Bei Drosophiladurchläuft der Eizellkern während der Oogenese eine mikrotubuliabhängige Migration. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das entwickelt wurde, um die Migration durch Live-Bildgebung an Eierkammern ex-vivozu verfolgen. Unser Verfahren hält Eierkammern für 12 Stunden am Leben, um multipositionale 3D-Zeitrafferfilme mit konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie zu erfassen.
Die Bildgebung von Lebendzellen ist besonders notwendig, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu verstehen, die Organellenbewegungen, Zytoskelettumlagerungen oder Polaritätsmuster innerhalb der Zellen regulieren. Bei der Untersuchung der Positionierung des Eizellkerns sind Live-Imaging-Verfahren unerlässlich, um die dynamischen Ereignisse dieses Prozesses zu erfassen. Die Drosophila-Eizelle ist eine mehrzellige Struktur und ein ausgezeichnetes Modellsystem, um dieses Phänomen aufgrund ihrer Größe und Verfügbarkeit zahlreicher genetischer Werkzeuge zu untersuchen. Während der Drosophila-Mid-Oogenese wandert der Kern von einer zentralen Position innerhalb der Eizelle, um eine asymmetrische Position einzunehmen, die durch Mikrotubuli erzeugte Kräfte vermittelt wird. Diese Migration und Positionierung des Kerns sind notwendig, um die Polaritätsachsen des Embryos und der nachfolgenden erwachsenen Fliege zu bestimmen. Ein Merkmal dieser Migration ist, dass sie in drei Dimensionen (3D) stattfindet, was eine Notwendigkeit für Live-Imaging schafft. Um die Mechanismen zu untersuchen, die die Kernmigration regulieren, haben wir ein Protokoll entwickelt, um die sezierten Eierkammern zu kultivieren und Live-Bildgebung für 12 Stunden durch Zeitrafferaufnahmen mit konfokale Spinning-Disk-Mikroskopie durchzuführen. Insgesamt erlauben uns unsere Bedingungen, Drosophila-Eierkammern über einen langen Zeitraum am Leben zu erhalten, wodurch der Abschluss der Nuklearen Migration in einer Großen Anzahl von Proben in 3D visualisiert werden kann.
Seit einigen Jahren hat sich die Drosophila-Eizelle als Modellsystem zur Untersuchung der Kernmigration herauskristallisiert. Die Drosophila-Eizelle entwickelt sich in einer mehrzelligen Struktur, die als Eizelle bezeichnet wird. Eizellen umfassen 16 Keimzellen (15 Ammenzellen und die Eizelle), die von einer Epithelschicht aus follikulären somatischen Zellen umgeben sind. Die Entwicklung der Eikammer wurde in 14 Stadien unterteilt (Abbildung 1A), in denen die Eizelle wächst und Reserven ansammelt, die für die frühe Entwicklung des Embryos erforderlich sind. Während der Entwicklung, bei Mikrotubuli-Reorganisation und asym....
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1. Vorbereitung des Bildmediums
2. Vorbereitung der Beobachtungskammer
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Vor der Migration ist der Kern dynamisch und oszilliert um eine zentrale Position während einer Periode, die als Vormigration definiert ist. Diese kleinen Bewegungen spiegeln ein Gleichgewicht von Drücken und Ziehen wider, die das Gleichgewicht in der Mitte der Eizelle aufrechterhalten. Durch die Quantifizierung der Trajektorien der Kerne haben wir gezeigt, dass die APM- und LPM-Trajektorien ähnliche Anteile auf hatten. Wir definieren die Art der Flugbahn durch den ersten Kontakt zwischen dem Kern und der Plasmamembran
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Andere Protokolle beschreiben, wie Drosophila-Eierkammern ex vivo für den Live-Imaging-Assay vorbereitet und kultiviert werden12,13. Die Neuheit dieses Protokolls ist die Verwendung einer Bildgebungskammer, die aus einem ausgehöhlten Aluminiumschlitten, einem Abdeckrutsch und einerO2/ CO 2-permeablenMembran besteht. Der Hauptvorteil dieses Aufbaus besteht darin, die Bewegung in Z zu begrenzen, ohne Druck auf die Probe auszuüben. So .......
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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Wir sind Jean-Antoine Lepesant und Nicolas Tissot sehr dankbar, die ursprünglich das Protokoll entwickelt und einige grafische Elemente von Abbildung 3 mit uns geteilt haben. Wir danken Fanny Roland-Gosselin, die die Fotos von Abbildung 4 gemacht hat. Wir danken auch anderen Labormitgliedern für hilfreiche Diskussionen, die zur Verbesserung dieser Technik beigetragen haben, und Nathaniel Henneman für seine Kommentare, die zur Verbesserung dieses Manuskripts beigetragen haben. Wir erkennen die ImagoSeine-Kerneinrichtung des Instituts Jacques Monod, Mitglied von France-BioImaging (ANR-10-INBS-04), an. Maëlys Loh wird durch ein Promotionsstipendium des französischen Fors....
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anästhesie-CO2-Pad | Dutscher | 789060 | Anästhesiefliegen |
| Deckglas (24x50 mm) | Knittel Glass | VD12450Y100A | Vorbereitung der Beobachtungskammer |
| Pinzette Dumont #5 | Carl Roth | K342.1 | Dissektion |
| Edelstahlnadeln | Entosphinx | 20 | Dissektion |
| Hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum | SIGMA-ALDRICH | F7524 | Bildgebungsmedium |
| Insulinlösung Rinderpankreas | SIGMA-ALDRICH | 10516 - 5ml | Bildgebungsmedium |
| Penicilin/Streptomycin-Lösung | SIGMA-ALDRICH | P0781 | Bildgebungsmedium |
| Permeable Membran | Leica | 11521746 | Präparation für Beobachtungskammern |
| Schneider Medium | Pan Biotech | P04-91500 | Bildmedium |
| Silikonfett | BECKMAN COULTER | 335148 | Vorbereitung der Beobachtungskammer |
| Spinnscheibe konfokal | Zeiss | CSU-X1 | Beobachtung der Kernmigration |
| Voltalef Öl 10S | VWR | 24627 - 188 | Vorbereitung der Beobachtungskammer |
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