Ai14) mit einer Maus, die die Cre-Rekombinase unter einem Promotor von Interesseexprimiert 21. Alternativ kann eine zell- und standortspezifische Markierung mit viralen Injektionen erreicht werden. Hier werden ein Virus, das für die Cre-Rekombinase unter einem zellspezifischen Promotor kodiert, und ein Virus, das für ein floxiertes Gen von Interesse kodiert, in eine definierte Region injiziert. Geeignete Zelltypen, die beide viralen Vektoren erhalten, exprimieren dann die gewünschten Gene. Diese Gene können strukturelle Marker wie tdTomato sein, um Veränderungen in der Zellmorphologie 22 zu sehen, oder genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs), wie GCaMP und / oderRCaMP, um die Kalziumdynamik23 zu untersuchen. Methoden der genetischen Rekombination können einzeln oder in Kombination angewendet werden, um einen oder mehrere Zelltypen zu markieren. Ein dritter Ansatz, der keine transgenen Mäuse oder viralen Konstrukte (die eine begrenzte Verpackungskapazität haben) erfordert, ist die In-utero-Elektroporation von DNA-Konstrukten24. Abhängig vom Zeitpunkt der Elektroporation können verschiedene Zelltypen anvisiert werden25,26,27.

Bei der Durchführung von Multiphotonen-Bildgebung können Mäuse im Wachzustand oder in Narkose abgebildet werden. Die Bildgebung von wachen Mäusen kann durchgeführt werden, indem die Maus über eine angebrachte Kopfplatte28 gesichert wird. Dieser Ansatz wird weniger stressig, indem eine relativ freie Bewegung des Tieres mit Methoden wie freischwebenden, luftgestützten Styroporkugeln29, frei schwebenden Laufbändern1 oder einem luftgestützten Heimkäfigsystem ermöglicht wird, bei dem Mäuse durch eine angebrachte Kopfplatte befestigt werden und sich in einer offenen Kammer30 bewegen dürfen. Für jede dieser Bildgebungsbedingungen ist es zunächst notwendig, die Mäuse an den Bildgebungsaufbau zu gewöhnen. Dieses Papier beschreibt das Gewöhnungs- und Bildgebungsverfahren unter Verwendung eines luftgestützten Heimkäfigsystems.

Dieses Protokoll beschreibt die Implantation eines chronischen Schädelfensters für die longitudinale In-vivo-Bildgebung im Kortex. Hier werden wir Mäuse verwenden, die GCaMP6f in Astrozyten bedingt exprimieren, um die Dynamik der Kalziumsignalisierung zu überwachen. Darüber hinaus beschreibt dieses Papier das Verfahren für virale Injektionen mit tdTomato als Label für Neuronen. Dies ermöglicht die Bestimmung von Veränderungen der neuronalen synaptischen Struktur und/oder der Verfügbarkeit als Strukturmarker, der eine wiederholte Bildgebung desselben Astrozyten ermöglicht. Während des gesamten Protokolls werden entscheidende Schritte hervorgehoben, um die bestmögliche Qualität der Bilder aus der Multiphotonenmikroskopie zu gewährleisten.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den von der IACUC am University of Nebraska Medical Center genehmigten Richtlinien durchgeführt.

1. Vor der Operation

  1. Bereiten Sie Pipetten für virale Injektionen vor. Ziehen Sie Borosilikatglaskapillaren mit einem Pipettenabzieher und fase Sie die Pipette in einem Winkel von 20°. Sterilisieren Sie die Pipetten über Nacht.
  2. Bereiten Sie frische Stücke sterilen Gelschaums vor, indem Sie sie in kleine Quadrate schneiden. Tauchen Sie den Gelschaum in ein steriles Mikrofugenröhrchen, das 0,5 ml Kochsalzlösung enthält. Weichen Sie den Gelschaum vor Gebrauch mindestens 30 Minuten in Kochsalzlösung ein.
  3. Bereiten Sie frische Stücke von Schwammstreifen vor, indem Sie sie in dünne Streifen schneiden.
  4. Zwanzig Minuten vor der Operation injizieren Sie 4-6 Wochen alten GLAST-CreER/GCaMP6f-Mäusen intraperitoneal 0,2 mg/kg Dexamethason, um eine Schwellung des Gehirns zu verhindern, und 5 mg/kg Carprofen zur Verringerung der Entzündung.
    HINWEIS: Um die Rekombination und Expression von GCaMP6f in etwa 40% der Astrozyten zu induzieren, wurden GLAST-CreER/GCaMP6f-Mäusen nach 3 Wochen an 5 aufeinanderfolgenden Tagen 100 mg/kg Tamoxifen injiziert.

2. Beginn der Operation

  1. Nach 20 min die Mäuse mit 3% Isofluran mit Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1 L/min für ca. 1,5 min betäuben.
  2. Legen Sie die Maus nach der Betäubung auf einen stereotaktischen Rahmen, der auf einer Wasserumlaufdecke sitzt, um während der gesamten Operation eine Körpertemperatur von 37 ° C aufrechtzuerhalten. Befestigen Sie die Maus mit der Schnauzenklemme und den Ohrbügeln am Rahmen. Stellen Sie sicher, dass die Schnauzenklemme und die Ohrstangen stabil genug sind, dass sich der Kopf während des Eingriffs nicht bewegt, aber nicht so fest, dass der Schädel beschädigt wird.
  3. Halten Sie die Anästhesie mit 1-1,5% Isofluran mit Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1-2 l / min aufrecht. Beachten Sie, dass einige Tiere möglicherweise mehr oder weniger Isofluran benötigen, um die Sedierung aufrechtzuerhalten. Überwachen Sie die Atmung des Tieres sowie seine Reflexe auf Zehen- und Schwanzkneifen und passen Sie das Isofluran entsprechend an.
  4. Tragen Sie Augensalbe mit einem Baumwollspitzenapplikator auf jedes Auge auf, um zu verhindern, dass die Augen während des Eingriffs austrocknen.
  5. Rasieren Sie mit Nagetiertrimmern die Haare vom Hals bis knapp hinter den Augen. Seien Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Schnurrhaare des Tieres nicht versehentlich beschnitten werden.
  6. Reinigen Sie den rasierten Bereich mit einem Jod-Prep-Pad, gefolgt von einem Alkohol-Prep-Pad.
  7. Schneiden und entfernen Sie mit steriler Gewebezange und chirurgischer Schere die Haut von den frontalen Nähten vor der Bregma bis hin zum Lambda.
  8. Sobald die Haut entfernt ist, fügen Sie dem Schädel etwa 0,1 ml 1% Xylocain (Lidocain mit Adrenalin 1: 200.000) hinzu, um die Blutung des Schädels zu minimieren.
  9. Mit einer sterilen chirurgischen Klinge aus Kohlenstoffstahl der Größe 11, die an einem Griff befestigt ist, kratzen Sie das Bindegewebe vorsichtig vom Schädel. Seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie das Bindegewebe in der Nähe des Schädelrandes entfernen, da verbleibendes Gewebe später eine starke Haftung des Glases oder der Kopfplatte verhindern könnte.
  10. Verwenden Sie sterile Gewebezangen, um loses Bindegewebe aus dem Schädel zu entfernen.
  11. Reinigen Sie mit sterilen Baumwollspitzenapplikatoren das verbleibende Xylocain aus dem Schädel.
  12. Sobald Sie fertig sind, entfetten Sie den Schädel gründlich mit einem sterilen Baumwollspitzenapplikator, der in Aceton getaucht ist. Verwenden Sie Druckluft, um den Schädel sofort zu föhnen.

3. Kraniotomie

  1. Messen Sie mit einem Feinpunktmarker und einem Lineal die passende Größe für die Öffnung an der gewünschten Stelle. Bestätigen Sie die Größe der Öffnung, indem Sie sie mit der Größe des Deckglases (3 oder 5 mm Durchmesser) vergleichen. Stellen Sie sicher, dass die Öffnung etwas kleiner als die Größe des Deckglases ist.
  2. Zeichnen Sie mit einem Zahnbohrer allmählich die Umrisse der Öffnung nach und dünnen Sie den Knochen aus. Bohren Sie langsam, um ein Bohren durch den Knochen zu verhindern, und bohren Sie in konzentrischen Kreisen, um eine gleichmäßige Ausdünnung des Knochens zu erleichtern.
  3. Fügen Sie nach jedem konzentrischen Durchgang ein oder zwei Tropfen steriler Kochsalzlösung in den gebohrten Bereich ein. Lassen Sie die Kochsalzlösung mindestens 10 s sitzen, um zu verhindern, dass der Knochen überhitzt und die darunter liegende Dura beschädigt.
  4. Verwenden Sie einen sterilen Baumwollspitzenapplikator, um verbleibende Kochsalzlösung zu absorbieren. Blasen Sie Druckluft über den Bereich, um sicherzustellen, dass die gesamte verbleibende Kochsalzlösung verdampft ist, bevor Sie das Bohren wieder aufnehmen. Tun Sie dies, um Knochenreste wegzublasen.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.4, bis der Knochen für die Entfernung ausreichend ausgedünnt ist.
  6. Stellen Sie sicher, dass der Knochen für die Entfernung ausreichend ausgedünnt ist, indem Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig auf den zentralen Bereich des Knochens drücken, um zu überprüfen, ob sich der ausgedünnte Schädel bewegt. Das darunter liegende Gefäßsystem sollte dort sichtbar sein, wo die Bohrungen stattgefunden haben. Beachten Sie, dass der Knochen so aussehen kann, als würde er dort reißen, wo eine Ausdünnung aufgetreten ist.
    HINWEIS: Das Training in diesem Stadium ist entscheidend, um festzustellen, wann der Knochen entsprechend ausgedünnt wurde.
  7. Bevor Sie versuchen, den Knochen zu entfernen, überprüfen Sie die Maus, um sicherzustellen, dass sie vollständig sediert ist. Wenn nicht, erhöhen Sie allmählich die Isofluran-Wartung, um eine Schwellung des Gehirns beim Entfernen des Knochens zu verhindern.
  8. Fügen Sie dem ausgedünnten Schädel ein kleines Stück Gelschaum hinzu, das in Kochsalzlösung gesättigt ist. Fügen Sie ein oder zwei zusätzliche Tropfen Kochsalzlösung zum ausgedünnten Schädel hinzu.
    HINWEIS: Viel Kochsalzlösung über dem ausgedünnten Schädel hilft, Blutungen zu reduzieren und die Dura beim Entfernen der Knochenklappe zu schützen.
  9. Führen Sie die Klinge vorsichtig mit einer 15° spitzen Miniaturklinge in den ausgedünnten Knochen ein und schneiden Sie sie entlang des ausgedünnten Knochens. Halten Sie den Gelschaum in Kochsalzlösung getränkt, um eventuell auftretende Blutungen zu stoppen.
  10. Heben Sie den Knochen vorsichtig mit einer Pinzette an und entfernen Sie ihn. Seien Sie so sanft wie möglich, um Schäden am darunter liegenden Gewebe und Gefäßsystem zu vermeiden. Achten Sie äußerst darauf, die Dura Mater nicht zu beschädigen.
  11. Sobald der Knochenlappen entfernt ist, fügen Sie ein frisches Stück Gelschaum, das in Kochsalzlösung gesättigt ist, in den Kortex ein. Fügen Sie ein paar Tropfen Kochsalzlösung hinzu, um zu verhindern, dass der Gelschaum austrocknet, da dies zu Schäden am darunter liegenden Gewebe führt.

4. Virale Injektionen

  1. Führen Sie virale Injektionen mit einem stereotaktischen Gerät durch.
    1. Bereiten Sie AAV1 vor. CaMKII.0.4.Cre (Titer von 3 × 1013 Genomkopien (GC)/ml) bei 1:5.000 durch serielle Verdünnungen in Kochsalzlösung.
    2. Bereiten Sie die Mischung aus AAV1 vor. CaMKII.0.4.Cre (1:5.000) und AAV1. CAG. FLEX.tdTomate (Titer von 5 × 1012 GC/ml) auf einem kleinen Stück Parafilm.
    3. Füllen Sie eine sterile abgeschrägte Glaspipette mit einer Spitzengröße von 20 μm mit der Virusmischung, indem Sie die Pipette vorsichtig auf die Lösung legen.
    4. Senken Sie die Pipette ab, so dass sie nur die Oberfläche des Gehirns berührt, und senken Sie sie für weitere 200-300 μm für L2/3-Injektionen. Unter Verwendung eines intrazellulären Mikroinjektions-Dosiersystems (siehe Materialtabelle) wird 12-15 Mal über 2 min (20 psi, 9 ms Pulsdauer) unter Druck injiziert. Beobachten Sie den Meniskus im Pipettentropfen bei jeder Injektion, um sicherzustellen, dass die Pipette nicht verstopft ist.
    5. Lassen Sie die Pipette nach der Injektion 4-5 Minuten im Gehirn, um einen Rückfluss zu verhindern. Ziehen Sie die Pipette langsam zurück.
    6. Wiederholen Sie die Injektionen an 2-3 Stellen (ca. 500 μm Abstand).
    7. Entsorgen Sie die gebrauchten Glaspipetten, Parafilme, Pipettenspitzen und Mikrofugenröhrchen, die für serielle Verdünnungen des Cre-Virus verwendet werden, in 10% Bleichmittel.

5. Implantation des Schädelfensters

  1. Entfernen Sie den Gelschaum und verwenden Sie einen kleinen Streifen Schwammstreifen, um die restliche Kochsalzlösung aufzusaugen.
  2. Geben Sie ein paar Tropfen des Antibiotikums Enrofloxacin (22,7 μg / ml) in die Öffnung und lassen Sie es dort für 1 min bleiben. Verwenden Sie nach 1 Minute ein frisches Stück Schwammstreifen, um das verbleibende Enrofloxacin zu absorbieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zwei weitere Male.
  3. Nach dem dritten Waschen ein paar Tropfen Kochsalzlösung in die Öffnung geben und dort 1 min verbleiben lassen. Verwenden Sie nach 1 min ein frisches Stück Schwammstreifen, um die restliche Kochsalzlösung zu absorbieren. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch zwei weitere Male und fügen Sie nach der dritten Wäsche einen kleinen Tropfen Kochsalzlösung in die Öffnung ein.
  4. Legen Sie das Deckglas über die Öffnung. Verwenden Sie eine Pinzette, um sicherzustellen, dass das Glas bündig über die Öffnung ist, um Bilder von guter Qualität zu erhalten.
  5. Während Sie das Glas vorsichtig an Ort und Stelle halten, tragen Sie Cyanacrylat-Klebegel (Table of Materials) um den Umfang des Glases auf, um die Kanten des Fensters mit dem Schädel zu versiegeln. Achten Sie darauf, den Kleber nicht unter das Deckglas sickern zu lassen, und halten Sie so viel Kleber wie möglich von der Oberfläche des Deckglases fern.
  6. Tragen Sie eine Schicht Sekundenkleber über das Klebegel auf. Fügen Sie eine Schicht Zahnzementflüssigkeit über den Kleber hinzu, damit er aushärten kann.
  7. Nehmen Sie eine Hubschrauberkopfplatte in geeigneter Größe und tragen Sie eine dünne Schicht Klebstoff um die zentrale Öffnung auf. Legen Sie die Kopfplatte über das Deckglas und lassen Sie den Kleber kurz trocknen.
  8. In einem 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen fügen Sie der 0,1-ml-Markierung auf der Tube Zahnzementpulver hinzu. Fügen Sie 7-8 Tropfen schnell aushärtender, sofortiger Klebstoff hinzu und mischen Sie. Ziehen Sie in eine 1-ml-Spritze mit einer 19-G-Nadel, die geschnitten wurde, um eine größere Öffnung zu schaffen.
  9. Injizieren Sie die Mischung durch die seitlichen Löcher der Hubschrauberstange, bis sie von beiden Seiten versickert. Tragen Sie die Zahnzement-Klebstoff-Mischung auf den Rest des freiliegenden Schädels auf, um die Kopfplatte am Schädel zu befestigen, wodurch Bewegungsartefakte während der Bildgebung reduziert werden.
  10. Lassen Sie die Mischung mindestens 15 Minuten an der Luft trocknen.
  11. Injizieren Sie der Maus subkutan 0,5 ml Kochsalzlösung, um die Genesung zu unterstützen.

6. Nach dem Betrieb

  1. Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Frame und bringen Sie sie in ihren Käfig zurück.
  2. Legen Sie einen Teil des Käfigs auf eine Wasserumlaufdecke, Raumgel-Heizkissen oder Isothermiepads, um die Erholung zu unterstützen.
  3. Stellen Sie dem Tier zusätzlich zu seiner normalen Ernährung eine kleine Portion Futterpellets und Nassfutter zur Verfügung, um die Genesung weiter zu unterstützen. Fügen Sie jeden Tag nach der Operation für die Dauer der Genesung neue Futterpellets und Nassfutter hinzu.
  4. Injizieren Sie Mäusen am Tag nach der Operation einmal 5 mg/kg Carprofen und 5 mg/kg Enrofloxacin.
  5. Injizieren Sie den Mäusen an den Tagen 2-6 einmal 5 mg/kg Carprofen und zweimal 5 mg/kg Enrofloxacin, vorbehaltlich der Zulassung durch die lokale IACUC. Trennen Sie die Enrofloxacin-Injektionen um mindestens 8 h.
  6. Injizieren Sie den Mäusen an den Tagen 7-20 täglich 5 mg/kg Carprofen.

7. Tiergewöhnung für die Bildgebung

  1. Untersuchen Sie am 14. Tag nach der Operation das Schädelfenster auf optische Klarheit. Verwenden Sie keine Mäuse mit unklaren oder anderweitig beschädigten Fenstern (z. B. übermäßige Angiogenese).
  2. Überprüfen Sie die tdTomato-Expression unter einem Fluoreszenzmikroskop. Wenn markierte Zellen identifiziert werden können, fahren Sie mit der Tiergewöhnung fort.
  3. Erster Tag der Gewöhnung (Handhabung)
    1. Halten Sie die Maus einige Minuten lang gedrückt und bringen Sie sie nach der Handhabung in ihren Käfig zurück. Wiederholen Sie die Handhabung dreimal mit einem Abstand von 15 Minuten zwischen den Sitzungen.
    2. Gewöhnen Sie sich nach dem dritten Versuch an die Maus, indem Sie das Tier in ein kleines Stück Stoff wickeln.
    3. Halten Sie die Maus in Stoff gewickelt für ca. 1 min.
    4. Bringen Sie die Maus nach dem Versuch in ihren Käfig zurück. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zwei weitere Male, so dass zwischen den einzelnen Versuchen ein Intervall von 15 Minuten liegt.
  4. Zweiter Tag der Gewöhnung
    1. Wiegen und notieren Sie das Gewicht der Maus.
    2. Wickeln Sie die Maus in ein Tuch und befestigen Sie sie über ihre Kopfplatte am Kopffixationsarm des luftgestützten Heimkäfigs.
    3. Lassen Sie den Hauskäfig dem Licht ausgesetzt.
    4. Lassen Sie die Maus 15 Minuten lang im Wohnmobilkäfig gesichert bleiben.
    5. Entfernen Sie nach der Gewöhnung die Maus aus dem Hauskäfig und schalten Sie den Luftstrom aus.
    6. Wiegen Sie die Maus und bringen Sie sie in ihren Käfig zurück. Achten Sie darauf, nur Mäuse einzubeziehen, die nicht mehr als 10% ihres Körpergewichts verlieren. Schließen Sie Mäuse, die an einem beliebigen Tag der Gewöhnung mehr als 10% ihres Gewichts verlieren, von bildgebenden Experimenten aus.
  5. Tag drei der Gewöhnung und darüber hinaus
    1. Wiegen und notieren Sie das Mausgewicht, bevor Sie es am luftgehissten Heimkäfig befestigen.
    2. Befestigen Sie die Maus am luftgestützten Heimkäfig.
    3. Decken Sie den Hauskäfig mit etwas ab, das ein dunkles Interieur bietet, z. B. eine Box, und lassen Sie die Maus 30 Minuten lang gesichert bleiben.
    4. Entdecken Sie nach 30 Minuten den Heimkäfig, entfernen Sie die Maus und schalten Sie den Luftstrom aus.
    5. Wiegen und notieren Sie das Gewicht der Maus nach der Gewöhnung.
    6. Wiederholen Sie diesen Vorgang jeden Tag und erhöhen Sie die Dauer, die die Maus am Heimkäfig befestigt ist, um 15 Minuten. Setzen Sie diesen Vorgang fort, bis die Maus für 1,5 Stunden am Heimkäfig befestigt werden kann, da dies die ungefähre Dauer einer Zwei-Photonen-Bildgebungssitzung ist.
    7. Um die Maus an Geräusche zu gewöhnen, führen Sie einige Gewöhnungssitzungen am Mikroskop durch, um die Maus an die Geräusche der Laserscanning-Spiegel zu gewöhnen. Schließen Sie Mäuse aus, die sich nicht ausreichend gewöhnen (z. B. Vokalisationen und stressinduzierte Defäkation).

8. Multiphotonen-Bildgebung

  1. Beginnen Sie 3 Wochen nach der Operation mit der Bildgebung, damit sich das Fenster öffnen kann.
  2. Führen Sie die Bildgebung auf einem maßgeschneiderten oder handelsüblichen Multiphotonenmikroskop durch, das mit einem Ti:Saphir-Laser ausgestattet ist. Erfassen Sie Bilder mit einem Wassertauchobjektiv mit hoher numerischer Apertur (NA).
    HINWEIS: Die Zweikanal-Bildgebung wird durch die Verwendung eines dichroitischen 565-nm-Spiegels und zweier externer Photomultiplierröhren erreicht. Ein 535/50-Bandpassfilter wird verwendet, um GCaMP6f-Emissionen zu erkennen, und ein 610/75-Bandpassfilter wird verwendet, um tdTomato zu erkennen. Ein 25-faches Wassertauchobjektiv (1,05 NA) und Resonanzscanner wurden verwendet, um Bilder in Abbildung 1 und Abbildung 2 zu erfassen. Jede Region von Interesse bestand aus einem Stapel von Bildern, die axial durch 1 μm getrennt waren. Jeder optische Abschnitt wurde mit 512 x 512 Pixeln, 0,18 μm/Pixel gesammelt. Bilder wurden aus dem Vordergliedmaßenbereich des primären motorischen Kortex aufgenommen, der durch stereotaktische Koordinaten bestimmt wurde.
  3. Stellen Sie die Wellenlänge des Lasers auf 920 nm ein (990 nm, wenn ein rotverschobener GECI verwendet wird).
  4. Legen Sie die Maus auf den Käfig des Wohnmobils und klemmen Sie die Kopfplatte an den Kopfbefestigungsarm.
  5. Fügen Sie ein paar Tropfen Wasser in die Mitte des Fensters hinzu.
  6. Wählen Sie im Weitfeldmodus des Mikroskops 2-3 Positionen eines leicht identifizierbaren Gefäßsystems aus. Speichern Sie die Bilder dieser Blutgefäße und zeichnen Sie die X- und Y-Koordinaten auf, die auf dem Motorcontroller erscheinen, um die tdTomato-markierten Dendriten für nachfolgende Bildgebungssitzungen zu verschieben. Passen Sie die X- und Y-Koordinaten jedes Mal an, um sie mit den gespeicherten Bildern der Blutgefäße neu auszurichten.
  7. Sobald das Gefäßsystem abgebildet und die Positionen aufgezeichnet wurden, lokalisieren Sie die Regionen mit Neuronen, die tdTomato exprimieren (Abbildung 1). Stellen Sie die synaptischen Strukturen (Dendriten und Axone) von Neuronen und die GCaMP6f-Aktivität in Astrozyten dar.
    HINWEIS: Die Dendriten dienen als Landmarken, um zuverlässig in die gleichen Regionen zurückzukehren und die gleichen Dendriten und Astrozyten über wiederholte Tage abzubilden. Bei stabiler Kopffixierung und nach Gewöhnung an die Kopffixierung wurde keine nachweisbare Verschiebung in der Bildgebungsebene beobachtet. Verschiebungen, die in X- und Y-Richtung auftreten, werden bewegungskorrigiert.
  8. Bringen Sie die Maus nach der Bildgebung in ihren Käfig zurück.
    HINWEIS: Mäuse werden in der Regel maximal 2 Stunden auf dem Zielfernrohr gehalten. Wenn die Bildgebung lange anhält, kann das Wasser unter dem Objektiv trocknen. Während der Experimente sollte Wasser hinzugefügt werden. Alternativ kann anstelle von Wasser ein Ultraschallgel verwendet werden.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die Qualität des Schädelfensters kann daran gemessen werden, wie scharf die neuronalen Strukturen erscheinen. In einem guten Fenster sind dendritische Stacheln deutlich sichtbar (Abbildung 1). Mit den gespeicherten Struktur- und Positionsdaten kann dasselbe Tier wiederholt Tage, Wochen oder Monate lang abgebildet werden, um dieselben Zellen zu untersuchen (Abbildung 1). Die Bilder in Abbildung 1 wurden aus dem Vordergliedmaßenbereic...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Hier haben wir ein Protokoll für die Implantation chronischer Schädelfenster für die In-vivo-Bildgebung von kortikalen Astrozyten und Neuronen in wachen, kopfgefesselten Mäusen auf einem luftgestützten Hauskäfig vorgestellt. Konkrete Beispiele für die kraniale Fensteranwendung zur Abbildung von Astrozyten, die GECIs und neuronale synaptische Strukturen exprimieren, wurden bereitgestellt. Mit Hilfe der Multiphotonenmikroskopie können astrozytäre Calciumsignaldynamiken und strukturelle synaptische Dynamiken wieder...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15o SpitzklingeSurgistar6500Chirurgie-Werkzeuge
19 g NadelnBD305186Chirurgie Versorgung
AAV1-CAG-FLEX-tdTomatoAddgene28306-AAV1Viraler Vektor
AAV1-CaMKII-0-4-CreAddgene105558-AAV1Viraler Vektor
ActeonFisher ScientificA16P4Reagenz
Alkohol VorbereitungPads Fisher ScientificCovidien 5750Chirurgie Versorgung
BevelerNarishigeAusrüstung
BorosilikatglasWelt PräzisionsinstrumenteTW100F-4Chirurgie Versorgung
HartmetallbohrerSS Weiß Dental14717Chirurgie Werkzeuge
Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mLZoetis Mylan Institutional, LLC.Drug
Compressed AirFisher Scientific23-022-523Chirurgie Zubehör
Wattestäbchen ApplikatorenPuritan836-WC NO BINDERChirurgie
Versorgung Deckglas, Nr. 1 Dicke, 3 mm/5 mmWarner Instruments64-0720, 64-0700Chirurgie Zubehör
ZahnbohrerAsepticoAusrüstung
Dexamethason, 4 mg/mLMylan Institutional, LLC.
Mikroskop zum PräparierenNikonEquipment
Duralay Liquid  (Zahnzement flüssig)Patterson Dental602-8518Reagenz
Duralay Pulver  (Zahnzementpulver)Patterson Dental602-7932Reagenz
Enrofloxacin, 2,27%BayerDrug
AugensalbeDechra17033-211-38Chirurgie Versorgung
Fiber Lite High Intensity IlluminatorDolan-Jenner IndustriesAusrüstung
Pinzette (groß)World Precision Instruments14099Chirurgie Werkzeuge
Pinzette ( Small)World Precision Instruments501764Surgery Tools
GCaMP6f B6; 129S-GT(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/JThe Jackson LaboratoryLagernummer: 024105Mauslinie
GerminatorFisher ScientificEquipment
GLAST-CreER Tg (Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/JDas Jackson LaboratoryLagerbestandsnummer: 012586Mauslinie
KopfplatteNeurotarModell 1, Modell 3Chirurgie Zubehör
Hämostatische PinzetteWorld Precision Instruments501705Chirurgie
Halter für 15o Spitze KlingeWorld Precision Instruments501247
Chirurgie Werkzeughalter für SkalpellklingenWorld Precision Instruments500236Chirurgie Werkzeuge
JodvorbereitungspadsAvantor15648-926Chirurgie Versorgung
IsofluranPiramalChirurgie Versorgung
Isofluran Tischsystem mit InduktionsboxHarvard Geräteausrüstung
Isofluran VaporizerSurgiVetAusrüstung
Krazy GlueOffice DepotKG517Reagenz
Loctite 401Henkel40140schnellhärtender Sofortklebstoff
Loctite 454FisherScientific NC9194415Cyanacrylat-Haftgel
Mikropipette AbzieherSutter InstrumentsAusrüstung
für Multiphotonenmikroskope
Ausrüstung StickstoffMathesonNI M200Gas
SauerstoffMathesonOX M250Gas
PicospritzerParkerIntrazelluläres Mikroinjektions-Dosiersystem
PipettenspitzenRainin17014340Chirurgie Versorgung
Nagetier HaarschneiderWahlAusrüstung
Kochsalzlösung (0,9 % Natriumchlorid)Med Vet InternationalRX0,9NACL-30BACChirurgie Versorgung
Skalpellklingen, Größe 11Integra4-111Chirurgie Werkzeuge
SchereWorld Precision Instruments503667Chirurgie Werkzeuge
Stereotaktische InstrumenteStoeltingEquipment
Sugi Schwamm Strips (Schwammstreifen)Kettenbach Dental31002Chirurgie
Zubehör SURGIFOAM (Gelschaum)Ethicon1972Chirurgie Zubehör
Spritze mit 26 g NadelBD309625Chirurgie Versorgung
TamoxifenSigma AldrichT5648-1GReagenz
Ti:Saphir LaserKohärenteAusrüstung
Transfer PipettenFisher Scientific13-711-9AMChirurgie Versorgung
WasserdeckeFisher ScientificAusrüstung
Xylocain MPF mit Adrenalin (1:200.000), 10 mg/ mLFresenius Kabi USAMedikament
von Medikamenten Werkzeuge

Referenzen

  1. Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
  2. Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
  3. Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
  4. Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
  5. Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
  6. Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
  7. Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
  8. Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
  9. Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
  10. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
  11. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742(2014).
  12. Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
  13. Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
  14. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  15. Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
  16. Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
  17. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  18. Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
  19. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  20. Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
  21. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  22. Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
  23. Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
  24. Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024(2011).
  25. Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
  26. Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
  27. Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
  28. Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
  29. Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  30. Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869(2014).
  31. Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  32. Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
  33. De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
  34. Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
  35. Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  36. Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742(2012).
  37. Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
  38. Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
  39. Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464(2018).
  40. Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
  41. Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
  42. Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422(2014).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Implantation eines kranialen FenstersBildgebung bei wachen MäusenMultiphotonen-BildgebungKopf fixierungvirale InjektionenGCaMP6f-Astrozytenneuronale StrukturCalcium-ImagingVerhaltensanalyse
Implantation eines kranialen Fensters für wiederholte In-vivo-Bildgebung bei wachen Mäusen
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.