Method Article

Eine effiziente Methode zur gerichteten Hepatozyten-ähnlichen Zellinduktion aus menschlichen embryonalen Stammzellen

DOI:

10.3791/62654

⸱

May 6th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Stem Cell Research Center, Shantou University Medical College, 2The Center for Reproductive Medicine, Shantou University Medical College, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Infectious Diseases and Molecular Immunopathology, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) in funktionelle hepatozytenähnliche Zellen (HLCs) durch kontinuierliche Ergänzung von Activin A und CHIR99021 während der hESC-Differenzierung zu definitivem Endoderm (DE).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die potenziellen Funktionen von Hepatozyten-ähnlichen Zellen (HLCs), die aus menschlichen embryonalen Stammzellen (hESCs) gewonnen werden, sind vielversprechend für die Krankheitsmodellierung und Das Screening von Medikamenten. Hier steht eine effiziente und reproduzierbare Methode zur Differenzierung von hESCs in funktionelle HLCs zur Verfügung. Die Etablierung einer Endoderm-Linie ist ein wichtiger Schritt bei der Differenzierung zu HLCs. Mit unserer Methode regulieren wir die wichtigsten Signalwege, indem wir Activin A und CHIR99021 während der hESC-Differenzierung kontinuierlich in definitives Endoderm (DE) ergänzen, gefolgt von der Generierung von hepatischen Vorläuferzellen und schließlich HLCs mit typischer Hepatozytenmorphologie in einer stufenweisen Methode mit vollständig definierten Reagenzien. Die mit dieser Methode hergestellten hESC-abgeleiteten HLCs exprimieren stadiumsspezifische Marker (einschließlich Albumin, HNF4α-Kernrezeptor und Natriumtaurocholat-Cotransport-Polypeptid (NTCP)) und zeigen besondere Eigenschaften im Zusammenhang mit reifen und funktionellen Hepatozyten (einschließlich Indocyanin-Grünfärbung, Glykogenspeicherung, Hämatoxylin-Eosin-Färbung und CYP3-Aktivität) und können eine Plattform für die Entwicklung von HLC-basierten Anwendungen in der Untersuchung von Lebererkrankungen bieten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Leber ist ein stark metabolisches Organ, das mehrere Rollen spielt, einschließlich Desoxidation, Speicherung von Glykogen und Sekretion und Synthese von Proteinen1. Verschiedene Krankheitserreger, Medikamente und Vererbung können pathologische Veränderungen in der Leber verursachen und ihre Funktionen beeinflussen2,3. Hepatozyten als Hauptfunktionseinheit der Leber spielen eine wichtige Rolle bei künstlichen Leberunterstützungssystemen und der Eliminierung der Arzneimitteltoxizität. Die Ressource primärer humaner Hepatozyten ist jedoch sowohl in der zellbasierten Therapie als auch in der Lebererkrankungsforschung begrenzt. Daher ist die Entwicklung neuer Quellen funktioneller menschlicher Hepatozyten eine wichtige Forschungsrichtung im Bereich der regenerativen Medizin. Seit 1998, als hESCs etabliert wurden4, wurden hESCs von Forschern wegen ihres überlegenen Differenzierungspotenzials (sie können sich in einer geeigneten Umgebung in verschiedene Gewebe differenzieren) und eines hohen Grades an Selbsterneuerbarkeit weithin in Betracht gezogen und bieten somit ideale Quellzellen für biokünstliche Lebern, Hepatozytentransplantation und sogar Lebergewebe-Engineering5.

Derzeit kann die hepatische Differenzierungseffizienz durch Anreicherung des Endoderms6stark erhöht werden. Bei der Liniendifferenzierung von Stammzellen in Endoderm sind ebenen des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β) Signalwege und WNT-Signalwege die Schlüsselfaktoren im Knoten des Endodermbildungsstadiums. Die Aktivierung eines hohen TGF-β- und WNT-Signals kann die Entwicklung von Endoderm7,8fördern. Activin A ist ein Zytokin, das zur TGF-β-Superfamilie gehört. Daher wird Activin A häufig in der Endoderminduktion von human induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) und hESCs9,10verwendet. GSK3 ist eine Serin-Threonin-Proteinkinase. Forscher haben herausgefunden, dass CHIR99021, ein spezifischer Inhibitor von GSK3β, typische WNT-Signale stimulieren und unter bestimmten Bedingungen die Stammzelldifferenzierung fördern kann, was darauf hindeutet, dass CHIR99021 das Potenzial hat, die Stammzelldifferenzierung in Endoderm 11,12,13zu induzieren.

Hier berichten wir über eine effiziente und reproduzierbare Methode, um die Differenzierung von hESCs in funktionelle HLCs effektiv zu induzieren. Die sequentielle Zugabe von Activin A und CHIR99021 erzeugte etwa 89,7±0,8% SOX17 (DE-Marker)-positive Zellen. Nach der weiteren Reifung in vitroexprimierten diese Zellen leberspezifische Marker und übten eine hepatozytenähnliche Morphologie (basierend auf Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H & E)) und Funktionen wie die Aufnahme von Indocyaningrün (ICG), Glykogenspeicherung und CYP3-Aktivität aus. Die Ergebnisse zeigen, dass hESCs mit dieser Methode erfolgreich in reife funktionelle HLCs differenziert werden können und eine Grundlage für leberkrankheitsbezogene Forschung und In-vitro-Wirkstoffscreening bieten können.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Stammzellpflege

HINWEIS: Das unten beschriebene Zellwartungsprotokoll gilt für die hES03-Zelllinie, die in einer adhärenten Monoschicht gepflegt wird. Für alle folgenden Protokolle in diesem Manuskript sollten Zellen unter einer biologischen Sicherheitswerkbank behandelt werden.

  1. Bereiten Sie 1x mTesR-Stammzellkulturmedium vor, indem Sie 5x Ergänzungsmedium auf mTesR-Basismedium verdünnen.
  2. Bereiten Sie 30x hESC-qualifiziertes Matrigelmedium vor, indem Sie 5 ml hESC-qualifiziertes Matrigel mit 5 ml DMEM/F12 auf dem Eis verdünnen. Bei -20 °C lagern.
  3. Bereiten Sie 1x hESC-qualifiziertes Matrigelmedium vor, indem Sie 33,3 μL 30x hESC-qualifiziertes Matrigel mit 1 ml DMEM/F12 verdünnen.
  4. Sterile 6-Well-, Gewebekultur-behandelte Platten mit jeweils 1 mL 1x hESC-qualifiziertem Matrigel im Voraus beschichten und über Nacht bei 4 °C lagern. Vor Gebrauch mindestens 30 min bei Raumtemperatur (RT) einräumen.
  5. Die kryokonservierten hESCs in einem 37 °C Wasserbad für 3 min ohne Schütteln auftauen. Dann werden die Zellen sofort durch Pipettieren in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen mit 4 mL vorgewarmten 37 °C mTesR Medium übertragen, 2 mal sanft auf und ab pipettiert.
  6. Zentrifugieren Sie die hESCs bei 200 x g für 2 min bei RT.
  7. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 1 ml mTesR-Medium.
  8. Saugen Sie das DMEM/F12-Medium von der Platte ab und säen Sie die Zellen in eine Vertiefung aus 6-Well-Platte mit einer Dichte von 1 x10 5 Zellen in 2 mL mTesR.
  9. Inkubieren Sie in einem 5% CO 2-Inkubator und erhalten Sie die Zellen, indem Sie sie täglich durch vorgewärmtes mTesR-Medium ersetzen. Passage der Zellen bei etwa 70-80% Konfluenz oder wenn die Zellkolonien beginnen, Kontakt aufzunehmen.

2. Stammzellpassage und -differenzierung

  1. Für passagierende Zellen das Medium absaugen und die Zellen mit 1 ml Enzymlösung pro Vertiefung (z. B. Accutase für 5 min bei 37 °C) inkubieren. Anschließend werden die Zellen durch Pipettieren in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 4 ml DMEM/F12 vorgewarmt auf 37 °C übertragen.
  2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g bei RT für 2 min.
  3. Saugen Sie das Medium an und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 1 ml mTesR-Medium.
  4. Bereiten Sie 24-Well-Platten vor, indem Sie im Voraus mit 250 μL 1x hESC-qualifiziertem Matrigel-Medium beschichten. Seed hESCs wie oben beschrieben bei einer Dichte von 1 - 1,5 x 105 Zellen pro Vertiefung in 500 μL mTesR-Medium.
  5. Lassen Sie die Zellen 24 h bei 37 °C in einem CO 2-Inkubatorinkubieren.

3. DE-Bildung

  1. Bereiten Sie Stammlösungen von 100 μg/ml Activin A mit DPBS vor, die 0,2% BSA und 3 mM CHIR99021 mit DMSO enthalten.
  2. Bereiten Sie das Basismedium der Stufe I differenzierung vor, indem Sie das RPMI-Medium mit 1x B27 ergänzen.
  3. Activin A zu einer Endkonzentration von 100 ng/ml und CHIR99021 zu einer Endkonzentration von 3 μM in einem geeigneten Volumen des vorgewärmten Stufe-I-Differenzierungsgrundmediums hinzufügen.
  4. Saugen Sie mTesR-Medium aus den Zellen ab und ersetzen Sie es durch Differenzierungsmedien der Stufe I, die zusätzliche Differenzierungsfaktoren enthalten (z. B. 0,5 ml pro Vertiefung einer 24-Well-Platte).
  5. Lassen Sie die Zellen 3 Tage lang bei 37 °C ineinem CO 2-Inkubator inkubieren und ersetzen Sie täglich die Medien der Stufe I durch frisch hinzugefügte Differenzierungsfaktoren (Tage 0-2).
    HINWEIS: Nach 3 Tagen der Differenzierung sollten differenzierte Zellen Marker von DE-Zellen wie FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 und FOXA1 exprimieren (mindestens 80% von SOX17 werden für das Fortfahren benötigt).

4. Differenzierung von leberischen Vorläuferzellen

  1. Vorbereitung von Basismedien der Stufe II der Differenzierung durch Auflösung des Knockout-Serumersatzes (KOSR) auf eine Endkonzentration von 20% in Knock Out DMEM.
  2. Herstellung eines Differenzierungsmediums der Stufe II mit 1% DMSO, 1x GlutaMAX, 1x Lösung einer nicht-essentiellen Aminosäure (NEAA), 100 μM 2-Mercaptoethanol und 1x Penicillin/Streptomycin (P/S) zum entsprechenden Volumen von KOSR/Knockout DMEM.
  3. An Tag 3 der Differenzierung das Medium absaugen und durch Medium der Stufe II ersetzen (z. B. 0,5 ml pro Vertiefung einer 24-Well-Platte). Dann 24 h inkubieren.
  4. Am Tag 4 der Differenzierung das Medium absaugen und durch Medium der Stufe II ersetzen (z. B. 1 ml pro Vertiefung einer 24-Well-Platte).
  5. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag (ersetzen Sie das Medium an Tag 6).
    HINWEIS: Nach 8 Tagen der Differenzierung sollten differenzierte Zellen geeignete Marker von hepatischen Vorläuferzellen wie HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA exprimieren (mindestens 80% HNF4α werden für das Weitere Vorgehen benötigt).

5. Hepatozytendifferenzierung

  1. Bereiten Sie 10 μg/ml Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF), 20 μg/ml Oncostatin (OSM) Stammlösungen mit DBPS (mit 0,2% BSA) und Filter mit einer 0,22 μm Filtermembran vor.
  2. Herstellung des Basismediums der Stufe III (HepatoZYME-SFM (HZM)-Medium, ergänzt mit 10 μM Hydrocortison-21-hemisuccinat und 1x P/S).
  3. HGF wird zu einer Endkonzentration von 10 ng/ml und OSM zu einer Endkonzentration von 20 ng/ml zum entsprechenden Volumen des vorgewärmten Differenzierungsmediums der Stufe III gegeben.
  4. Am Tag 8 der Differenzierung atmpirieren Sie Medium des Stadiums II aus den Zellen und ersetzen Es durch Medium der Stufe III (z. B. 1 ml pro Vertiefung einer 24-Well-Platte).
  5. Lassen Sie die Zellen 10 Tage lang bei 37 °C in einem CO 2-Inkubator inkubieren und wechseln Sie die Medien der Stufe III jeden zweiten Tag mit frisch hinzugefügten Differenzierungsfaktoren (Tage 8-18).
    HINWEIS: Nach 18 Tagen der Differenzierung sollten differenzierte Zellen charakteristische Marker von Hepatozyten wie AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4 exprimieren. Der Anteil der Albumin-positiven Zellen beträgt in der Regel mehr als 90%.

6. RNA-Isolierung, cDNA-Synthese und RT-qPCR-Analyse

  1. Saugen Sie Medium aus den Zellen ab und fügen Sie die richtige Menge an RNAiso Plus-Reagenz hinzu (z. B. 0,3 ml pro Vertiefung einer 24-Well-Platte). Sammeln Sie den Überstand in einem 1,5 ml Rohr und lassen Sie ihn 5 min bei RT stehen.
  2. Fügen Sie 60 μL Chloroform-Reagenz hinzu und lassen Sie es bei RT für 5 min. Dann Zentrifuge bei 12.000 x g für 15 min.
  3. Sammeln Sie den 125 μL Überstand und übertragen Sie ihn in ein anderes Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 160 μL Isopropanol hinzu, mischen Sie gut und stehen Sie 10 Minuten bei RT.
  4. Zentrifuge bei 12.000 x g für 10 min.
  5. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 75% Ethanol zum Gefällten hinzu und zentrifugieren Sie bei 7.500 x g für 5 min.
  6. Nach dem Trocknen bei RT 40 μL DEPC-behandeltes Wasser zum Auflösen hinzufügen. Für qPCR transkribieren Sie 2 μg der Gesamt-RNA mit einem Reverse-Transkriptionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  7. Führen Sie RT-qPCR mit einem kommerziellen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.
  8. Normalisieren Sie die Genexpression relativ zu nicht induzierten Stammzellen und bestimmen Sie die Faltenvariation nach der Normalisierung auf GAPDH.

7. Immunfluoreszenz-Validierung der Differenzierung

  1. Bereiten Sie 1x PBST-Waschpuffer vor, indem Sie 0,1% Tween-20 zu PBS hinzufügen.
  2. Medium aus haftende Zellen absaugen und kurz mit PBS bei RT auf einem Shaker waschen.
  3. Saugen Sie PBS an und inkubieren Sie Zellen mit 500 μL eiskaltem Methanol pro Vertiefung einer 24-Well-Platte, um die Zellen über Nacht bei -20 °C zu fixieren.
  4. Entfernen Sie das Methanol und waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS auf einem Shaker für jeweils 10 min bei RT.
  5. Blockzellen mit 500 μL 5% BSA, die in PBS für 1-2 h bei RT auf einem Shaker hergestellt werden.
  6. Verdünnen Sie den primären Antikörper bei 1: 200 in der gleichen Lösung, die zur Blockierung verwendet wird.
  7. Inkubieren Sie die fixierten Zellen in 300 μL primärer Antikörperlösung über Nacht bei 4 °C auf einem Shaker.
  8. Nach der Inkubation über Nacht die Zellen 3 mal mit PBST für jeweils 10 min bei RT auf einem Shaker waschen.
  9. Sekundäre Antikörperlösung in Blockierungslösung bei 1:1000 vorbereiten.
  10. Inkubieren Sie in 300 μL sekundärer Antikörperlösung, die vor Licht geschützt für 1 h bei RT auf einem Shaker geschützt ist.
  11. Sekundäre Antikörperlösung absaugen und Zellen 3 mal mit PBST für jeweils 10 min bei RT auf einem Shaker waschen.
  12. Inkubieren Sie die Zellen mit 300 μL 1 μg/ml DAPI für 3-5 min und waschen Sie sie dann zweimal mit PBST.
  13. Fügen Sie nach dem Absaugen von PBST eine angemessene Menge PBS hinzu, um Bilder unter einem Fluoreszenzmikroskop aufzunehmen.

8. Western-Blot-Analyse

  1. Bereiten Sie 1x TBST Waschpuffer vor, indem Sie 0,1% Tween-20 zu Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) hinzufügen.
  2. Bereiten Sie den SDS-PAGE-Elektrophoresepuffer und den westlichen Transferpuffer vor, indem Sie ein kommerzielles Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers verwenden.
  3. Lösen Sie das Gesamtzellprotein (40 μg) auf einem 10% igen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel auf und laufen Sie in SDS-PAGE-Elektrophoresepuffer bei 15 mA Konstantstrom für etwa 2 h.
  4. Übertragen Sie das Gel auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membran bei 300 mA Konstantstrom für 2 h bei niedriger Temperatur.
    HINWEIS: Die Laufzeit und die Übertragungszeit können je nach verwendetem Gerät und Art und Prozentsatz des Gels variieren.
  5. Blockieren Sie die Membran mit 3% BSA, die in TBST für 1 h bei RT auf einem Shaker vorbereitet wurden.
  6. Inkubieren Sie in primärer Antikörperlösung (1:1000 Verdünnung) über Nacht bei 4 °C auf einem Shaker.
  7. Nach der Inkubation über Nacht die Löschmembran 3 mal mit TBST für 15 min pro Zeit bei RT auf einem Shaker waschen.
  8. Inkubieren Sie in sekundärer Antikörperlösung (1:2000 Verdünnung) für 2 h bei RT auf einem Shaker.
  9. Verwerfen Sie die sekundäre Antikörperlösung und waschen Sie die Membran 3 Mal mit TBST, jedes Mal für 15 minuten, bei RT auf einem Shaker.
  10. Visualisieren Sie immunreaktive Banden mit einem Chemilumineszenzreagenz, gefolgt von einer Autoradiographie. Verwenden Sie β-Actin als Ladesteuerung.

9. Indocyanin-Grünaufnahme

  1. Bereiten Sie 200 mg / ml Indocyanin-Grünbrühlösung in DMSO vor.
  2. Bereiten Sie eine Arbeitslösung vor, indem Sie das Differenzierungsmedium der Stufe III mit Indocyaningrünlösung auf eine Endkonzentration von 1 mg / ml ergänzen.
  3. Inkubieren Sie in einem 37 °C, 5% CO2 Inkubator für 1-2 h.
  4. Medium absaugen und die Zellen 3 mal mit PBS waschen.
  5. Fotografieren Sie unter dem Mikroskop.

10. Periodische Säure-Schiff (PAS) Färbung und Hämatoxylin-Eosin (H&E) Färbung

  1. Saugen Sie Medium aus haftenden Zellen ab und waschen Sie es zweimal kurz mit PBS.
  2. Zur Zellfixierung PBS absaugen und Zellen über Nacht mit eiskaltem Methanol bei -20 °C inkubieren.
  3. Visualisieren Sie die Glykogenspeicherung durch PAS-Färbung und beobachten Sie binukleierte Zellen durch H & E-Färbung mit einem Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  4. Machen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop.

11. Assay für CYP-Aktivität

  1. Messen Sie die CYP450-Aktivität mit handelsüblichen zellbasierten Assays (P450-Glo Assays) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  2. Verwenden Sie drei unabhängige Wiederholungen zum Testen. Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt.

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Results

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Das schematische Diagramm der HLC-Induktion von hESCs und repräsentative Hellfeldbilder jeder Differenzierungsstufe sind in Abbildung 1 dargestellt. Im Stadium I wurden Activin A und CHIR99021 für 3 Tage hinzugefügt, um Stammzellen zur Bildung von Endodermzellen zu induzieren. Im Stadium II differenzierten sich die Endodermzellen nach 5-tägiger Behandlung mit Differenzierungsmedium zu leberförmigen Vorläuferzellen. Im Stadium III waren frühe Hepatozyten nach 10 Tagen in HGF und OSM gereift u...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir eine schrittweise Methode vor, die HLCs aus hESCs in drei Stufen induziert. In der ersten Stufe wurden Activin A und CHIR99021 verwendet, um hESCs in DE zu unterscheiden. In der zweiten Stufe wurden KO-DMEM und DMSO verwendet, um DE in hepatische Vorläuferzellen zu differenzieren. In der dritten Stufe wurden HZM plus HGF, OSM und Hydrocortison-21-Hemisuccinat-Natriumsalz verwendet, um die hepatischen Vorläuferzellen weiterhin in HLCs zu differenzieren.

Die folgenden kritischen...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81870432 und 81570567 zu X.L.Z.), (Nr. 81571994 zu P.N.S.) unterstützt; die Natural Science Foundation der Provinz Guangdong, China (Nr. 2020A1515010054 bis P.N.S.), Die Li Ka Shing Shantou University Foundation (Nr. L1111 2008 bis P.N.S.). Wir danken Prof. Stanley Lin vom Shantou University Medical College für nützliche Ratschläge.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigmaM7522Für die Differenzierung von hepatischen Vorläuferzellen
488 markierte Ziege gegen Maus IgGZSGB-BIOZF-0512Für IF, zweiter Antikörper
488 markierte Ziege gegen Kaninchen IgGZSGB-BIOZF-0516Für IF, zweiter Antikörper
AccutaseStem Cell Technologies7920Für die Zellpassage
Activin ApeproTech120-14EFür die definitive Endodermbildung
Anti-Albumin (ALB)Sigma-AldrichA6684Für IF und WB, Primärantikörper
Anti - Human Oct4AbcamAb19587Für IF, Primärantikörper
Anti-α-Fetoprotein (AFP)Sigma-AldrichA8452Für IF und WB, Primärantikörper
Anti-SOX17Abcamab224637Für IF ist der Primärantikörper
Anti-Hepatozyten-Kernfaktor 4 alpha (HNF4α)Sigma-AldrichSAB1412164Für IF, Primärantikörper
B-27 SupplementGibco17504-044Für die definitive Endodermbildung
BSABeyotimeST023-200gFür die Zellblockierung
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046Für die definitive Endodermbildung
DAPIBeyotimeC1006Für die Kernfärbung
DEPC-waterBeyotimeR0021Für die RNA-Auflösung
DM3189MCEHY-12071Für die definitive Endodermbildung
DMEM/F12Gibco11320-033Für die Zellkultur
DMSOSigma-AldrichD5879Für die Differenzierung von hepatischen Vorläuferzellen
DPBSGibco14190-144Für die Zellkultur
GlutaMAXGibco35050-061Für die Differenzierung von Vorläuferzellen in der Leber
H& E FärbesetBeyotimeC0105Sfür H& E-Färbung
Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF)peproTech100-39Zur Hepatozyten-Differenzierung
HepatoZYME-SFM (HZM)Gibco17705-021Zur Hepatozyten-Differenzierung
Hydrocortison-21-hemisuccinatSigma-AldrichH4881Zur Hepatozyten-Differenzierung
IndocyaninSangon BiotechA606326Zur Indocyanin-Färbung
Knock Out DMEMGibco10829-018Für die Differenzierung von hepatischen Vorläuferzellen
Knock Out SR Multi-SpeciesGibcoA31815-02Für die Differenzierung von hepatischen Vorläuferzellen
Matrigel hESC-qualifiziertesCorning354277Für die Zellkultur
MEM NeAAGibco11140-050Für die Differenzierung von hepatischen Vorläuferzellen
mTesR 5X ErgänzungStem Cell Technologies85852Für Zellkulturen
mTesR BasalmediumStem Cell Technologies85851Für Zellkulturen
Oncostatin (OSM)peproTech300-10Für die Hepatozytendifferenzierung
P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)PromegaV8901Für CYP450 Aktivität
PAS-FärbekitSolarbioG1281Für PAS-Färbungen
Pen/StrepGibco15140-122Für die Zelldifferenzierung
Peroxidase-konjugierte Ziege Anti-Maus IgGZSGB-BIOZB-2305Für WB, zweiter Antikörper
Primärer Antikörper-Verdünnungspuffer für  Western BlotBeyotimeP0256Für die Verdünnung von Primärantikörpern
ReverTraAce qPCR RT KitTOYOBOFSQ-101Für die cDNA-Synthese
RNAiso PlusTaKaRa9109Für die RNA-Isolierung
RPMI 1640Gibco11875093Für die definitive Endodermbildung
MagermilchSangon BiotechA600669Für die Vorbereitung von Zweitantikörpern
SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742Für die RT-PCR-Analyse
Torin2MCEHY-13002Für die definitive Endodermbildung
TweenSigma-AldrichWXBB7485VFür die Vorbereitung von Waschpuffern

References

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